本申请要求2013年7月19日提交的美国临时申请号61/856,442 的权益，该美国临时申请的公开内容是以全文引用的方式并入本文中。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在政府资助下根据国家卫生研究院(NIH)授权号 HHSN2662007000008C、NIH授权号T32GM068411和NIH授权号 T32GM07356来进行。政府享有本发明的某些权利。
背景
流感是以轻度至重度疾病为标志且在一些情况下甚至以死亡为 标志的严重公共卫生问题。目前的活减毒流感疫苗(LAIV)的减毒程度 不足以施用于2岁以下的儿童、孕妇、免疫性受损人士或处在流感并 发症的高风险之下的人士。然而，这些人群处在流感并发症的高风险 之下。
发明概要
本文中提供了一种经修饰的甲型流感病毒，其包含在氨基酸310 至325中具有一个或多个突变的PB1聚合酶。还提供了一种编码甲 型流感病毒的PB1聚合酶的重组核酸，其中所述核酸编码在氨基酸 310至325中具有一个或多个突变的PB1聚合酶。还提供了包含本文 中所描述的任何甲型流感病毒或包含本文中所描述的任何编码PB1 聚合酶的核酸的细胞群体。聚合酶突变产生温度敏感性病毒，其中所 述病毒具有从约37℃至约39℃(即，在体温下)减缓的生长。这种减缓 的生长潜力在用于诱导免疫反应时有利于提高病毒的安全性。
还提供了一种用于在受试者中引发针对流感病毒的免疫反应的 方法，其包括施用有效剂量的本文中所描述的经修饰的甲型流感病毒 和药学上可接受的载体。
还提供了一种用于在受试者中治疗或预防流感感染的方法，其包 括向已受流感感染或易受流感感染的受试者施用有效剂量的如本文 中所描述的经修饰的甲型流感病毒和药学上可接受的载体。
还提供了一种产生本文中所描述的甲型流感病毒的方法，其包括 (a)用一个或多个包含以下各项的载体转染宿主细胞群体：i)编码甲型 流感病毒的内部基因组节段的核酸序列；和ii)编码在氨基酸310至 325中具有一个或多个突变的PB1聚合酶的核酸；(b)培养所述宿主 细胞；和(c)回收经修饰的甲型流感病毒。
还提供了一种用于产生流感免疫原的方法，其包括：(a)用本文中 所描述的任何甲型流感病毒感染细胞群体；(b)培养所述细胞；(c)从步 骤(b)的培养物中收集所述病毒；和(d)用所收集的病毒制备免疫原。
附图描述
图1示出了对在37℃下具有温度敏感性的PB2单基因置换病毒 的鉴定。用单基因置换病毒以0.01的感染复数(MOI)将MDCK细胞 感染1h，其中PB2来自于冷传代A/AnnArbor/6/60，并且所有其他基 因都来自于季节性病毒株A/Korea/82。用含镁和钙的杜尔贝科氏磷酸 盐缓冲生理盐水(PBS)(Invitrogen)将细胞洗涤一次，然后在34℃、37℃ 或39℃下在含有0.15％牛血清白蛋白(BSA)和1μg/ml甲苯磺酰基磺 酰基苯基丙氨酰基氯甲基酮(TPCK)-胰蛋白酶的DMEM中培养。在 所指示的时间点，收集并置换10％培养物上清液，并且通过TCID-50 测量来测定病毒效价。
图2示出了PB1319Q突变显著降低人类甲型流感病毒RNA聚 合酶在37℃下的功能活性。在人类HEK-293FT细胞中通过定量在经 PB1、PB2、PA和NP蛋白表达质粒以及表达流感病毒样RNA构建 体的报告质粒转染的细胞的澄清细胞溶解产物中对萤火虫荧光素酶 的荧光素酶活性来表征所指示的聚合酶的聚合酶活性。在所指示的温 度下孵育细胞。所有测定都利用相同的NP质粒。描绘了萤火虫发光 与海肾发光之比。数据是最少三个独立实验的平均值。误差线表示一 个平均标准误差。这一小基因组测定中所使用的所有质粒都相同，但 在残基319处编码Q的PB1质粒(如所指示)除外。这些质粒是通过 将共有序列从病毒生长曲线克隆到哺乳动物pCAGGS表达载体中而 由病毒母液产生。
图3示出了PB1L319Q突变显著降低禽甲型流感病毒RNA聚 合酶在37℃下的功能活性。在人类HEK-293FT细胞中通过在经PB 1、PB2、PA和NP蛋白表达质粒以及表达流感病毒样RNA构建体的 报告质粒转染的细胞的澄清细胞溶解产物中定量对萤火虫荧光素酶 的荧光素酶活性来表征各病毒聚合酶的聚合酶活性。在所指示的温度 下孵育细胞。描绘了萤火虫发光与海肾发光之比。数据是最少3个独 立实验的平均值。误差线表示一个平均标准误差。在这个实验中，所 有聚合酶基因节段都来源于禽流感病毒。PA和PB2节段来源于A/C alifornia/04/09H1N1，并且PB1和NP节段来源于A/Chicken/Nancha ng/3H3N2。质粒仅在所指示的残基处不同：(1)编码265S或265N的 PB2[野生型]；(2)编码319Q或319L的PB2[野生型]。
图4示出了PB1中的319Q突变与LAIVPB1中所存在的三个突 变的组合的效应。
图5示出了PB1中的319Q突变与LAIVPB1中所存在的四个突 变的组合的效应。
图6示出了PB1的319位上的突变的稳定性。
发明描述
本文中提供了一种经修饰的甲型流感病毒，其包含在氨基酸310 至325中具有一个或多个突变的PB1聚合酶。PB1聚合酶的氨基酸 310至325在本文中阐述为NENQNPRMFLAMITYI(SEQIDNO:1)。
如全文所使用，任何甲型流感病毒都可以经修饰以包含在氨基酸 310至325中具有一个或多个突变的PB1聚合酶。举例来说，甲型流 感病毒可以选自H2N2病毒、H3N2病毒、H1N1病毒、H9N2病毒和 H5N1病毒。任选地，甲型流感病毒可以选自A/AnnArbor/6/60、A/ California/04/2009、A/Wisconsin/22/2011和A/Quail/HongKong/G1/9 7。甲型流感病毒还可以是禽甲型流感病毒。这些病毒包括但不限于 A/Chicken/Nanchang/3-120/01H3N2、A/HongKong/485/1997(H5N1)、 A/Anhui/1/2013(H7N9)和A/Shanghai/1/2013(H7N9)。
还涵盖包含来自于一种或多种甲型流感病毒的一个或多个基因 组节段的重排甲型流感病毒。更具体来说，所述病毒包括来源于多于 一种亲本病毒株或来源的基因和/或多肽组分。举例来说，7:1重排病 毒包括7个来源于第一亲本病毒的病毒基因组节段(或基因节段)和单 个来自于第二亲本病毒的例如编码血凝素或神经氨酸酶的互补病毒 基因组节段。6:2重排病毒包括6个来自于第一亲本病毒的基因组节 段，最常见为6个内部基因，和两个来自于不同的亲本病毒的互补节 段，例如血凝素和神经氨酸酶。任选地，重排病毒是通过引入包括由 于其在疫苗生产方面的良好性质而选择的病毒株的六个内部基因与 编码所选择的例如病原性病毒株的表面抗原的基因组节段(HA和NA) 的组合的载体来产生。举例来说，HA节段可以选自H1、H3或B病 毒株，如同常规情况下进行疫苗生产时。类似地，HA节段可以选自 其他病原性病毒株，诸如H2病毒株(例如H2N2)、H5病毒株(例如 H5N1)、H7病毒株(例如H7N7)或H9病毒株(H9N2)。在某些经修饰 的病毒中，内部基因节段来源于甲型流感病毒/AnnArbor/6/60病毒株。
如本文中所阐述，修饰包括但不限于PB1聚合酶的氨基酸序列 中的突变。任选地，PB1聚合酶中的一个或多个突变是非天然存在的， 并且是通过人类干预(例如，通过对所克隆的DNA序列进行突变诱发) 而产生，诸如诱导的点突变、缺失、插入和取代突变体。氨基酸序列 突变典型地属于以下三个类别中的一个或多个：取代突变、插入突变 或缺失突变。插入包括氨基和/或羧基末端融合以及单个或多个氨基 酸残基的序列内插入。插入一般将为比氨基或羧基末端融合小的插入， 例如大约一至四个残基。缺失是以从蛋白质序列中去除一个或多个氨 基酸残基为特征。典型地，在蛋白质分子内的任何一个位点上缺失不 超过约2至约6个残基。氨基酸取代典型地是单个残基的取代，但可 能一次性在多个不同的位置发生，例如在如SEQIDNO:1所阐述的 多肽序列的一、二、三、四、五、六、七或更多个氨基酸上；插入通 常将是大概约1至10个氨基酸残基；且缺失将介于约1至10个残基 的范围内。缺失或插入优选地在相邻的对中进行，即，缺失2个残基 或插入2个残基。取代、缺失、插入或其任何组合可以组合以得到最 终构建体。突变不能将序列置于阅读框之外，并且优选地不会形成可 能产生二级mRNA结构的互补区。取代修饰是其中至少一个残基已 经被去除并且在其位置上插入一个不同的残基的那些修饰。这样的取 代可以根据以下表1来进行，并且被称为保守取代。
表1：氨基酸取代
氨基酸取代未必是保守的，因为还可以进行能改变特定氨基酸的 侧链长度、疏水性或极性的氨基酸取代，以改变温度敏感性和/或增加 病毒的减毒。
在本文中所描述的PB1聚合酶中，氨基酸310至325中的一个 或多个突变可以选自319位上亮氨酸至谷氨酰胺的取代(L319Q)、310 位上天冬酰胺至缬氨酸的取代(N310V)、312位上天冬酰胺至缬氨酸 的取代(N312V)、313位上谷氨酰胺至亮氨酸的取代(Q313L)、314位 上天冬酰胺至缬氨酸的取代(N314V)、318位上苯丙氨酸至酪氨酸的 取代(F318Y)、319位上亮氨酸至谷氨酰胺的取代(L319Q)、320位上 丙氨酸至苏氨酸的取代(A320T)、321位上异亮氨酸至谷氨酰胺的取 代(I321Q)、323位上苏氨酸至丙氨酸的取代(T323A)、324位上酪氨酸 至苯丙氨酸的取代(Y324F)和325位上异亮氨酸至谷氨酰胺的取代 (I325Q)。
应理解，SEQIDNO:1是PB1聚合酶的氨基酸310至325的一 个实例。任何PB1聚合酶中氨基酸310至325的与SEQIDNO:1具 有至少约80％、85％、90％或95％同一性的序列还可以如本文中所阐 述加以修饰。本领域技术人员容易理解如何测定两个多肽或核酸的同 一性。举例来说，可以在将两个序列对准以使得同一性处在其最高水 平之后计算同一性。计算同一性的另一种途径可以通过公开的算法来 进行。比较用最佳序列比对可以使用Smith和WatermanAdv.Appl. Math.2:482(1981)的算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol. 48:443(1970)的比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.85:2444(1988)的相似性搜索法、通过这些算法的计算机实 施(威斯康辛遗传学软件包(WisconsinGeneticsSoftwarePackage) (GeneticsComputerGroup，575ScienceDr.,Madison，WI)中的GAP、 BESTFIT、FASTA和TFASTA)、可得自国家生物技术信息中心的 Tatusova和MaddenFEMSMicrobiol.Lett.174:247-250(1999)的 BLAST算法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html)或通过 观测来进行。
本文中所描述的任何经修饰的甲型流感病毒的PB1聚合酶可以 任选地包含选自391位上赖氨酸至谷氨酸的取代(K391E)、581位上 谷氨酸至甘氨酸的取代(E581G)和661位上丙氨酸至苏氨酸的取代 (A661T)的一个或多个突变。
本文中所描述的任何甲型流感病毒，包括如以上所描述在PB1聚 合酶中具有一个或多个突变的那些，可以进一步包含有包含265位上 天冬酰胺至丝氨酸的取代(N265S)的PB2聚合酶。此外，所描述的任 何甲型流感病毒可以进一步包含有包含35位上天冬氨酸至甘氨酸的 取代(D35G)的流感病毒核蛋白(NP)。
修饰，包括本文中所公开的特定氨基酸取代，是通过已知的方法 来进行。举例来说，修饰是通过对编码所述多肽的DNA中的核苷酸 进行位点特异性突变诱发，从而产生编码所述修饰的DNA且此后在 重组细胞培养物中表达所述DNA来进行。用于在具有已知序列的 DNA中的预定位点进行取代突变的技术是众所周知的，例如M13引 物突变诱发和PCR突变诱发。
如全文所使用，PB1聚合酶可以是任何甲型流感病毒PB1聚合 酶，包括但不限于A/AnnArbor/6/60H2N2PB1聚合酶(GenBank登记 号AY210012.1)(SEQIDNO:2)、A/California/04/2009H1N1PB1聚合 酶(GenBank登记号GQ377049.1)(SEQIDNO:3)、H3N2 A/Wisconsin/22/2011PB1聚合酶(GenBank登记号KC883051.1)(SEQ IDNO:4)以及A/Quail/HongKong/G1/97H9N2和H5N1PB1聚合酶 (GenBank登记号AF156421.1)(SEQIDNO:5)。任选地，GenBank登 记号AY210012.1(SEQIDNO:6)下所阐述的核酸序列，也称为编码 主供体病毒(MDV)PB1的核酸序列，可以包含选自A99G、A1171G、 G1371T、A1742G、G1981A和C1995T的一个或多个突变。任选地， 来自于A/AnnArbor/6/60的PB1核酸序列包含A99G、A1171G、 G1371T、A1742G、G1981A和C1995T。
如全文所使用，PB2聚合酶可以是任何甲型流感病毒PB2聚合 酶，包括但不限于A/AnnArbor/6/60H2N2PB2聚合酶(GenBank登记 号AY209938)(SEQIDNO:7)、A/Quail/HongKong/G1/97H2N2PB2 聚合酶(GenBank登记号AF156435)(SEQIDNO:8)、 A/Shanghai/02/2013H7N9PB2聚合酶(GenBank登记号KF021594) (SEQIDNO:9)或A/Chicken/Nanchang/3-120/2001H3N2PB2聚合酶 (GenBank登记号AY180761)(SEQIDNO:10)。
还提供了编码甲型流感病毒的PB1聚合酶的重组核酸，其中所 述核酸编码在氨基酸310至325中具有一个或多个突变的PB1聚合 酶。举例来说，本文中提供了编码包含319位上亮氨酸至谷氨酰胺的 取代(L319Q)的PB1聚合酶的核酸。还提供了编码包含319位上亮氨 酸至谷氨酰胺的取代(L319Q)和选自391位上赖氨酸至谷氨酸的取代 (K391E)、581位上谷氨酸至甘氨酸的取代(E581G)和661位上丙氨酸 至苏氨酸的取代(A661T)的一个或多个突变的PB1聚合酶的核酸。还 提供了编码具有一个或多个突变的PB1和PB2聚合酶的核酸以及包 含编码具有一个或多个突变的PB1和PB2聚合酶的核酸的组合物。
如全文所使用，术语重组意指物质(例如核酸或蛋白质)已经通过 人类干预而进行人工或合成(非天然)改变。应理解，当提到病毒，例 如甲型流感病毒时，所述病毒在其是通过表达重组核酸而产生时是重 组的。
如本文中所使用，核酸是指可以是DNA或RNA的单股或多股 分子或其任何组合，包括对那些核酸的修饰。举例来说，核酸可以是 cDNA。核酸可以表示编码股或其补体或其任何组合。核酸可以直接 克隆到适当的载体中，或在需要时可以经修饰以有助于后续克隆步骤。 这样的修饰步骤是常规的，其实例是将含有限制位点的寡核苷酸连接 子加到核酸的末端。一般方法阐述于Sambrook等(2001)Molecular Cloning-ALaboratoryManual(第3版)第1-3卷,ColdSpringHarbor Laboratory,ColdSpringHarborPress,NY,(Sambrook)中。
本文中所公开的核酸可以处在可用于在宿主细胞中产生流感病 毒的任何载体中。所述载体可以指导本文中所描述的任何多肽的活体 内或活体外合成，包括但不限于PB1和/或PB2聚合酶。本文中所描 述的一种或多种载体可以是用于产生甲型流感病毒的多载体系统的 一部分。预期所述载体具有能指导和调节所插入的核酸的转录的必需 功能元件。这些功能元件包括但不限于启动子、所述启动子上游或下 游的区域(诸如可调节所述启动子的转录活性的增强子)、复制起点、 适于促进与所述启动子相邻的插入序列的克隆的限制位点、可用于选 择含有所述载体的细胞或含有所述插入序列的载体的抗生素抗性基 因或其他标记物、RNA剪接衔接点、转录终止区或可用于促进插入 基因或杂合基因的表达的任何其他区域(一般参见Sambrook等 (2001))。举例来说，所述载体可以是质粒。所述载体可以含有赋予潮 霉素抗性、氨苄青霉素抗性、庆大霉素抗性、新霉素抗性的基因或适 合用作选择标记物的其他基因或表型。
如全文所使用，宿主细胞是含有本文中所揭示的一种或多种核酸 (包括载体中的任何核酸)并且支持所述核酸的复制和/或表达和任选 地一种或多种编码产物(包括多肽和/或病毒)的产生的细胞。宿主细胞 可以是原核细胞，诸如大肠杆菌；或真核细胞，诸如酵母、昆虫、两 栖动物、禽或哺乳动物细胞，包括人类细胞。宿主细胞的实例包括但 不限于Vero(非洲绿猴肾)细胞、Per.C6细胞(人胚视网膜细胞)、BHK (幼仓鼠肾)细胞、原代鸡肾(PCK)细胞、马-达二氏犬肾(MDCK)细胞、 马-达二氏牛肾(MDBK)细胞、293细胞(例如293T细胞)、CEK细胞、 原代人肺细胞、支气管上皮细胞、COS细胞(例如COS1、COS7细胞) 和可用于产生或繁殖流感病毒的任何其他哺乳动物或禽细胞。术语宿 主细胞涵盖细胞的组合或混合物，包括但不限于不同细胞类型或细胞 系的混合培养物。
本文中所描述的任何经修饰的甲型流感病毒可以是与包含在氨 基酸310至325中缺乏一个或多个突变的PB1聚合酶的甲型流感病 毒相比具有从约37℃至约39℃减缓的生长的活减毒甲型流感病毒。 举例来说，经修饰的甲型流感病毒在约37℃、38℃或39℃或介于其 之间的任何温度下可以具有减缓的生长。此外，经修饰的甲型流感病 毒在约37℃至38℃下或在约38℃至39℃下可以具有减缓的生长。任 选地，经修饰的甲型流感病毒能在介于约32℃至34℃之间的温度下 生长且在高于约34℃的温度下减缓生长。这样，所述经修饰的甲型流 感病毒可以例如在温度为约32℃至34℃的上呼吸道中生长并且刺激 免疫反应，而在温度为约37℃至38℃的下呼吸道中不产生症状。任 选地，所述经修饰的甲型流感病毒在介于约32℃至34℃之间的温度 以及介于约37℃至约39℃之间的温度下得以减毒。在介于约32℃至 34℃之间的温度下和在介于约37℃至约39℃之间的温度下的减毒程 度不必相同，因为在32℃至34℃下的生长减缓可能大约等同于或少 于在约37℃至约39℃下的生长减缓。任选地，相对于在约34℃下， 所述病毒在约39℃下展现至少约100倍或更大程度的效价降低。
如全文所使用，范围在本文中可以表达为从约一个具体值和/或 至约另一个具体值。当表达这样的范围时，另一个方面包括从所述一 个具体值和/或至所述另一个具体值。类似地，当值通过使用先行词约 而被表达为近似值时，应理解所述具体值形成另一个方面。应进一步 理解，每个范围的端点相对于另一个端点都是有意义的，并且独立于 另一个端点。还应理解，本文中公开了多个值，并且除了所述值本身 以外，每个值在本文中还公开为“约”该具体值。举例来说，如果公开 了值10，则还公开了“约10”。还应理解，贯穿本申请，数据是以多 种不同的形式提供，并且这数据表示端点和起点以及所述数据点的任 何组合的范围。举例来说，如果公开了具体数据点“10”和具体数据点 “15”，则应理解，认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于 及等于10和15，以及介于10与15之间。还应理解，还公开了介于 两个具体单元之间的每个单元。举例来说，如果公开了10和15，则 还公开了11、12、13和14。
生长减缓或下降可以是与包含在氨基酸310至325中缺乏一个 或多个突变的PB1聚合酶的甲型流感病毒相比下降了约10％、20％、 30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或介于其之间的任 何百分比。生长指示如由效价、蚀斑尺寸或形态、颗粒密度或本领域 技术人员已知的其他尺度所指示的病毒量。生长减缓或下降还可以是 与包含在氨基酸310至325中缺乏一个或多个突变的PB1聚合酶的 甲型流感病毒相比在复制方面减缓或下降了约10％、20％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％、100％或介于其之间的任何百分比。
还提供了一种免疫原性组合物，其包含本文中所公开的任何经修 饰的甲型流感病毒和药学上可接受的载体以刺激针对一个或多个流 感病毒株的免疫反应。药学上可接受的载体意指不会在生物学或其他 方面不合需要的物质，即，将所述物质施用于受试者而不会造成不合 需要的生物学效应或以不利的方式与含有其的医药组合物中的其他 组分相互作用。选择载体以减少活性成分的降解和减少在受试者中的 不利副作用。本领域技术人员应知道如何选择载体以减少过敏效应和 其他不合需要的效应，并且适应具体的施用途径。任选地，所述组合 物可以进一步包含佐剂。
合适的载体和其制剂描述于Remington:TheScienceandPractice ofPharmacy,第21版,DavidB.Troy编,LippicottWilliams&Wilkins (2005)中。药学上可接受的载体的实例包括但不限于无菌水、生理盐 水、缓冲溶液如林格氏溶液、甘油溶液、乙醇、葡萄糖溶液、得自于 未感染的鸡蛋的尿囊液(即，正常尿囊液)或其组合。所述溶液的pH值 一般是约5至约8或约7至7.5。确保无菌性、pH值、等张性和稳定 性的这类溶液的制备是根据本领域中确立的方案来实现。
其他载体包括持续释放制剂，诸如含有免疫原性组合物的固体疏 水性聚合物的半透性基质。基质呈成形制品形式，例如膜、脂质体或 微粒。某些载体可能是更优选的，取决于例如施用途径和所施用的组 合物的浓度。载体是适合于向人类或其他受试者施用本文中所公开的 组合物的那些。
还提供了一种用于在受试者中引发针对流感病毒的免疫反应的 方法，其包括施用有效剂量的本文中所描述的任何免疫原性组合物。 在本文中所公开的方法中，免疫反应可以是先天性和/或适应性免疫 反应。免疫反应可以是针对一个或多个流感病毒株的抗体反应和/或T 细胞介导的反应。
如全文所使用，受试者可以是脊椎动物，更具体来说是哺乳动物 (例如人类、马、猫、狗、奶牛、猪、绵羊、山羊、小鼠、兔、大鼠和 豚鼠)、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼和任何其他动物。该术语不指 示具体的年龄或性别。因此，意在涵盖成年和新生受试者，无论是雄 性还是雌性。如本文中所使用，患者或受试者可以互换使用并且可以 指具有流感感染或处在发展流感感染的风险之下的受试者。术语患者 或受试者包括人类和兽医学受试者。
根据本文中所教授的方法，向受试者施用有效量的药剂，例如包 含经修饰的甲型流感病毒的免疫原性组合物。术语有效量和有效剂量 可互换使用。术语有效量定义为产生所需要的生理反应(即，免疫反 应)所必需的任何量。药剂的有效量和施用时程可以凭经验决定，并且 作出这样的决定在本领域技术人员的能力范围内。施用剂量范围是大 到足以产生所需要的效应(例如，引发针对目标抗原，即甲型流感病毒 的免疫反应)的那些范围。剂量不应大到造成实质性不利副作用，诸如 不需要的交叉反应、过敏反应等等。一般来说，剂量将随年龄、病状、 性别、疾病类型、疾病或病症程度、施用途径或疗程中是否包括其他 药物而变化，并且可以由本领域技术人员来决定。剂量可以由个别医 师加以调节，以防存在任何禁忌。剂量可以变化，并且药剂可以用每 天一个或多个剂量施用的形式施用一天或若干天，包括初免-加强免 疫范例。
所述组合物是经由若干种施用途径中的任一种来施用，包括但不 限于口服、肠胃外、静脉内、肌肉内、皮下、经皮、雾化/吸入或通过 支气管镜检进行的安装。任选地，所述组合物是通过经口吸入、经鼻 吸入或鼻内粘膜施用来施用。通过吸入剂施用组合物可以经由喷雾或 液滴机制通过鼻或口递送，例如呈气雾剂形式。本领域技术人员可以 使用能产生免疫反应的施用形式来优化反应。
在本文中所描述的任何方法中，免疫原性组合物可以单独或与一种或多种治疗剂，举例来说，诸如用于治疗流感的抗病毒化合物组合使用。这些化合物包括但不限于金刚胺、金刚乙胺、病毒唑、扎那米韦和奥司他韦
还提供了一种用于在受试者中治疗或预防流感感染的方法，其包 括向已受流感感染或易受流感感染的受试者施用有效剂量的本文中 所描述的任何免疫原性组合物。
出于疫苗的目的，受试者可以是健康的并且不具有高于一般公众 的风险。然而，处在发展流感感染的风险之下的受试者可能倾向于罹 患感染(例如超过65岁的人士、患有哮喘或其他慢性呼吸道疾病的人 士、幼儿、孕妇、具有遗传素质的人士、免疫系统受损的人士或处在 有助于传播流感感染的环境中)。目前具有感染的受试者具有一种或 多于一种感染症状。这些症状包括但不限于发烧、喉咙痛、咳嗽、肌 肉痛、头痛、疲劳、呕吐和腹泻。目前具有流感感染的受试者可能已 经被诊断出流感感染。
如本文中所描述的方法和组合物可用于预防性和治疗性治疗。对 于预防性用途，在发作前(例如在明显感染征象之前)或早期发作期间 (例如在初步感染征象和症状时)向受试者施用治疗有效量的本文中 所描述的组合物。预防性施用可以在表现感染症状前进行若干天至若 干年。预防性施用可以用于例如对诊断出具有流感感染素质的受试者 进行预防性治疗。治疗性治疗包括在诊断或发展感染之后向受试者施 用治疗有效量的本文中所描述的药剂。
如本文中所使用，术语治疗是指通过在受试者中引发免疫反应来 减轻一种或多种感染影响或一种或多种感染症状的方法。因此，在所 公开的方法中，治疗可以指确定的感染或感染症状的严重程度的10％、 20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％减轻。举例 来说，如果受试者中的一种或多种感染症状与对照相比存在10％减轻， 则用于治疗感染的方法被视为治疗。因此，所述减轻可以是同天然或 对照水平相比减轻10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、 90％、100％或介于10％与100％之间的任何百分比。应理解，治疗未 必是指感染或疾病或者感染或疾病的症状的治愈或完全消除。
如本文中所使用，术语预防感染是指在受试者开始显示一种或多 种感染症状之前或大约同时进行的能抑制或延迟一种或多种感染症 状发作或加重或延迟复发的动作，例如施用治疗剂(例如本文中所公 开的组合物)。如本文中所使用，提到降低、减少或抑制包括与对照水 平相比改变10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％ 或更大程度。举例来说，如果暴露于感染的受试者中的感染或感染症 状的发作、加重或复发当与暴露于感染且未接受用于减轻感染的组合 物的对照受试者相比时减少约10％，则所公开的方法被视为预防。因 此，感染发作、加重或复发的减少可以是与对照受试者相比减少约 10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或介 于其之间的任何量。举例来说且不具限制性，如果与未接受预防性治 疗的受试者相比群体中>约10％的受试者未被感染，则这被视为预防。
还提供了一种产生本文中所公开的甲型流感病毒的方法，其包括 (a)用一个或多个包含以下各项的载体转染宿主细胞群体：(i)编码甲型 流感病毒的内部基因组节段的核酸序列；和(ii)编码在氨基酸310至 325中具有一个或多个突变的PB1聚合酶的核酸；(b)培养所述宿主 细胞；和c)回收经修饰的甲型流感病毒。对于产生流感病毒的方法对 于本领域技术人员是已知的。在本文中所描述的产生方法中，将并入 流感主病毒株的内部基因(即，PB1、PB2、PA、NP、N13、M1、BM2、 NS1和NS2)的质粒与血凝素和神经氨酸酶节段的组合转染至合适的 宿主细胞中。参见例如美国专利号8,354,114，该专利以引用的方式并 入本文中。任选地，血凝素和神经氨酸酶节段可以来自于预计会造成 显著局部或全面流感感染的病毒株。典型地，基于与疫苗施用有关的 合乎需要的性质来选择主病毒株。举例来说，对于疫苗产生来说，例 如对于活减毒疫苗的产生来说，可以选择主供体病毒株以实现减毒表 型、冷适应和/或温度敏感性。举例来说，甲型流感病毒株caA/Ann Arbor/6/60可以是主供体病毒(参见例如Chan等,Virology380:304-311 (2008))。继重排病毒在适于有效回收的温度下，例如在等于或低于约 35℃，诸如约32℃至35℃、约32℃至约34℃或约32℃至约33℃的 温度下在细胞培养物中复制之后，回收重排病毒。任选地，所回收的 病毒可以使用诸如甲醛或β-丙内酯之类的变性剂进行灭活。任选地， 在本文中所提供的生产方法中，病毒可以在鸡蛋中进一步扩增。
还提供了一种用于产生流感疫苗的方法，其包括：(a)用本文中所 描述的任何病毒感染细胞群体；(b)培养所述细胞；(c)从步骤(b)的培 养物中收集所述病毒；和(d)用所收集的病毒制备疫苗。
一旦从细胞培养物中收集所述病毒后，可以根据已知的方法将所 述病毒配制为免疫原性组合物并且作为组合物施用以便在动物(例如 哺乳动物)中诱导免疫反应。任选地，所述免疫原性组合物可以配制为 灭活疫苗。用于确定这些灭活疫苗是否维持与临床分离株或来源于其 的高生长株类似的抗原性的方法在本领域中是众所周知的。如以上所 阐述，可以经由常规用于或推荐用于免疫原性组合物的所有途径来施 用免疫原性组合物。免疫原性组合物可以配制为可注射或可喷射液体 或已经进行了冻干或雾化干燥或风干等的制剂。免疫原性组合物还可 以经配制以便经由注射器或借助于用于肌肉内、皮下或皮内注射的无 针注射器进行施用。免疫原性组合物还可以借助于能够向粘膜递送干 粉或液体或雾化喷雾的雾化器进行施用。
完全免疫原性组合物可以通过超滤作用进行浓缩，然后通过区带 离心法或通过色谱法加以纯化。任选地，其可在纯化前后使用例如福 尔马林或β-丙内酯灭活。
公开了可用于、可联合用于、可用于制备或作为所公开的方法和 组合物的产物的物质、组合物和组分。本文中公开了这些和其他物质， 并且应理解，当公开这些物质的组合、子集、相互作用、群组等时， 尽管关于这些化合物的每种不同的个别和全体组合和排列可能并未 明确公开，但本文中明确涵盖和描述了每一者。举例来说，如果公开 并讨论了一种方法并且讨论了可对该方法中包括的多种分子进行的 多种修改，则除非明确相反指出，否则将明确涵盖所述方法的各个和 每个组合和排列以及可能的修改。同样，还明确涵盖并公开了这些的 任何子集或组合。这一概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于 使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果可以进行多个附加 步骤，则应理解，这些附加步骤中的每一个可以与所公开的方法的任 何具体方法步骤或方法步骤的组合一起进行，并且明确涵盖且应被视 为公开了每个这种组合或组合的子集。
本文中所引用的出版物和其所引用的材料是以全文引用的方式 明确并入在此。
实施例
推荐目前的活减毒流感疫苗(LAIV)作为主要接种策略用于年龄 为2至49岁的健康受试者，因为其与传统灭活流感疫苗相比在这个 年龄组中具有更大的效力并且容易使用。然而，不推荐目前的LAIV 用于孕妇、2岁以下的儿童、免疫系统受损的人士(例如患有HIV/AIDS 的人士)或处在流感并发症的高风险之下的人士。
目前的LAIV疫苗起初是通过冷适应获得，并且后续的工作确定 减毒基因节段对应于病毒聚合酶(PB1、PB2、PA)和核蛋白(NP)。将减 毒PB2节段引入季节性流感病毒背景的基因背景中引起温度敏感性 和减毒作用，这可以通过在高温下对病毒进行连续传代加以克服。
分析这些表型回复突变病毒，目标在于理解LAIV的减毒作用的 潜在分子机制。用于离析和表征突变病毒，包括表征温度敏感性的方 法描述于Treanor等(“Evaluationofthegeneticstabilityoftemperature- sensitivePB2genemutationoftheinfluenzaA/AnnArbor/6/60cold- adaptedvaccinevirus”,J.Virol.68(12):7684-8(1994))中，该文献以全 文引用的方式并入在此。
引起PB1的319位上亮氨酸至谷氨酰胺的取代的突变是使用本 文中所描述的方法来进行。突变体的聚合酶活性是使用Bussey等(“PA residuesinthe2009H1N1pandemicinfluenzavirusenhanceavian influenzaviruspolymeraseactivityinmammaliancells”,J.Virol.85(14): 7020-8(2011))中所描述的小基因体测定法来测定，该文献以全文引用 的方式并入在此。据发现，PB1基因中(残基319上)的突变足以逆转 病毒RNA聚合酶的由LAIVPB2基因节段赋予的温度敏感性表型。 这是出乎意料的，因为先前的研究已经确定这些回复突变仅在PA基 因中。后续研究显示，319突变还足以逆转来自于H5N1和H9N2谱 系中的两个禽病毒株的RNA聚合酶的温度敏感性，因此显示PB1319 残基在决定病毒聚合酶的温度敏感性方面具有广泛相关性。总之，这 些研究揭示了甲型流感病毒RNA聚合酶的温度敏感性和减毒作用的 新颖分子决定因素。
以下研究是通过如Treanor等所阐述来构建和表征突变病毒来进 行。用以下方式表征病毒的温度敏感性：用ts单基因置换病毒以0.01 的MOI感染MDCK细胞的汇合6孔板，并且在34℃、37℃和39℃ 下孵育72小时。每12小时收集培养物上清液的样品且用新鲜培养基 置换。通过离心使这些样品澄清化并且存储在-80℃下。然后通过如 Bussey等所描述的TCID-50分析来分析样品的病毒效价。此分析中 所使用的病毒具有处在A/Korea/1982背景中的冷适应温度敏感性减 毒A/AnnArbor/6/60(Genbank标识号：AY209938.1)的PB2节段(参见 Treanor等)。
如以上所阐述，将季节性人类甲型流感病毒株(A/Korea/82H3N2) 的PB2节段置换为得自于A/AnnArbor/6/60的冷传代分离株的PB2 节段。所产生的单基因置换病毒对于在高温下生长具有温度敏感性 (ts)。在增高的温度下对这种病毒母液进行连续传代，以便确定表型回 复突变单基因置换病毒。对tsPB2单基因置换病毒进行蚀斑纯化，并 且分析个别蚀斑的温度依赖性生长性质。预期经过蚀斑纯化的病毒在 34℃和37℃下能生长，但在39℃下不生长(参见图1)。令人惊讶的是， 在37℃下以及在39℃下减缓生长的病毒被纯化。
将病毒聚合酶的所有组分都从病毒RNA克隆到哺乳动物表达载 体中，然后加以分析。令人惊讶的是，这个系统显示聚合酶活性在37℃ 下显著降低。发现多个残基与保守流感序列相比是独特的，并且通过 定点突变诱发突变至保守残基来研究其重要性。目标残基存在于PB1 中的氨基酸319上，并且是极性谷氨酰胺对非极性亮氨酸的取代。 PB1L319Q突变显著降低人类甲型流感病毒RNA聚合酶在37℃下的 功能活性(参见图2)。
然后研究这种突变对其他甲型流感病毒(IAV)的影响。在这些实 验中，使用禽IAV聚合酶复合物，即得自于低病原性病毒 A/Chicken/Nanchang/3-120/01H3N2的聚合酶复合物。将PB1中的 L319Q突变引入这种聚合酶中也显著降低这种禽甲型流感病毒RNA 聚合酶在37℃下的功能活性(图3)。还发现具有L319Q突变的PB1 与在LAIV中发现的三个突变(K391E、E581G和A661T)协同作用(图 4)。使用Bussey等所描述的小基因组测定法来测定聚合酶活性。
进行附加实验以进一步表征经修饰的疫苗株病毒的温度敏感性。 通过Martinez-Sobrido等(“GenerationofRecombinantInfluenzaVirus fromPlasmidDNA”,J.Vis.Exp.42:2057(2010))中所描述的PR8双向 质粒的定点突变诱发来产生病毒。PR8活减毒流感病毒(LAIV)具有4 个氨基酸突变。这些突变是PB2中的N265S、PB1中的K391E、PB1 中的E581G和PB1中的A661T。PR8LAIV+PB1319Q具有突变PB1 L319Q以及PR8LAIV中的4个突变。对所有质粒进行测序以证实成 功进行了定点突变诱发，并且对所有拯救的病毒进行测序以证实仅保 留了所需要的突变。经由如Bussey等所描述的蚀斑测定法来测定两 种病毒的温度敏感性生长。当LAIV的四个突变(PB2中的N265S、 PB1中的K391E、PB1中的E581G和PB1中的A661T)被加到PR8 时，在39℃下通过蚀斑测定法未检测到病毒。然而，当加入PB1319Q 以及LAIV的四个突变时，在37℃下也不发生病毒生长(图5)。
还进行了实验以表征L319Q突变的稳定性。PB1的残基319Q上 的谷氨酰胺的稳定性是通过将这个突变单独插入在野生型病毒的背 景中以确定这个突变是否稳定来加以分析。经由Martinez-Sobrido等 所描述的PR8双向质粒的定点突变诱发来构建这些病毒。PB1319Q 在PB1的残基319上具有谷氨酰胺，而不是野生型亮氨酸。对所有 质粒进行测序以证实成功进行了定点突变诱发，并且对所有拯救的病 毒进行测序以证实仅保留了所需要的突变。然后在30℃、33℃、37℃ 和39℃下将所述病毒再传代三次。然后如Zhou等(“Single-reaction genomicamplificationacceleratessequencingandvaccineproductionfor classicalandSwineoriginhumaninfluenzaaviruses”,J.Virol.19:10309- 13(2009))所描述对PB1基因进行整体测序，该文献以全文引用的方 式并入本文中。在1次传代之后，所述病毒显示出一致稳定性。在 30℃、33℃、37℃和39℃下进行2次后续传代之后，所有病毒在这个 位置都保留谷氨酰胺。这表明这种突变在不同的温度下在甲型流感病 毒中是稳定的(图6)。
因此，鉴别了能增加甲型流感病毒的温度敏感性的新颖而又出乎 意料的PB1中的突变(L319Q)。因此，这种突变和其他突变可用于制 造活减毒流感病毒。这些突变还可以用于对现存活减毒流感病毒 (LAIV)进行进一步减毒，从而提高其安全性，并且允许其用于目前忌 用所述疫苗的群体。
序列
SEQIDNO：1
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