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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610931399.4 (22)申请日 2016.10.31 (71)申请人 珠海市银科医学工程股份有限公司 地址 519090 广东省珠海市金湾区红旗工 业园虹晖二路020号 (72)发明人 孙宜峰陈基平黄妙华曾冰冰 (74)专利代理机构 广州市红荔专利代理有限公 司 44214 代理人 王贤义何承鑫 (51)Int.Cl. C12N 1/02(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/32(2006.01) (54)发明名称 分枝杆菌快速分离。
2、培养方法 (57)摘要 本发明旨在提供一种步骤简单、 培养时间 短、 无需磨菌的分枝杆菌快速分离培养方法。 本 发明包括以下步骤：（1） 对分支杆菌待检标本进 行抗污染液化处理；（2） 取出冻干杂菌抑制剂， 加 入无菌稀释液后充分摇匀；（3） 取出液体培养基， 吸取混合均匀的杂菌抑制剂加入液体培养基， 充 分混合均匀；（4） 取步骤 （2） 处理后的标本溶液， 在无菌条件下接种于步骤 （3） 中的培养基里， 并 置于多通道磁力搅拌机上， 恒温37进行混悬培 养；（5） 用实时浊度分析仪检测， 实时记录液体培 养基的浊度值变化， 经过7-14天， 当检测到的麦 氏浊度值达到1.0或以上并呈现特殊。
3、的生长曲 线， 此培养可判断为阳性， 结束培养。 本发明可应 用于细菌培养技术领域。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 106635800 A 2017.05.10 CN 106635800 A 1.一种分枝杆菌快速分离培养方法， 其特征在于， 该方法是在分支杆菌培养基上进行 培养， 所述分支杆菌培养基包括液体培养基、 无菌稀释液和杂菌抑制剂， 所述液体培养基包 括基础培养基、 促生长剂、 抑菌剂和分散剂， 在所述分枝杆菌培养基内加入有磁力搅拌子， 该方法包括以下步骤： （1） 通过碱处理中和离心沉淀法对分支杆菌待检标本进行抗污染液化处理； （2） 取出冻干杂菌抑制剂， 加入无菌稀释。
4、液后充分摇匀； （3） 取出液体培养基， 恢复至室温， 吸取混合均匀的杂菌抑制剂加入液体培养基， 充分 混合均匀； （4） 取所述步骤 （2） 处理后的标本溶液， 在无菌条件下接种于所述步骤 （3） 中的培养基 里， 并置于多通道磁力搅拌机上， 恒温37全程进行混悬培养； （5） 用实时浊度分析仪检测， 实时记录液体培养基的浊度值变化， 经过7-14天时间培 养， 当检测到的麦氏浊度值达到1.0或以上并呈现特殊的生长曲线， 此培养可判断为阳性， 结束培养。 2.根据权利要求1所述的分支杆菌快速分离培养方法， 其特征在于： 所述无菌稀释液为 钾盐或钠盐的无菌溶液。 3.根据权利要求1所述的分支杆。
5、菌快速分离培养方法， 其特征在于： 所述杂菌抑制剂和 所述抑菌剂为含有至少一种抗生素的冻干制剂， 所述抗生素包括但不限于多粘菌素B、 两性 霉素B、 林可霉素、 甲氧苄啶和萘啶酸。 4.根据权利要求1所述的分支杆菌快速分离培养方法， 其特征在于： 所述分散剂为吐温 20或吐温80或曲拉通X-100。 5.根据权利要求1所述的分支杆菌快速分离培养方法， 其特征在于： 所述基础培养基包 括但不限于7H9干粉、 甘油和纯化水。 6.根据权利要求1所述的分支杆菌快速分离培养方法， 其特征在于： 所述促生长剂包括 但不限于葡萄糖、 氯化钠和过氧化氢酶。 权利要求书 1/1 页 2 CN 10663580。
6、0 A 2 分枝杆菌快速分离培养方法 技术领域 0001 本发明涉及细菌培养领域， 具体涉及一种分枝杆菌快速分离培养方法。 背景技术 0002 分枝杆菌属(Mycobacterium)是一类细长略弯曲的微生物， 有时有分枝或出现丝 状体。 目前在分类学上已将分枝杆菌属归纳于放线菌中。 对人致病的放线菌可分含和不含 分枝菌酸两类。 分枝杆菌可通过呼吸道、 消化道或皮肤损伤侵入易感机体， 引起多种组织器 官的结核病， 其中以通过呼吸道引起肺结核为最多。 结核病至今仍为重要的传染病。 据世界 卫生组织统计， 分枝杆菌每年引起全球约300万人死亡。 20世纪80年代后结核病的发病率曾 有所降低， 但近。
7、年其全球疫情又呈上升趋势， 而且由于分枝杆菌耐药性和多重耐药菌株的 出现， 结核病对某些国家已构成严重的健康威胁。 我国是世界上22个结核病高负担国家之 一， 我国三分之一左右的人口已感染了结核分枝杆菌， 受感染人数超过4亿。 我国现有肺结 核病人约500万， 主要集中在25岁及以上人群； 其中涂阳肺结核病人150万； 每年约有25万人 死于结核病， 死亡平均年龄为55.2岁。 据研究， 受结核菌感染的人群中， 10的人会发展为 结核病。 在临床上， 只有快速分离培养出结核分枝杆菌， 并对其进行培养药敏测试， 才能进 一步找到对结核分枝杆菌有效的药物， 因此要求提高结核分枝杆菌的分离培养的速度。
8、， 并 且要求尽量避免培养过程中存在的杂菌污染问题。 0003 目前结核病的实验室诊断已经发展到基因研究的水平， 国际上也有许多先进的技 术应用于临床实验室， 但固体培养法及表型药敏仍然是目前结核病诊断领域的金标准。 长 期以来我国大部分的各级实验室一直采用罗氏固体培养基进行培养， 但其培养时间需要一 个月以上。 进行表型药敏检测前需要获得分枝杆菌的分离培养菌落， 而罗氏固体培养基培 养出分枝杆菌阳性培养物均为成团结块生长， 在做药敏之前必须磨菌， 将成团的分枝杆菌 打磨分散均匀才能进行下一步药敏实验， 存在生物安全风险高、 劳动强度大、 耗时耗力的难 题。 因此迫切需要一种快速培养分枝杆菌以。
9、及简单的操作方法用于对接后期的分枝杆菌药 敏检测。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足， 提供一种步骤简单、 培养时 间短、 无需磨菌的分枝杆菌快速分离培养方法。 0005 本发明方法所采用的技术方案是， 该方法是在分支杆菌培养基上进行培养， 所述 分支杆菌培养基包括液体培养基、 无菌稀释液和杂菌抑制剂， 所述液体培养基包括基础培 养基、 促生长剂、 抑菌剂和分散剂， 在所述分枝杆菌培养基内加入有磁力搅拌子， 该方法包 括以下步骤： （1） 通过碱处理中和离心沉淀法对分支杆菌待检标本进行抗污染液化处理； （2） 取出冻干杂菌抑制剂， 加入无菌稀释液后充分摇匀； （。
10、3） 取出液体培养基， 恢复至室温， 吸取混合均匀的杂菌抑制剂加入液体培养基， 充分 说明书 1/3 页 3 CN 106635800 A 3 混合均匀； （4） 取所述步骤 （2） 处理后的标本溶液， 在无菌条件下接种于所述步骤 （3） 中的培养基 里， 并置于多通道磁力搅拌机上， 恒温37全程进行混悬培养； （5） 用实时浊度分析仪检测， 实时记录液体培养基的浊度值变化， 经过7-14天时间培 养， 当检测到的麦氏浊度值达到1.0或以上并呈现特殊的生长曲线， 此培养可判断为阳性， 结束培养。 0006 进一步地， 所述无菌稀释液为钾盐或钠盐的无菌溶液。 0007 另进一步地， 所述杂菌抑制。
11、剂和所述抑菌剂为含有至少一种抗生素的冻干制剂， 所述抗生素包括但不限于多粘菌素B、 两性霉素B、 林可霉素、 甲氧苄啶和萘啶酸。 0008 再进一步地， 所述分散剂为吐温20或吐温80或曲拉通X-100。 0009 又再进一步地， 所述基础培养基包括但不限于7H9干粉、 甘油和纯化水。 0010 再又进一步地， 所述促生长剂包括但不限于葡萄糖、 氯化钠和过氧化氢酶。 0011 本发明的有益效果是： 本发明中， 分枝杆菌培养基由磁力搅拌子和液体培养基两 部分组成， 液体部分由基础培养基、 促生长剂、 抑菌剂和分散剂组成。 该培养基既能选择性 地促进分枝杆菌的快速生长， 又能抑制其它杂菌生长， 分。
12、枝杆菌在液体培养基里经磁力搅 拌子的旋转培养， 在液体培养基中形成一定的浊度， 麦氏浊度值达到1.0或以上之后的分枝 杆菌液体培养基， 可以直接进行下一步的药敏测试。 本发明采用的液体培养基提供分枝杆 菌快速生长所需的营养缩短培养耗时， 利用培养基内特殊的分散剂及混悬培养的方式避免 分枝杆菌成团生长， 阳性培养物无需磨菌即可对接药敏实验； 分枝杆菌液体培养基7-14天 即可获得阳性培养结果， 比传统的固体罗氏培养检测时间大大缩短， 阳性培养物无需磨菌 直接对接药敏实验， 具有耗时短、 生物安全性高、 省时省力的优点， 具有良好的推广应用前 景， 适合在我国各级结核病专业收治机构推广使用。 附图。
13、说明 0012 图1是结核分枝杆菌浊度变化曲线图。 具体实施方式 0013 本发明方法是在分支杆菌培养基上进行培养， 所述分支杆菌培养基包括液体培养 基、 无菌稀释液和杂菌抑制剂， 所述液体培养基包括基础培养基、 促生长剂、 抑菌剂和分散 剂， 在所述分枝杆菌培养基内加入有磁力搅拌子。 其中， 所述杂菌抑制剂或抑菌剂为含有至 少一种抗生素的冻干制剂， 所述抗生素为多粘菌素B、 两性霉素B、 林可霉素、 甲氧苄啶和萘 啶酸， 或其它。 所述分散剂选自吐温20或吐温80或曲拉通X-100。 所述基础培养基包括7H9干 粉、 甘油和纯化水。 所述促生长剂包括葡萄糖、 氯化钠和过氧化氢酶， 也可选择其。
14、它促生长 剂。 在本实施例中， 将基础培养基、 促生长剂、 抑菌剂按照900： 100： 1的比例混合均匀后， 用 玻璃螺口瓶 （内含磁力搅拌子1个） 灌装为6ml/支， 共20支/盒。 无菌稀释液为3ml/支的钾盐、 钠盐无菌溶液， 用防盗滴瓶灌装， 1支/盒。 杂菌抑制剂为多粘菌素B、 两性霉素B等抗生素的 冻干制剂， 将多粘菌素B、 两性霉素B等抗生素的混合药液通过真空冷冻干燥工艺制得， 1支/ 盒。 0014 本发明方法包括以下步骤： 说明书 2/3 页 4 CN 106635800 A 4 （1） 参照 结核病诊断实验室检验规程 中的碱处理中和离心沉淀法对分支杆菌待检标 本进行抗污染。
15、液化处理。 0015 （2） 取出冻干杂菌抑制剂， 旋开瓶盖， 加入无菌稀释液后充分摇匀。 0016 （3） 取出液体培养基， 恢复至室温， 吸取混合均匀的杂菌抑制剂加入液体培养基， 充分混合均匀。 0017 （4） 取所述步骤 （2） 处理后的标本溶液0.1ml， 在无菌条件下接种于所述步骤 （3） 中 的培养基里， 并置于多通道磁力搅拌机上， 设置好转速， 转速范围为80转/分钟100转/分 钟， 恒温37全程进行混悬培养。 其中的多通道磁力搅拌机选自由赛洛捷克提供的型号为 MS-H-S10的磁力搅拌机。 0018 （5） 如图1所示的是结核分枝杆菌浊度变化曲线图。 用实时浊度分析仪检测，。
16、 实时 记录液体培养基的浊度值变化， 经过7-14天时间培养， 当检测到的麦氏浊度值达到1.0或以 上并呈现特殊的生长曲线， 此培养可判断为阳性， 结束培养。 进行下一步的微孔板的药敏测 试结果。 0019 采用分枝杆菌液体培养基进行分枝杆菌分离培养报阳后的菌液进行药敏测试按 以下步骤进行： （a） 将混悬液体培养后阳性菌稀释至1.0麦氏浊度， 直接接种于药敏罗氏培养基或分枝 杆菌药敏液体培养基中， 按各自的说明书要求进行操作。 0020 （b） 剩余的混悬液体培养后阳性菌， 可继续保留培养7天左右的时间作为菌种保存 等其他用处， 或者直接高压灭菌处理。 0021 本发明用于解决当前分枝杆菌固体分离培养及传统罗氏药敏检测报阳时间长的 问题， 并且解决分枝杆菌药敏实验前的繁琐的磨菌问题， 解决磨菌过程中存在的生物安全 风险高、 劳动强度大以及耗时耗力的问题。 0022 本发明可应用于细菌培养技术领域。 说明书 3/3 页 5 CN 106635800 A 5 图1 说明书附图 1/1 页 6 CN 106635800 A 6 。