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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510312026.4 (22)申请日 2015.06.09 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104846114 A (43)申请公布日 2015.08.19 (73)专利权人 中国检验检疫科学研究院 地址 100123 北京市朝阳区高碑店北路甲3 号 (72)发明人 刘晓飞王勤林祥梅冯春燕 付伟仇松寅李晓琳刘丹丹 (74)专利代理机构 北京正理专利代理有限公司 11257 代理人 赵晓丹 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12。
2、N 15/11(2006.01) (56)对比文件 Andrs Rogberg-Muoz, et al.Recent Patents for Detecting the Species of Origin in Animal Feedstuff,and Raw and Processed Meat Products. Recent Patents on Food, Nutrition & Agriculture .2013,第 5卷(第1期),第6页左栏第1段-左栏第1段. 陈爱萍 等.牛四核苷酸STR基因座的筛选和 多态性分析. 中国法医学杂志 .2009,第24卷 (第6期),第361-3。
3、64页. D. Nechtelberger， et al.DNA MICROSATELLITE ANALYSIS FOR PARENTAGE CONTROL IN AUSTRIAN PIGS. ANIMAL BIOTECHNOLOGY .2001,第12卷(第2期),第141- 144页. 审查员 陈皓 (54)发明名称 转基因动物多重快速检测试剂盒及引物 (57)摘要 本发明公开了一种转基因动物多重快速检 测试剂盒及引物。 所述引物如序列表SEQIDNO： 1至SEQIDNO： 20所示， 使用本发明所述的引物， 和/或包含该引物的试剂盒可同时检测人乳铁蛋 白转基因牛(hLF)、 人溶菌酶转。
4、基因牛(hLY)、 人 -乳清蛋白转基因牛(hLA)和MSTN基因敲除猪 (MSTN)、 转植酸酶基因猪(appA)、 转-3脂肪酸 去饱和酶基因猪(-3)等6种目前已取得成功的 转基因动物， 节约了时间和成本， 有利于转基因 猪和牛的快速筛查。 权利要求书1页 说明书8页 序列表6页 附图10页 CN 104846114 B 2017.10.03 CN 104846114 B 1.一种检测人乳铁蛋白转基因牛、 人溶菌酶转基因牛、 人 -乳清蛋白转基因牛、 MSTN基 因敲除猪、 转植酸酶基因猪和转-3脂肪酸去饱和酶基因猪的检测方法， 其特征在于， 该方 法包括以下步骤： （1） 提取样品基因。
5、组； （2） 使用多重PCR引物混合物进行PCR反应； 其中， 所述多重PCR引物如序列表SEQ ID NO： 1至SEQ ID NO： 20所示， 其中， 所述序列SEQ ID NO： 1， SEQ ID NO： 9， SEQ ID NO： 12， 和 SEQ ID NO： 19的5 端标记了TAMRA荧光基团； 所述序列SEQ ID NO： 4， SEQ ID NO： 7， SEQ ID NO： 14， 和SEQ ID NO： 17的5 端标记了FAM荧光基团； 所述序列SEQ ID NO： 6和SEQ ID NO： 15的5 端标记了HEX荧光基团； （3） 对步骤 （2） 获得的PCR。
6、产物进行毛细管电泳检测， 其中， 在96孔板中每孔加入9 l分 子量内标和甲酰胺混合液， PCR产物1 l； 95变性3min， 用3730XL测序仪进行检测。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 分子量内标与甲酰胺的体积比为0.5： 8.5。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104846114 B 2 转基因动物多重快速检测试剂盒及引物 技术领域 0001 本发明提供了一种转基因动物多重快速检测试剂盒及引物， 属于检验检疫技术领 域。 背景技术 0002 转基因动物的研究始于20世纪80年代， Gordon(1980)采用原核显微注射法获得了 第一例转基因小鼠 (Gordon。
7、 J W ,Scangos GA ,Plotkin DJ ,et al .Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.Proc Natl Acad Sci U S A.1980Dec； 77(12):7380-4)， 随着研究手段的改善以及分子生物学方面的 研究进展， 转基因动物研究领域得以不断拓宽， 目前在牛、 猪、 羊(Schnieke A E,Kind A J, Ritchie W A,et al.Human factor IX transgenic sheep produced by。
8、 transfer of nuclei from transfected fetal fibroblastsJ,Science,1997,278(5346):2130- 2133)等诸多动物上都有转基因相关的研究， 并取得了许多重要的成果， 其潜在的经济效益 和社会效益巨大。 同时转基因动物及其产品的安全及管理问题也引起了各国的重视， 因此 建立一种高通量快速筛选转基因动物及其产品的方法十分必要。 发明内容 0003 本发明的第一个目的是提供一组用于同时检测人乳铁蛋白转基因牛(hLF)、 人溶 菌酶转基因牛(hLY)、 人 -乳清蛋白转基因牛(hLA)和MSTN基因敲除猪(MSTN)、 转植酸。
9、酶基 因猪(appA)、 转-3脂肪酸去饱和酶基因猪(-3)的多重PCR引物。 0004 本发明的另一个目的是提供快速、 准确、 使用方便的同时检测人乳铁蛋白转基因 牛(hLF)、 人溶菌酶转基因牛(hLY)、 人-乳清蛋白转基因牛(hLA)和MSTN基因敲除猪 (MSTN)、 转植酸酶基因猪(appA)、 转-3脂肪酸去饱和酶基因猪(-3)的检测试剂盒。 0005 为实现上述目的， 本发明采用以下技术方案： 0006 根据GenBank已发表的人乳铁蛋白编码基因、 人- -乳清蛋白编码基因、 人溶菌酶 编码基因和猪MSTN基因(S3)、 植酸酶基因(S2)、 -3脂肪酸基因(S1)以及分别用。
10、于猪和牛 物种鉴定的微卫星标记基因S0386、 S0355和B007、 B026， 应用DNA Star、 DNAMAN、 Primer 5.0 等软件筛查并设计了10对特异检测引物(表1)， 且在引物5 端标记FAM、 HEX或TAMRA等荧光 基团， 经PCR， 获得带有荧光标记的扩增产物。 采用毛细管电泳技术将扩增产物在遗传分析 仪上对产物的大小进行检测并分析结果。 引物均由Invitrogen(上海)有限公司合成。 0007 表1引物名称及序列 说明书 1/8 页 3 CN 104846114 B 3 0008 说明书 2/8 页 4 CN 104846114 B 4 0009 001。
11、0 其中， 上述引物SEQ ID NO： 1， SEQ ID NO： 9， SEQ ID NO： 12， 和SEQ ID NO： 19的5 端标记了TAMRA荧光基团； SEQ ID NO： 4， SEQ ID NO： 7， SEQ ID NO： 14， 和SEQ ID NO： 17的5 端标记了FAM荧光基团； SEQ ID NO： 6和SEQ ID NO： 15的5 端标记了HEX荧光基团。 0011 本发明采用标记PCR技术建立了同时检测人乳铁蛋白转基因牛(hLF)、 人溶菌酶转 基因牛(hLY)、 人 -乳清蛋白转基因牛(hLA)和MSTN基因敲除猪(MSTN)、 转植酸酶基因猪 (a。
12、ppA)、 转-3脂肪酸去饱和酶基因猪(-3)的检测方法并组装了试剂盒。 0012 进一步地， 检测人乳铁蛋白转基因牛(hLF)、 人溶菌酶转基因牛(hLY)、 人 -乳清蛋 白转基因牛(hLA)和MSTN基因敲除猪(MSTN)、 转植酸酶基因猪(appA)、 转-3脂肪酸去饱和 酶基因猪(-3)的检测试剂盒， 包括多重PCR引物， 该多重PCR引物包括分别检测人乳铁蛋 白转基因牛(hLF)、 人溶菌酶转基因牛(hLY)、 人 -乳清蛋白转基因牛(hLA)、 MSTN基因敲除 猪(MSTN)、 转植酸酶基因猪(appA)和转-3脂肪酸去饱和酶基因猪(-3)的引物对， 所述 引物的序列见表1， 。
13、其中， SEQ ID NO： 1， SEQ ID NO： 9， SEQ ID NO： 12， 和SEQ ID NO： 19的5 端标记了TAMRA荧光基团； SEQ ID NO： 4， SEQ ID NO： 7， SEQ ID NO： 14， 和SEQ ID NO： 17的5 端标记了FAM荧光基团； SEQ ID NO： 6和SEQ ID NO： 15的5 端标记了HEX荧光基团。 0013 进一步地， 上述引物中， 各条引物引物之比为等摩尔比。 0014 进一步地， 上述检测试剂盒还包括完成PCR反应所需的PCR缓冲液、 DNA聚合酶、 灭 说明书 3/8 页 5 CN 104846114。
14、 B 5 菌纯化水、 阳性对照等。 0015 本发明还提供了一种检测人乳铁蛋白转基因牛(hLF)、 人溶菌酶转基因牛(hLY)、 人 -乳清蛋白转基因牛(hLA)和MSTN基因敲除猪(MSTN)、 转植酸酶基因猪(appA)、 转-3脂 肪酸去饱和酶基因猪(-3)检测方法， 包括如下步骤： 0016 (1)提取样品基因组： 用Qiagen公司的基因组提取试剂盒， 提取获得样品的基因组 DNA； 亦可采用现有技术中已知的提取试剂或自制试剂进行基因组提取。 0017 (2)PCR反应 0018 PCR体系(10 l)： 0019 表2 PCR反应体系 0020 PCR反应组分加入量 多重PCR引物。
15、混合物(5 M)1.6 l 2.5PCR缓冲液4.0 l Taq DNA聚合酶(5U/ l)0.1 l DNA模板1.0 l ddH2O补齐至10 l 0021 PCR反应程序： 0022 表3 PCR反应程序 0023 0024 (3)毛细管电泳检测 0025 在96孔板中每孔加入9 l分子量内标和甲酰胺混合液(体积比0.5： 8.5)， PCR产物1 l； 95变性3min， 用3730XL测序仪进行检测。 0026 本发明的优点是： 1)多重性： 本发明选取了先前获得成功的人乳铁蛋白转基因牛 (hLF)、 人溶菌酶转基因牛(hLY)、 人 -乳清蛋白转基因牛(hLA)和转-3脂肪酸去饱和。
16、酶基 因猪(-3)、 转植酸酶基因猪(appA)、 MSTN基因敲除猪(MSTN)6种转基因动物， 将标记PCR技 术和毛细管电泳技术联合应用到转基因牛、 猪多重检测中， 同时完成物种鉴定及转基因品 系的10重检测， 与普通PCR相比， 准确、 高效、 快捷， 能够为转基因动物及其产品的检测及监 管提供技术支持。 2)灵敏： 在实现多重检测的同时， 确保了检测方法的敏感性， 检测极限可 达0.1ng。 3)特异： 能够特异性检测到转基因猪和牛， 不与其他物种或非转基因猪、 牛发生交 叉反应， 具有良好的特异性。 说明书 4/8 页 6 CN 104846114 B 6 0027 下面结合说明书。
17、附图和具体实施方式对本发明作进一步说明， 凡依照本发明公开 内容所做的任何本领域的等同替换， 均属于本发明的保护范围。 附图说明 0028 图1.人乳铁蛋白转基因牛(hLF)结果图。 横坐标代表PCR产物及其碱基数， 纵坐标 代表相对荧光信号强度。 图中显示B007、 hLF和B026处有目的产物峰， 说明有目的PCR产物并 且片段长度正确。 0029 图2.人乳清白蛋白转基因牛(hLA)结果图。 横坐标代表PCR产物及其碱基数， 纵坐 标代表相对荧光信号强度。 图中显示hLA、 B007和B026处有目的产物峰， 说明有目的PCR产物 并且片段长度正确。 0030 图3.人溶菌酶转基因牛(h。
18、LY)结果图。 横坐标代表PCR产物及其碱基数， 纵坐标代 表相对荧光信号强度。 图中显示B007、 hLY和B026处有目的产物峰， 说明有目的PCR产物并且 片段长度正确。 0031 图4.转-3脂肪酸去饱和酶基因猪(-3)结果图。 横坐标代表PCR产物及其碱基 数， 纵坐标代表相对荧光信号强度。 图中显示S0386、 S1和S0355处有目的产物峰， 说明有目 的PCR产物并且片段长度正确。 0032 图5.转植酸酶基因猪(appA)结果图。 横坐标代表PCR产物及其碱基数， 纵坐标代表 相对荧光信号强度。 图中显示S2、 S0386和S0355处有目的产物峰， 说明有目的PCR产物并且。
19、 片段长度正确。 0033 图6.MSTN基因敲除猪(MSTN)结果图。 横坐标代表PCR产物及其碱基数， 纵坐标代表 相对荧光信号强度。 图中显示S0386、 S3和S0355处有目的产物峰， 说明有目的PCR产物并且 片段长度正确。 0034 图7.非转基因猪检测结果图。 横坐标代表PCR产物及其碱基数， 纵坐标代表相对荧 光信号强度。 图中显示猪物种特异性基因S0386和S0355处有目的产物峰， 无转基因外源片 段扩增。 0035 图8.非转基因牛检测结果图。 横坐标代表PCR产物及其碱基数， 纵坐标代表相对荧 光信号强度。 图中显示牛物种特异性基因B007和B026处有目的产物峰， 。
20、无转基因外源片段 扩增。 0036 图9.羊检测结果图。 横坐标代表PCR产物及其碱基数， 纵坐标代表相对荧光信号强 度。 图中无任何出峰， 特异性强。 0037 图10.人样品检测结果图。 横坐标代表PCR产物及其碱基数， 纵坐标代表相对荧光 信号强度。 图中显示hLA、 hLY和hLF处有目的产物峰， 无猪和牛物种特异性基因扩增。 具体实施方式 0038 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试 验材料， 如无特殊说明， 均为常规生化试剂供应商购买得到。 0039 实施例1试剂盒的配制和使用 0040 1、 试剂盒的配制组成 0041 多重PCR引物混。
21、合物(5 M)、 PCR缓冲液、 TaqDNA聚合酶、 灭菌纯化水和阳性对照。 其 说明书 5/8 页 7 CN 104846114 B 7 中， PCR缓冲液， 购自全式金生物技术有限公司， 多重PCR引物混合物为表1所示的10对引物 的混合物， TaqDNA聚合酶5U/ L， 购自Roche公司， 阳性对照为： 用表1所示的引物对阳性样品 进行PCR扩增， 分别得到hLA、 hLF、 hLY、 S1、 S2、 S3的PCR扩增产物， 然后将扩增产物与质粒载 体连接， 转化感受态细胞， 进行培养， 经质粒提取、 PCR扩增和序列测定鉴定后获得阳性质 粒， 将六种阳性质粒的混合物作为阳性对照。。
22、 0042 2、 试剂盒的使用方法 0043 2.1基因组提取 0044 用Qiagen公司的基因组提取试剂盒， 获得样品的基因组DNA； 亦可采用现有技术中 已知的提取试剂或自制试剂进行基因组提取。 0045 2.2PCR反应 0046 按照表2， 配制PCR反应体系， PCR反应程序如表3所示。 0047 2.3遗传分析仪毛细管电泳： 在96孔板中每孔加入9 l分子量内标和甲酰胺混合液 (0.5： 8.5)， PCR产物1 l； 95变性3min， 用3730XL测序仪进行检测。 0048 2.4结果描述及判定 0049 将检测得到的原始数据文件导入到分析软件中进行分析， 结果的判读需要数。
23、据分 析人员有相应的经验， 能够分辨不同类型的干扰峰与目的产物峰的差异从而进行结果判 读， 常见的干扰峰有染料脱落峰、 基底杂峰以及内标拉起峰。 附图1-6为人乳铁蛋白转基因 牛(hLF)、 人乳清白蛋白转基因牛(hLA)、 人溶菌酶转基因牛(hLY)、 转-3脂肪酸去饱和酶 基因猪(-3)、 转植酸酶基因猪(appA)和MSTN基因敲除猪(MSTN)6种阳性样品的结果图。 0050 实施例2试剂盒的灵敏度试验 0051 1、 材料 0052 人乳铁蛋白转基因牛样品(hLF)、 人溶菌酶转基因牛样品(hLY)、 人 -乳清蛋白转 基因牛样品(hLA)、 MSTN基因敲除猪组织样品(S3)、 转。
24、植酸酶基因猪组织样品(S2)和转-3 不饱和脂肪酸基因猪组织样品(S1)基因组DNA。 0053 2、 方法 0054 对人乳铁蛋白转基因牛样品(hLF)、 人溶菌酶转基因牛样品(hLY)、 人 -乳清蛋白 转基因牛样品(hLA)、 MSTN基因敲除猪组织样品(S3)、 转植酸酶基因猪组织样品(S2)和转 -3不饱和脂肪酸基因猪组织样品(S1)基因组DNA， 测定浓度后对其进行梯度稀释， 分别稀 释到10ng、 5ng、 1ng、 0.5ng、 0.1ng， PCR扩增后进行检测， 判断试剂盒的灵敏度。 0055 3、 结果 0056 表4灵敏度测试结果 0057 说明书 6/8 页 8 CN。
25、 104846114 B 8 0058 由表4结果可见， hLY样本可以检测到5ng， hLA样本可以检测到1ng， hLF样本可以检 测到0.5ng， S1样本可以检测到0.5ng， S2样本可以检测到0.5ng， S3样本可以检测到0.1ng， 由此可见， 试剂盒最低可以检测到0.1ng的模板量， 灵敏度较高。 实施例3试剂盒的特异性试 验 0059 1、 材料 0060 非转基因猪、 牛、 羊基因组DNA， 人基因组DNA样品， 人乳铁蛋白转基因牛样品 (hLF)、 人溶菌酶转基因牛样品(hLY)、 人 -乳清蛋白转基因牛样品(hLA)、 MSTN基因敲除猪 组织样品(S3)、 转植酸酶。
26、基因猪组织样品(S2)和转-3不饱和脂肪酸基因猪组织样品(S1) 等6种转基因动物基因组DNA. 0061 2、 方法 0062 将上述样品作为模板进行PCR扩增， 用遗传分析仪对PCR产物进行检测。 0063 3、 结果 0064 表5特异性试验结果 0065 0066 0067 根据表5结果可以看出， 非转基因猪和非转基因牛基因组都只扩出了其物种特异 性目的片段， 无外源基因片段扩增； 羊基因组无任何片段扩出； 人基因组有三个片段扩出， 分别是hLF、 hLA、 hLY， 这三个外源基因都是人乳中的蛋白的表达序列， 结果扩增图见附图7- 10； 6种转基因样品基因组分别扩增出了各自的外源基。
27、因和物种特异性基因， 见附图1-6。 该 结果表明该转基因动物多重检测试剂盒的特异性较好。 0068 实施例4： 试剂盒对临床样品的检测 0069 对22份牛样本(10份转基因牛、 12份非转基因牛)， 47份猪样本(15份转基因猪， 32 份非转基因猪)共69份样品进行测定， 结果如表6所示， 根据表6可见， 对69份样品的测定结 果均正确， 说明该试剂盒能够准确的区分转基因猪、 牛和非转基因猪、 牛。 说明书 7/8 页 9 CN 104846114 B 9 0070 表6临床样品测定结果 0071 0072 显然， 本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例， 而并非是对 本发。
28、明的实施方式的限定。 对于所属领域的普通技术人员来说， 在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。 这里无法对所有的实施方式予以穷举。 凡是属于本发 明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。 说明书 8/8 页 10 CN 104846114 B 10 0001 序列表 1/6 页 11 CN 104846114 B 11 0002 序列表 2/6 页 12 CN 104846114 B 12 0003 序列表 3/6 页 13 CN 104846114 B 13 0004 序列表 4/6 页 14 CN 104846114 B 14 0005 序列。
29、表 5/6 页 15 CN 104846114 B 15 0006 序列表 6/6 页 16 CN 104846114 B 16 图1 说明书附图 1/10 页 17 CN 104846114 B 17 图2 说明书附图 2/10 页 18 CN 104846114 B 18 图3 说明书附图 3/10 页 19 CN 104846114 B 19 图4 说明书附图 4/10 页 20 CN 104846114 B 20 图5 说明书附图 5/10 页 21 CN 104846114 B 21 图6 说明书附图 6/10 页 22 CN 104846114 B 22 图7 说明书附图 7/10 页 23 CN 104846114 B 23 图8 说明书附图 8/10 页 24 CN 104846114 B 24 图9 说明书附图 9/10 页 25 CN 104846114 B 25 图10 说明书附图 10/10 页 26 CN 104846114 B 26 。