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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610038988.X (22)申请日 2016.01.12 C12N 5/10(2006.01) C12N 5/071(2010.01) (71)申请人 河南师范大学 地址 453007 河南省新乡市建设东路 46 号 (72)发明人 杨献光 王棋文 靳伟 常翠芳 朱琳 和春翠 (54) 发明名称 一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法 (57) 摘要 本发明公开了一种大鼠原代肝细胞的优化培 养方法， 包括如下步骤 ： 将大鼠原代肝细胞上样 于微孔培养板， 离心后置于肝细胞无血清培养液 培养 ； 培养完成后， 收集原代肝细胞， 并转染成。
2、改 造细胞置于肝细胞无血清培养基进行微载体悬 浮培养 ； 所述肝细胞无血清培养液包括基础培养 基、 胰岛素、 亚硒酸钠、 表皮生长因子、 肝细胞生长 因子、 纤粘连蛋白、 地塞米松和奶蓟草提取物 ； 所 述肝细胞无血清培养基包括高糖培养基、 表皮再 生丝素蛋白纤维、 地塞米松、 葛仙米提取物等。本 发明利用力学紧凑种植原代肝细胞， 可以使肝细 胞间排列紧凑， 形成紧密接触， 肝细胞可以快速形 成高密度培养 ； 采用无血清培养基配方， 使其更 适合肝细胞的生长及功能发挥， 从而实现了体外 肝细胞的大量培养。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利。
3、要求书1页 说明书3页 CN 105505883 A 2016.04.20 CN 105505883 A 1.一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法， 其特征在于稳定增殖的同时保持肝细胞的特 性， 包括如下步骤： S1、 将大鼠原代肝细胞上样于微孔培养板， 60g-260g离心3-11min， 去除微孔培养板表 面多余细胞悬液后， 置于肝细胞无血清培养液培养； S2、 培养完成后， 收集步骤S1所得的原代肝细胞用SV40Tag和人端粒酶逆转录酶转染所 述原代细胞， 获得改造细胞； S32、 将所得的改造细胞置于肝细胞无血清培养基进行微载体悬浮培养； 所述肝细胞无血清培养液包括以下组分： 基础培养基5。
4、00mL、 胰岛素0.51.1 g/mL、 亚硒酸钠610 g/L、 表皮生长因子5 110ng/mL、 肝细胞生长因子5110ng/mL、 纤粘连蛋白0.31.3 g/mL、 地塞米松0.3 10.3nmol/mL和奶蓟草提取物50110mg/L； 所述肝细胞无血清培养基包括以下组分： DMEM/F12高糖培养基500mL、 表皮再生丝素蛋白纤维0.050.5、 地塞米松0.1 1100nmol/mL、 葛仙米提取物50110mg/L、 肝细胞生长因子1025ng/mL、 青链霉素50 100U/mL， 胰高血糖素0.055 g/mL、 海藻酸钠510 g/L、 去端肽胶原0.050.5。 。
5、2.根据权利要求1所述的一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法， 其特征在于， 所述表皮 再生丝素蛋白纤维为混合有表皮生长因子和转铁蛋白的再生丝素蛋白纤维构成的具有三 维交错网络结构特征的纤维毡。 3.根据权利要求2所述的一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法， 其特征在于， 所述表皮 再生丝素蛋白纤维内表皮生长因子的含量为1050ng/mL。 4.根据权利要求2所述的一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法， 其特征在于， 所述转铁 蛋白的质量占所述再生丝素蛋白纤维总质量的1.31034.3103。 5.根据权利要求2所述的一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法， 其特征在于， 所述的再 生丝素蛋白纤维的直径范围为3。
6、50nm7 m。 6.根据权利要求1所述的一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法， 其特征在于， 所述原代 肝细胞的培养时间为12-48h。 7.根据权利要求1所述的一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法， 其特征在于， 所述步骤 S2按照SV40Tag与原代细胞数比为110-5110-4 g/个的转染量进行转染； 和/或按照所 述人端粒酶逆转录酶与原代细胞数比为110-5110-4 g/个的转染量进行转染。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105505883 A 2 一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法 技术领域 0001 本发明涉及细胞培养领域， 具体涉及一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法。 背景技术 0。
7、002 肝衰竭是多种因素引起的严重肝脏损害， 导致其合成、 解毒、 排泄和生物转化等功 能发生严重障碍或失代偿， 出现以凝血功能障碍、 黄疸、 肝性脑病、 腹水等为主要表现的一 组临床症候群。 目前肝衰竭治疗手段中， 生物人工肝系统是最佳的选择。 生物型人工肝是指 将同种或异种动物的器官、 组织和细胞等与特殊材料、 装置结合， 构成的人工肝支持系统， 暂时替代肝脏功能， 从而协助治疗。 0003 生物型人工肝包括以往的离体肝灌流、 人-哺乳类动物交叉灌流等等， 主要的决定 修复体性质的关键是其中采用的人工细胞的材料。 但是， 目前所构建的各种细胞材料都有 其各自的优缺点。 比如， 动物源性肝细。
8、胞来源比较广， 可大量获得， 但是其带有动物源性疾 病， 容易产生异种蛋白的免疫排斥和免疫致病。 另一种能够大量获得的就是肿瘤来源的肝 细胞系， 其可大量增殖并规模培养， 但具有肿瘤性状， 肝细胞的功能不如正常肝细胞， 且有 致瘤的风险。 而相比上两种， 胎肝细胞虽较理想， 且缺陷比较少， 但本身来源受限， 且培养和 制备的过程中条件非常严格控制， 制备难度高且产量也较少， 不易大量获得。 发明内容 0004 为解决上述问题， 本发明提供了一种大鼠原代肝细胞的优化培养方法， 实现了体 外肝细胞的大量培养。 0005 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案为： 0006 一种大鼠原代肝细胞的优化。
9、培养方法， 包括如下步骤： 0007 S1、 将大鼠原代肝细胞上样于微孔培养板， 60g-260g离心3-11min， 去除微孔培养 板表面多余细胞悬液后， 置于肝细胞无血清培养液培养； 0008 S2、 培养完成后， 收集步骤S1所得的原代肝细胞用SV40Tag和人端粒酶逆转录酶转 染所述原代细胞， 获得改造细胞； 0009 S32、 将所得的改造细胞置于肝细胞无血清培养基进行微载体悬浮培养； 0010 所述肝细胞无血清培养液包括以下组分： 0011 基础培养基500mL、 胰岛素0.51.1 g/mL、 亚硒酸钠610 g/L、 表皮生长因子5 110ng/mL、 肝细胞生长因子5110n。
10、g/mL、 纤粘连蛋白0.31.3 g/mL、 地塞米松0.3 10.3nmol/mL和奶蓟草提取物50110mg/L； 0012 所述肝细胞无血清培养基包括以下组分： 0013 DMEM/F12高糖培养基500mL、 表皮再生丝素蛋白纤维0.050.5、 地塞米松0.1 1100nmol/mL、 葛仙米提取物50110mg/L、 肝细胞生长因子1025ng/mL、 青链霉素50 100U/mL， 胰高血糖素0.055 g/mL、 海藻酸钠510 g/L、 去端肽胶原0.050.5。 0014 优选地， 所述表皮再生丝素蛋白纤维为混合有表皮生长因子和转铁蛋白的再生丝 说明书 1/3 页 3 C。
11、N 105505883 A 3 素蛋白纤维构成的具有三维交错网络结构特征的纤维毡 0015 优选地， 所述表皮再生丝素蛋白纤维内表皮生长因子的含量为1050ng/mL。 0016 优选地， 所述转铁蛋白的质量占所述再生丝素蛋白纤维总质量的1.31034.3 103。 0017 优选地， 所述的再生丝素蛋白纤维的直径范围为350nm7 m。 0018 优选地， 所述原代肝细胞的培养时间为12-48h。 0019 优选地， 所述步骤S2按照SV40Tag与原代细胞数比为1x10-51x10-4 g/个的转染 量进行转染； 和/或按照所述人端粒酶逆转录酶与原代细胞数比为1x10-51x10-4 g/。
12、个的 转染量进行转染。 0020 本发明具有以下有益效果： 0021 利用力学紧凑种植原代肝细胞， 可以使肝细胞间排列紧凑， 形成紧密接触， 肝细胞 可以快速形成高密度培养； 采用无血清培养基配方， 使其更适合肝细胞的生长及功能发挥， 从而实现了体外肝细胞的大量培养。 具体实施方式 0022 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白， 以下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于限定本发 明。 0023 本具体实施中按照SV40Tag与原代细胞数比为1x10-51x10-4 g/个的转染量进行 转染； 和/或按照所述人端粒酶逆转录酶。
13、与原代细胞数比为1x10-51x10-4 g/个的转染量 进行转染， 所使用的再生丝素蛋白纤维的直径范围为350nm7 m。 0024 实施例1 0025 S1、 将大鼠原代肝细胞上样于微孔培养板， 60g离心11min， 去除微孔培养板表面多 余细胞悬液后， 置于肝细胞无血清培养液培养12h； 0026 S2、 培养完成后， 收集步骤S1所得的原代肝细胞用SV40Tag和人端粒酶逆转录酶转 染所述原代细胞， 获得改造细胞； 0027 S32、 将所得的改造细胞置于肝细胞无血清培养基进行微载体悬浮培养； 0028 所述肝细胞无血清培养液包括以下组分： 0029 基础培养基500mL、 胰岛素0。
14、.5 g/mL、 亚硒酸钠6 g/L、 表皮生长因子5ng/mL、 肝细 胞生长因子5ng/mL、 纤粘连蛋白0.3 g/mL、 地塞米松0.3nmol/mL和奶蓟草提取物50mg/L； 0030 所述肝细胞无血清培养基包括以下组分： 0031 DMEM/F12高糖培养基500mL、 表皮再生丝素蛋白纤维0.05、 地塞米松0.1nmol/ mL、 葛仙米提取物50mg/L、 肝细胞生长因子10ng/mL、 青链霉素50U/mL， 胰高血糖素0.05 g/ mL、 海藻酸钠5 g/L、 去端肽胶原0.05， 所述表皮再生丝素蛋白纤维为混合有表皮生长因 子和转铁蛋白的再生丝素蛋白纤维构成的具有三。
15、维交错网络结构特征的纤维毡； 所述表皮 再生丝素蛋白纤维内表皮生长因子的含量为10ng/mL， 所述转铁蛋白的质量占所述再生丝 素蛋白纤维总质量的1.3103。 0032 实施例2 0033 S1、 将大鼠原代肝细胞上样于微孔培养板， 260g离心3min， 去除微孔培养板表面多 说明书 2/3 页 4 CN 105505883 A 4 余细胞悬液后， 置于肝细胞无血清培养液培养48h； 0034 S2、 培养完成后， 收集步骤S1所得的原代肝细胞用SV40Tag和人端粒酶逆转录酶转 染所述原代细胞， 获得改造细胞； 0035 S32、 将所得的改造细胞置于肝细胞无血清培养基进行微载体悬浮培养。
16、； 0036 所述肝细胞无血清培养液包括以下组分： 0037 基础培养基500mL、 胰岛素1.1 g/mL、 亚硒酸钠10 g/L、 表皮生长因子110ng/mL、 肝 细胞生长因子110ng/mL、 纤粘连蛋白1.3 g/mL、 地塞米松10.3nmol/mL和奶蓟草提取物 110mg/L； 0038 所述肝细胞无血清培养基包括以下组分： 0039 DMEM/F12高糖培养基500mL、 表皮再生丝素蛋白纤维0.5、 地塞米松1100nmol/ mL、 葛仙米提取物110mg/L、 肝细胞生长因子25ng/mL、 青链霉素100U/mL， 胰高血糖素5 g/ mL、 海藻酸钠10 g/L、。
17、 去端肽胶原0.5， 所述表皮再生丝素蛋白纤维为混合有表皮生长因 子和转铁蛋白的再生丝素蛋白纤维构成的具有三维交错网络结构特征的纤维毡； 所述表皮 再生丝素蛋白纤维内表皮生长因子的含量为50ng/mL， 所述转铁蛋白的质量占所述再生丝 素蛋白纤维总质量的4.3103。 0040 实施例3 0041 S1、 将大鼠原代肝细胞上样于微孔培养板， 160g离心7min， 去除微孔培养板表面多 余细胞悬液后， 置于肝细胞无血清培养液培养30h； 0042 S2、 培养完成后， 收集步骤S1所得的原代肝细胞用SV40Tag和人端粒酶逆转录酶转 染所述原代细胞， 获得改造细胞； 0043 S32、 将所得。
18、的改造细胞置于肝细胞无血清培养基进行微载体悬浮培养； 0044 所述肝细胞无血清培养液包括以下组分： 0045 基础培养基500mL、 胰岛素0.8 g/mL、 亚硒酸钠8 g/L、 表皮生长因子57.5ng/mL、 肝 细胞生长因子57.5ng/mL、 纤粘连蛋白0.8 g/mL、 地塞米松5.3nmol/mL和奶蓟草提取物 80mg/L； 0046 所述肝细胞无血清培养基包括以下组分： 0047 DMEM/F12高糖培养基500mL、 表皮再生丝素蛋白纤维0 .275、 地塞米松 550.05nmol/mL、 葛仙米提取物80mg/L、 肝细胞生长因子17.5ng/mL、 青链霉素75U/mL， 胰高 血糖素2.525 g/mL、 海藻酸钠7.5 g/L、 去端肽胶原0.275， 所述表皮再生丝素蛋白纤维为 混合有表皮生长因子和转铁蛋白的再生丝素蛋白纤维构成的具有三维交错网络结构特征 的纤维毡； 所述表皮再生丝素蛋白纤维内表皮生长因子的含量为30ng/mL， 所述转铁蛋白的 质量占所述再生丝素蛋白纤维总质量的2.8103。 0048 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以作出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说明书 3/3 页 5 CN 105505883 A 5 。