技术领域
本发明涉及一种从植物中分离的启动子，尤其涉及从水稻中分离的雄蕊、浆片特异表达启动子，本发明还涉及含有该雄蕊、浆片特异表达启动子的重组表达载体、宿主细胞以及在改良植物性状、培育植物新品种等方面的应用，属于植物组织或器官特异性表达启动子的分离及其应用领域。
背景技术
随着遗传转化技术的发展，基因工程已经成为基因功能研究和作物遗传改良的一项重要手段。启动子作为基因工程中表达载体的一个重要组成部分，它的选择与应用决定了目的基因在时间和空间上的表达不同。因此，克隆并深入研究启动子的结构对于理解基因在转录水平的调控机制有着较大帮助，同时也可以为基因工程中调控目的基因表达提供有利的工具。
早期关于禾本科启动子的研究主要集中在组成型启动子的功能及应用方面，比如玉米的Ubiquitin启动子、水稻Actin1启动子以及OsCc1启动子。但是组成型启动子这种驱动外源基因在各组织中持续恒定的表达模式可能会引起水稻发育迟缓、产量减少或者转基因沉默(Mourrain et al.,2007)以及一些食品安全性等方面的担忧等问题(Conner et al,.2003)。因此，越来越多的科学家开始关注组织特异型启动子的研究与应用，进而达到改良水稻相应性状的目的(姚秋林和林拥军，2011)。组织特异型启动子能将外源基因限定在特定的组织或器官进行表达，而且多受到发育阶段的调节。这样的特性使得组织特异型启动子不仅可以提高外源基因在特定部位的表达浓度，增强转基因的效果，而且同时还能减少异源基因表达产物对植物发育的影响，降低植物耗能。
水稻是我国乃至世界的主要粮食作物。水稻作为模式单子叶植物，是单子叶植物花器官研究的主要对象，水稻的颖花由1个外稃、一个内稃，2个浆片、6枚雄蕊和一个雌蕊组成。而水稻植物花器官的发育形成过程需要许多基因的协同表达，同时还涉及到一系列生化变化和组织器官的分化，在基因工程中有望可以利用这一类启动子，尤其雄蕊和浆片特异表达启动子创造雄性不育系。Gomez等从豌豆中分离得到一个花药特异表达基因END1的启动子，将其融合GUS基因后转化到番茄、烟草和拟南芥中，分别验证转基因材料发现END1启动子可以在这几种植物中维持花药特异表达的模式(Gomez et al.,2004)。研究人员对来源于百合的LGC1基因启动子进行了克隆，经验证发现该启动子在雄配子细胞中特异表达，在研究花药发生和受精作用中将会是一个有用的工具(Singh et al.,2003)。随着分子生物学和发育生物学的发展，对花器官特异表达启动子，尤其是对雄蕊和浆片特异表达启动子的研究和开发具有十分重要的科学理论价值和潜在的商业价值(如雄性不育、育种等)。
水稻作为非常重要的粮食作物之一，亦是功能基因组学研究的模式植物。但是目前人们所得到的水稻的组织特异性启动子的数量和种类都并不多，难以满足当前科研和生产的强烈需求，而且从就发明人基于现有报道的了解来看，人们尚且没有开发出能够在水稻的雄蕊和浆片中特异性表达的启动子。即便现有技术中有人分离出了一两种雄蕊和浆片特异性启动子，由于雄蕊和浆片是水稻生长发育中非常重要的两个部分，人们还是希望能够获得更多针对雄蕊和浆片的特异性启动子。
发明内容
本发明的目的是提供一种驱动外源基因在雄蕊、浆片部位特异表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。本发明从水稻中分离克隆出雄蕊和浆片特异表达启动子STA4，为转基因水稻育种服务，同时有利于提高转基因作物的安全性，并为长远的启动子改造和设计储备资源。
具体而言，本发明提供一种水稻雄蕊和浆片表达启动子，其特征在于，所述水稻雄蕊和浆片表达启动子包含：
(a)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列；或者
(b)SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列；或者
(c)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(d)在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(e)与SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；或者
(f)与SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；或者
(g)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(h)在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(i)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(j)SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(k)与带有SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列；或者
(l)与带有SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列。
进一步地，所述启动子分离自日本晴水稻的成熟种子，分离所采用的扩增引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。
此外，本发明还给出了一种DNA构建体，其特征是，所述DNA构建体包含所述的启动子。
此外，本发明还给出了包含所述的启动子或所述的DNA构建体的植物表达盒。
此外，本发明还给出了包含所述的启动子或所述的DNA构建体的重组表达载体。
在所述重组表达载体中，所述启动子连接于待表达基因上游，所述待表达基因具有调控雄蕊以使其不育的功能。植物双元表达载体可以为pCAMBIA1391。通过该载体获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。本发明对获得的转基因水稻进行GUS表达定量检测发现，转基因植株在雄蕊、浆片部位上的Gus基因表达水平提高，从而证明该2898bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻雄蕊、浆片部位特异表达。
此外，本发明还给出了包含所述启动子或所述DNA构建体的宿主菌或转化子。
此外，本发明还给出了一种所述的植物雄蕊和浆片表达启动子在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述的植物雄蕊和浆片表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
换言之，本发明的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆STA4基因上游包括转录起始位点在内的2898bp的DNA序列，并将其命名为STA4(序列表中的SEQ ID No:1)。该启动子可以应用在单子叶植物中，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。
所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。
需要说明的是：SEQ ID No：1和SEQ ID No：2中的启动子均为本申请的发明人获自日本晴水稻的启动子，只是SEQ ID No：1中的核苷酸包含了引物的留存部分，即“GCTTTGCTCTCTCTTTTCATTT”和“TAAGCTACAAATTTCAGTTCAT”(后者与反向引物的相应序列互补)。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列，其为启动子的主要部分。
技术效果
本发明所克隆的启动子STA4能够调控基因在植株中集中表达，其可以与所需的靶标基因连接，用于对各种单子叶植物进行外源基因在雄蕊和浆片中表达的调节和控制，提高外源靶标基因在植物雄蕊和浆片中的表达量，增加转基因的效果。研究人员可以通过该启动子对农作物品种进行基因改造，提高和改善水稻的生长特性和机制，尤其是与雄蕊和浆片相关的生长特性，而不会影响根、茎、叶等其他部位的任何性状，降低生物代谢成本。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为将STA4启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中A为pCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-STA4示意图，其中示出了利用STA4启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；
图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。
图3为利用STA4启动子驱动Gus基因表达的结果示意图。
图中所示即STA4：：gus转基因水稻植株各部位Gus染色结果，其中a表示根，b表示茎，c表示叶，d表示叶鞘，e表示花；GUS染色在转基因植株的雄蕊和浆片部位明显表达。(标尺＝1cm)。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
本发明利用日本晴成熟种子(由安徽省农科院水稻所生技室保存)来来分离启动子片段。
下面对实施例中所用的主要药材原料、试剂材料等进行简单说明，原料、试剂如无特殊说明，均为市售购买产品。
次氯酸钠(NaClO，有效氯浓度4％)，Tween20购自Sigma公司。潮霉素B购自Roche公司；PEASY-Tsimple和DNA marker-Trans2K购自Transgen公司；限制性内切酶购自NEB公司；KOD高保真聚合酶和定量PCR试剂盒购自大连TaKaRa宝生物技术有限公司；T4DNA连接酶购自Promega公司；DNA片段回收试剂盒购自TIANGEN公司；质粒DNA提取采用Axygen质粒小提试剂盒。引物合成和测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。缓冲液、试剂、细菌培养基配方、大肠杆菌感受态制备参见《分子克隆实验指南》(第三版)。
本发明所采用的大肠杆菌菌株为XL1-blue；根瘤农杆菌为EHA105，安徽省农科院水稻所生物技术室保存；植物表达载体pCAMBIA1391购自澳大利亚CAMBIA公司。
下面集中对引物的设计以及启动子的获取过程进行详细说明
根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻STA4基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带BamHI，酶切位点(GGATCC)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带EcoRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：
FP：GGATCCGCTTTGCTCTCTCTTTTCATTT BamHI
RP：GAATTCATGAACTGAAATTTGTAGCTTA EcoRI
由深圳华大基因公司合成。
启动子STA4的获得
以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子STA4，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个从95℃预变性到72℃延伸的循环；最后72℃延伸10min。回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2898bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌。感受态细胞激活后，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，质粒提取方法如下：
用AXYGEN质粒DNA小量试剂盒提取相应的质粒，具体操作方法如下：第一次使用时，将试剂盒携带的RNaseA全部加入到Buffer S1中，混匀，4℃贮存。
(1)取约4mL过夜培养的菌液(菌液过浓时体积应减半或更少)，12,000×g离心30s，弃尽上清。
(2)加250μl Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小菌块。
(3)加250μl Buffer S2，缓慢地上下翻转4-6次，混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min。
(4)加350μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12,000×g离心10min。
(5)吸取步骤4中的上清并转移到吸附柱(置于2mL离心管中)，室温静止2min，12,000×g离心1min，弃滤液。
(6)将吸附柱放回离心管，加500μl Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。
(7)将吸附柱放回离心管，加700μl Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液；以同样的方法再用500μl Buffer W2洗涤一次。弃滤液。
(8)将吸附柱置回2mL离心管中，12,000×g离心2min。
(9)将吸附柱移入新的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在吸附柱膜中央加60μl去离子水(65℃预热)，室温静置2min。12,000×g离心1min。将洗脱下来的溶液重新加到吸附膜的中央，复洗一次。
提取质粒后再用BamHI和EcoRI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子STA4，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。
植物表达载体的构建
从上面“启动子STA4的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用BamHI和EcoRI双酶切，回收启动子STA4片段。同时利用BamHI和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的STA4片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子STA4与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-STA4(图1B)，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，从冻融法所得产物中提取阳性质粒，用BamHI和EcoRI进行酶切验证，即质粒DNA用限制性内切酶消化。电泳观察酶切片段的位置和大小，以判断所鉴定的质粒是否有外源片段插入以及插入片段的大小。酶切反应体系为20μl，组分如下：
上述各组分混匀后，置37℃反应2-4h，电泳观察酶切结果。
应用：农杆菌介导的水稻遗传转化
(1)愈伤组织诱导消毒后的种子用无菌水在30℃黑暗条件下浸泡过夜，用解剖刀将胚剥下置于诱导培养基上。每皿(规格为100×25mm的一次性塑料培养皿，内含50mL诱导培养基)均匀放置12个胚，在30℃黑暗条件下放置2～3周诱导愈伤组织，至长出淡黄色颗粒状愈伤。
(2)预培养从诱导培养基上挑选颗粒状、不带病斑的愈伤组织置于新的诱导培养基上，于30℃黑暗条件下培养3～5d。
(3)侵染及共培养将预培养的愈伤组织转移至50mL无菌管中，加入表达载体的农杆菌菌液浸泡20min，倒出菌液，并用无菌滤纸将残余菌液吸干。后将愈伤均匀撒在共培养培养基上，于23℃黑暗条件下培养2～3d。
(4)恢复将共培养的愈伤转移至恢复培养基上(愈伤之间尽量避免重叠)。23℃黑暗培养3～5d。
(5)筛选从筛选培养基上挑选不带菌斑颜色鲜亮呈淡黄色颗粒状的抗性胚性愈伤组织，每皿30粒接种于筛选培养基，30℃黑暗培养2～3周，至长出新的抗性颗粒状愈伤。
(6)分化每一转化事件(筛选时由一粒愈伤组织繁殖产生的所有愈伤组织)挑选三个独立的胚性愈伤到分化培养基某一区域，30℃光照培养室(16h光照/8h黑暗)条件下培养3～4周，待幼苗长出。
(7)生根每一区域挑选两棵健壮的幼苗移栽至生根培养基，30℃组织培养室光周期(16h光照/8h黑暗)培养三周左右，进行鉴定并移栽至田间。
结果鉴定
GUS能与显色底物X-gluc反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性的研究GUS的表达水平和表达模式。
(1)GUS染色底物的配制
50ml 0.5M磷酸缓冲液(pH7.0)，50ul100mM铁氰化钾K3Fe(CN)6(将3.2924g铁氰化钾溶于水，定容至100ml，4℃保存)，50ul100mM亚铁氰化钾K4〔Fe(CN)6〕.3H2O(将4.2239亚铁氰化钾溶于水，定容至100ml，4℃保存)。1ml0.5MEDTA，250ul1mmg/mlX-Gluc(用二甲基甲酰胺溶解，-20℃避光保存，呈紫红色)。
(2)染色步骤
①染色：将待测样品浸到GUS染液中，37℃保温箱中放置24h-36h。
②脱色：加入100％乙醇浸泡直至完全脱色。可用含有30％甘油和70％乙醇的溶液保存。
③在显微镜下拍照记录。
按上述方法进行Gus染色，结果如图3所示，即STA4：：gus转基因水稻植株各部位Gus染色结果，其中a表示根，b表示茎，c表示叶，d表示叶鞘，e表示花；GUS染色在转基因植株的雄蕊、浆片部位明显表达。(标尺＝1cm)。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。