检测NF1基因第3134号全外显子的方法和引物.pdf

《检测NF1基因第3134号全外显子的方法和引物.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《检测NF1基因第3134号全外显子的方法和引物.pdf（14页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510128497.X (22)申请日 2015.03.24 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104745697 A (43)申请公布日 2015.07.01 (73)专利权人 济南艾迪康医学检验中心有限公 司 地址 250013 山东省济南市天桥区田庄东 路4号2幢 (72)发明人 李文静林筱剑王淑一 (74)专利代理机构 杭州千克知识产权代理有限 公司 33246 代理人 黎双华 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 1。

2、5/11(2006.01) (56)对比文件 WO 2014183122 A1,2014.11.13,全文. 王晓光等.I型神经纤维瘤病NF1基因突变检 测. 中国麻风皮肤病杂志 .2014,第30卷(第4 期),第199-203页. 朱艳慧等.Ion Torrent 测序技术检测 型 神经纤维瘤病患者NF1基因突变. 临床检验杂 志 .2013,第31卷(第11期),第821-825页. 审查员 张蕊 (54)发明名称 检测NF1基因第31-34号全外显子的方法和 引物 (57)摘要 本发明公开了检测NF1基因第31-34号全外 显子的方法、 引物和试剂盒， 所述引物、 试剂盒均 包括扩增覆。

3、盖NF1基因第31-34号全外显子序列 的3对正、 反向引物和3对测序引物。 基于采用 Sanger测序法， 利用所述3对测序引物可用于快 速检测幼年型粒单核细胞白血病患者的NF1基因 第31-34号全外显子序列的突变情况。 权利要求书2页 说明书8页 序列表2页 附图1页 CN 104745697 B 2018.03.20 CN 104745697 B 1.检测NF1基因第31-34号全外显子的引物， 其特征在于， 包括： 扩增覆盖检测NF1基因 第31-34号全外显子的正、 反向引物； 其碱基序列为： NF1_F31 :CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT NF1_R31;GG。

4、GATAAATCAAACCAAAGGAACAC NF1_F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT NF1_R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG NF1_F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT NF1_R34;CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。 2.如权利要求1所述的引物， 其特征在于， 所述引物还包括3对测序引物， 其碱基序列 为： NF1_S-F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT NF1_S-R31;GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC NF1_S-F32-33:ATGAGGACTGATTGAT。

5、TCAGAGTT NF1_S-R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG NF1_S-F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT NF1_S-R34;CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。 3.如权利要求1至2之一所述的引物， 其特征在于， 所述3对正、 反向引物的使用浓度比 为： NF1_F31:NF1_R31=1:1； NF1_F32-33： NF1_R32-33=1:1； NF1_F34： NF1_R34=1:1。 4.如权利要求1至2之一所述的引物， 其特征在于， 所述3对测序引物的使用浓度比为： NF1_S-F31:NF1_S-R31=1:1； NF1_S。

6、-F32-33： NF1_S-R32-33=1:1； NF1_S-F34： NF1_S-R34=1: 1。 5.一种检测NF1基因第31-34号全外显子的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括样品 DNA抽提试剂； 无水乙醇； 检测体系PCR反应液、 测序体系反应液、 阳性对照品、 阴性对照品和 空白对照品， 其中检测体系PCR反应液包括3对扩增引物NF1_F31与NF1_R31， NF1_F32-33与 NF1_R32-33及NF1_F34与NF1_R34， 测序体系包括3对测序引物NF1_S-F31与NF1_S-R31， NF1_ S-F32-33与NF1_S-R32-33， 及NF1_S。

7、-F34与NF1_S-R34， 包括： NF1_F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT NF1_R31;GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC NF1_F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT NF1_R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG NF1_F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT NF1_R34;CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG NF1_S-F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT NF1_S-R31;GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC NF1_S-F32-33:。

8、ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT NF1_S-R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG NF1_S-F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT NF1_S-R34;CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。 6.如权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述检测体系PCR反应液还包括2PCR 权利要求书 1/2 页 2 CN 104745697 B 2 Buffer； dNTPs； KOD FX DNA Polymerase。 7.如权利要求5至6之一所述的试剂盒， 其特征在于， 所述测序体系还包括测序纯化液、 EDTA、 无水乙醇、 75%乙醇、 H。

9、IDI和Bigdye Terminator V3.1。 8.如权利要求5至6之一所述的试剂盒， 其特征在于， 所述测序纯化液包括虾碱性磷酸 酶和核酸外切酶I。 权利要求书 2/2 页 3 CN 104745697 B 3 检测NF1基因第31-34号全外显子的方法和引物 技术领域 0001 本发明属生命科学和生物技术领域， 特别涉及检测NF1基因第31-34号全外显子突 变的引物和方法 背景技术 0002 幼年型粒单核细胞白血病(juvenile myelomonocytic leukemia， JMML)是一种少 见的儿童慢性髓系白血病， 恶性程度高， 兼有骨髓增生异常综合征(myelody。

10、splastic， MDS) 和骨髓增殖性疾病(myeloproliferative disease， MPD)的特征。 目前发现RAS信号通路中 RAS， PTPN11， NF1， CBL 4种基因的突变在JMML患儿中占有极高的比例， 治疗难度大， 靶向治 疗是目前研究的方向。 0003 NF1基因定位于染色体17q11.2,跨距350kb长的基因组DNA,包含60个外显子,可转 录成1113kb的mRNA,其蛋白产物为神经纤维瘤素。 其中8 457bp的读码框架， 编码包含 2818个氨基酸的神经纤维蛋白,相对分子质量为327103。 NF1基因这样大的长度与其很高 的自发突变率及临床表。

11、现的复杂性相一致。 NF1基因突变类型呈多样化,包括碱基置换、 插 入突变、 缺失突变、 重复突变、 无义突变、 错义突变、 框架漂移等均有报道,大部分突变产生 截短蛋白,仅有10与氨基酸替代有关， 国外研究结果显示,NF1基因并不存在突变热点。 0004 型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type 1， NF1)NF1是一种常染色体遗传病， 临床特点为:多系统、 多器官损伤， 主要特征为皮肤牛奶咖啡斑和多发性皮肤软组织纤维 瘤， 由NF1基因突变引起。 NF1患儿具有极高的并发髓系肿瘤风险， 尤其是， JMML， 并且相对未 发生NF1者， JMML患儿年龄偏大， 有文献报。

12、道， 诊断JMML者， 约11伴有NF1， 无NF1者约10 15存在NF1基因缺失。 近来Steinemann等研究发现， 合并NF1的15例JMML患儿2/3存在杂 合子NF1基因缺失， 且绝大多数该基因染色体存在单亲二倍体， 少数为染色体中间缺失， 剩 余1/3患儿存在复合杂合子突变， 进一步证实了NF1功能缺失在NF1发展为JMML中起重要作 用。 0005 幼年型粒单核细胞白血病(juvenile myelomonocytic leukemia， JMML)是一种少 见的儿童慢性髓系白血病， 占儿童期白血病的12。 国外文献报道JMML的年发病率为 (0.120.30)/(1104)。

13、， 美国每年新发JMML为2550例， 我国迄今尚无关于JMML发病率研 究的确切流行病学资料。 目前发现RAS信号通路中RAS， PTPN11， NF1， CBL4种基因的突变在 JMML患儿中占有极高的比例， 治疗难度大， 靶向治疗是目前研究的方向。 RAS、 PTPN11、 NF1及 CBL4种基因突变约占JMML患儿8085， 其中PTPN11约占35， NF约占11， KRAS、 NRAS 两者占1730， CBL占1017。 诊断JMML者， 约11伴有NF1， 无NF1者约1015 存在NF1基因缺失。 0006 多种基因突变检测技术包括蛋白截断试验(PTT)、 单链构象多态性(。

14、SSCP)、 异源双 链分析(HA)、 变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)等均被应用于NF1基因 突变的检测,但所有这些方法均有一定的局限性,从而限制了基因突变的检出率。 目前常用 的基因突变检测的方法是基因测序和荧光定量PCR等。 由于NF1基因容量大、 突变类型多、 突 说明书 1/8 页 4 CN 104745697 B 4 变率高、 突变位点散在分布,故而阻止了对NF1基因突变的深入研究， 荧光定量PCR法并不适 用。 0007 本发明采用Sanger测序法检测NF1基因第31-34号全外显子序列的突变， 并且设计 的引物可以扩展整个第31， 32,33,34号。

15、全外显子序列， 通过测序结果的分析， 可以很直观的 了解NF1基因第31-34号全外显子的基因突变情况， 并不受NF1基因的基因突变多样化以及 没有突变热点的影响， 并且很大程度的节省了检测成本。 发明内容 0008 本发明提供检测NF1基因第31-34号全外显子的引物， 采用Sanger测序法， 可用于 快速检测JMML患者体内检测NF1基因第31-34号全外显子突变的情况。 0009 本发明的目的在于提供检测NF1基因第31-34号全外显子的引物， 包括： 扩增覆盖 检测NF1基因第31-34号全外显子突变的3对正、 反向引物； 其碱基序列为： 0010 NF1_F31:CCTCAAATT。

16、CACTTGGAGAGAGTT 0011 NF1_R31； GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC 0012 NF1_F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT 0013 NF1_R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG 0014 NF1_F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT 0015 NF1_R34； CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。 0016 进一步地， 所述引物还包括3对测序引物， 其碱基序列为 0017 NF1_S-F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT 0018 NF1_S-R31； GGGA。

17、TAAATCAAACCAAAGGAACAC 0019 NF1_S-F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT 0020 NF1_S-R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG 0021 NF1_S-F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT 0022 NF1_S-R34； CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。 0023 进一步地， 所述3对正、 反向引物的使用浓度比为： NF1_F31:NF1_R311:1； NF1_ F32-33： NF1_R32-331:1； NF1_F34： NF1_R341:1。 0024 进一步地， 所述3对测序引物。

18、的使用浓度比为： 0025 NF1_S-F31:NF1_S-R311:1； NF1_S-F32-33： NF1_S-R32-331:1； NF1_S-F34： NF1_S-R341:1。 0026 本发明的目的还在于提供一种检测NF1基因第31-34号全外显子的方法， 其包括如 下步骤： 0027 (1)提取样品DNA； 0028 (2)利用3对扩增引物NF1_F31与NF1_R31， NF1_F32-33与NF1_R32-33， 及NF1_F34与 NF1_R34对(1)中的DNA进行扩增， 获得覆盖检测NF1基因第31-34号全外显子突变的得扩增 产物； 0029 (3)利用3对测序引物N。

19、F1_S-F31与NF1_S-R31， NF1_S-F32-33与NF1_S-R32-33， 及 NF1_S-F34与NF1_S-R34对(2)中的扩增产物进行正向和反向测序， 获得所述扩增产物的基 因序列； 说明书 2/8 页 5 CN 104745697 B 5 0030 (4)将(3)中的基因序列与野生型RUNX1基因序列进行比较， 确定突变位点是否存 在； 其中所述引物序列为： 0031 NF1_F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT 0032 NF1_R31； GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC 0033 NF1_F32-33:ATGAGGACTGA。

20、TTGATTCAGAGTT 0034 NF1_R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG 0035 NF1_F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT 0036 NF1_R34； CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG 0037 NF1_S-F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT 0038 NF1_S-R31； GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC 0039 NF1_S-F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT 0040 NF1_S-R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG 0041 NF1_S-。

21、F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT 0042 NF1_S-R34； CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG 0043 本发明的目的还在于提供一种检测NF1基因第31-34号全外显子的试剂盒， 其特征 在于， 所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂； 无水乙醇； 检测体系PCR反应液、 测序体系反应液、 阳性对照品、 阴性对照品和空白对照品， 其中检测体系PCR反应液包括3对扩增引物NF1_F31 与NF1_R31， NF1_F32-33与NF1_R32-33及NF1_F34与NF1_R34， 测序体系包括3对测序引物 NF1_S-F31与NF1_S-R31， NF1_S-F32-3。

22、3与NF1_S-R32-33， 及NF1_S-F34与NF1_S-R34， 包括： 0044 NF1_F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT 0045 NF1_R31； GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC 0046 NF1_F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT 0047 NF1_R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG 0048 NF1_F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT 0049 NF1_R34； CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG 0050 NF1_S-F31:CCTCAAATTCACTTG。

23、GAGAGAGTT 0051 NF1_S-R31； GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC 0052 NF1_S-F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT 0053 NF1_S-R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG 0054 NF1_S-F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT 0055 NF1_S-R34； CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG 0056 进一步地， 所述检测体系PCR反应液还包括2PCR Buffer； dNTPs； KOD FX DNA Polymerase。 0057 进一步地， 所述测序体系还包括测。

24、序纯化液、 EDTA、 无水乙醇、 75乙醇、 HIDI和 Bigdye Terminator V3.1。 0058 进一步地， 所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。 0059 本发明设计了扩增覆盖检测NF1基因第31-34号全外显子的3对正、 反向引物， 以及 对所获得的扩增产物进行正反向测序的3对测序引物。 对送检样本进行PCR扩增， 采用 Sanger测序法， 对PCR产物进行正反向测序反应扩增、 纯化后变性、 直接测序可以全面地检 说明书 3/8 页 6 CN 104745697 B 6 测NF1基因第31-34号全外显子序列的突变情况。 通过调整正反向引物的浓度、 退火温度。

25、等 反应条件， 可使扩增效率达到最佳。 0060 有益效果： 利用本发明所述扩展引物和测序引物， 可以扩展整个第31、 32、 33、 34号 全外显子序列， 通过测序结果的分析， 可以很直观的了解NF1基因第31-34号全外显子的基 因突变情况， 并不受NF1基因突变多样化以及没有突变热点的影响， 可覆盖待检测的所有突 变位点； 具有很高的特异性及准确性； 采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多态 性， 具有灵敏度高， 操作简单、 成本低等优点。 附图说明 0061 图1样品1的检测结果图。 0062 图2样品2的检测结果图。 0063 图3样品3的检测结果图。 0064 图4样品4的。

26、检测结果图。 具体实施方式 0065 下面结合具体实施例和附图， 进一步阐述本发明。 应当注意的是， 实施例中未说明 的常规条件和方法， 通常按照所属领域实验人员常规采用方法： 譬如， 奥斯柏和金斯顿主编 的 精编分子生物学实验指南 第四版， 或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。 0066 实施例1 0067 检测NF1基因第31-34号全外显子的引物， 包括： 扩增覆盖检测NF1基因第31-34号 全外显子的3对正、 反向引物； 所述扩展引物的碱基序列为： 0068 NF1_F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT 0069 NF1_R31； GGGATAAATCAAACCA。

27、AAGGAACAC 0070 NF1_F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT 0071 NF1_R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG 0072 NF1_F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT 0073 NF1_R34； CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。 0074 优选地， 所述引物还包括3对测序引物， 其碱基序列为 0075 NF1_S-F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT 0076 NF1_S-R31； GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC 0077 NF1_S-F32-33:ATGAGGA。

28、CTGATTGATTCAGAGTT 0078 NF1_S-R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG 0079 NF1_S-F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT 0080 NF1_S-R34； CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG。 0081 在检测中， 先利用上述3对正、 反向引物对覆盖检测NF1基因第31-34号全外显子的 DNA片段进行扩增， 获得扩增产物， 然后利用上述3对测序引物对扩增产物进行测序， 获得扩 增产物的基因序列。 0082 在引物设计上， 所设计的每对引物都位于所要扩增的外显子序列两侧， 即扩增区 域包括了该外显子的全部序列。 因为NF。

29、1基因的突变位点很多， 突变类型不定。 因此本发明 说明书 4/8 页 7 CN 104745697 B 7 所述引物既能将所述全部外显子序列都扩增出来， 也保证无论外显子的何处位置发生突 变， 都不会出现漏检的情况。 因为第32和33号外显子序列都较短， 在基因序列中的位置分别 是168368-168526,169056-169153， 中间的内含子序列也只有530bp， 因此本发明在检测第 32和33号外显子时， 采用同一对扩展引物和测序引物。 0083 检测NF1基因第31-34号全外显子的试剂盒， 包括： 组织DNA抽提试剂盒(例如使用 天根生物的提取试剂盒)； 无水乙醇； 检测体系P。

30、CR反应液、 测序体系反应液、 阳性对照品、 阴 性对照品和空白对照品， 其中 0084 检测体系PCR反应液包括： 2PCR Buffer； 2mM dNTPs； KOD FX DNA Polymerase (1U/ l)； 检测目的基因用的3对上、 下游引物NF1_F31(10 m)与NF1_R31(10 m)， NF1_F32-33 (10 m)与NF1_R32-33(10 m)， 及NF1_F34(10 m)与NF1_R34(10 m)。 0085 测序体系包括： 测序纯化液、 EDTA(125mmol)、 无水乙醇、 75乙醇、 HIDI(高度去离 子甲酰胺)、 测序引物： NF1_。

31、S-F31(3.2 m)与NF1_S-R31(3.2 m)， NF1_S-F32-33(3.2 m)与N F1_S-R32-33(3.2 m)， 及NF1_S-F34(3.2 m)与NF1_S-R34(3.2 m)， 以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)， 其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP) 0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U。 0086 检测体系PCR反应液配制如下： 0087 说明书 5/8 页 8 CN 104745697 B 8 0088 其中， NF1_F31与NF1_R31， NF1_F32-33与N。

32、F1_R32-33， 及NF1_F34与NF1_R34的碱基 序列为： 0089 NF1_F31:CCTCAAATTCACTTGGAGAGAGTT 0090 NF1_R31； GGGATAAATCAAACCAAAGGAACAC 0091 NF1_F32-33:ATGAGGACTGATTGATTCAGAGTT 0092 NF1_R32-33:AACAGAGCAACTGAGTAAGTGG 0093 NF1_F34:GTGTGAACAAGCCCTCCAT 0094 NF1_R34； CTTAGTCCAAGAAGATGCAAAG 0095 阳性对照品： 含有NF1序列的溶液。 0096 阴性对照品： 。

33、无NF1序列的溶液。 0097 空白对照品： 2 l生理盐水或不加任何物质。 0098 实施例2 0099 血液DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程： 0100 (1)抽提血液中的基因组DNA: 0101 1)抽取500uL血液加入1000uL红细胞裂解液， 颠倒混匀， 室温放置5分钟， 期间再颠 倒混匀几次。 3000rpm离心5min， 吸去上清， 留下白细胞沉淀， 加200uL缓冲液GA， 振荡至彻底 混匀。 0102 2)加入20 l蛋白酶K溶液， 混匀。 0103 3)加入200 l缓冲液GB， 充分颠倒混匀， 70放置10分钟， 溶液应变清亮， 简短离心 以去除管盖内壁的水珠。 。

34、0104 4)加入200 l无水乙醇， 充分振荡混匀15秒， 此时可能会出现絮状沉淀， 简短离心 以去除管盖内壁的水珠。 0105 5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管 中)， 12,000rpm(13,400g)离心30秒， 倒掉废液， 将吸附柱CB3放回收集管中。 0106 6)向吸附柱CB3中加入500 l缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm(13,400g)离心30秒， 倒掉废液， 将吸附柱CB3放入收集管中。 0107 7)向吸附柱CB3中加入700 l漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000r。

35、pm(13,400g)离心30秒， 倒掉废液， 将吸附柱CB3放入收集管中。 0108 8)向吸附柱CB3中加入500 l漂洗液PW， 12,000rpm(13,400g)离心30秒， 倒掉废 液。 0109 9)将吸附柱CB3放回收集管中， 12,000rpm(13,400g)离心2分钟， 倒掉废液。 将吸 附柱CB3置于室温放置数分钟， 以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 0110 10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中， 向吸附膜的中间部位悬空滴加100 l 洗脱缓冲液TE， 室温放置2-5分钟， 12,000rpm(13,400g)离心2分钟， 将溶液收集到离心管 中。 0111 。

36、(2)试剂配置： 按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X l， 每人份18 l分装： 0112 X18 l反应液(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照) 0113 n为检测标本数。 0114 (3)加样： 加入3个检测体系PCR反应液中各2 l DNA； 阳性对照和阴性对照直接加2 说明书 6/8 页 9 CN 104745697 B 9 l阳性对照品和阴性对照品； 空白对照加2 l生理盐水或不加任何物质。 0115 (4)扩增： 检测在常规PCR仪上进行， 可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems公司)等。 反应条件如下： 0116 0117。

37、 (5)sanger测序： 0118 取9 l PCR产物与2 l纯化体系。 按照以下程序进行纯化： 0119 0120 将1 l纯化产物分别与测序引物： NF1_S-F31(3.2 m)与NF1_S-R31(3.2 m)， NF1_S- F32-33(3.2 m)与NF1_S-R32-33(3.2 m)， 及NF1_S-F34(3.2 m)与NF1_S-R34(3.2 m)按照如 下体系进行混合： 0121 0122 测序反应程序： 说明书 7/8 页 10 CN 104745697 B 10 0123 0124 沉淀环节： 0125 向完成测序反应的产物中加入2 l 125mmol的EDT。

38、A， 静置5min； 加入15ml无水乙 醇， 漩涡混匀； 3700rpm离心30min； 倒置离心15sec， 加入50ml70乙醇， 漩涡混匀； 3700rpm 离心15min； 倒置离心15sec， 置于95金属浴上； 加入10 l HIDI后进行变性试验。 变性程 序： 0126 0127 变性程序结束后， 上测序仪(ABI3730)测序。 0128 (7)结果判断： 将测序结果与野生型参考序列(GeneBank No.:NG_009018.1)进行 比对， 根据实际突变情况对结果进行报告。 0129 实施例3 0130 取临床幼年型粒单核细胞白血病患者样本4份， 4份样本都不伴有 型。

39、神经纤维瘤 病(NF1)的症状， 检测该4份样本是否存在NF1基因突变。 按实施例2所述方法提取基因组、 配 制试剂并检测。 每份样品加入检测体系PCR反应液中2 l。 同时做阳性， 阴性， 空白对照各一 份。 用普通PCR仪检测， 时间为160分钟。 0131 样品1的第31号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示， 为野生型， 未检测 出NF1突变。 0132 样品2的第32号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示， 为野生型， 未检测 出NF1突变。 0133 样品3的第33号全外显子序列的部分正向测序结果如图1所示， 为野生型， 未检测 出NF1突变。 0134 样品4的第34号全。

40、外显子序列的部分正向测序结果如图1所示， 为野生型， 未检测 出NF1突变。 0135 从检测结果可以看出， 本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了， 能够扩展 出NF1基因第31-34号全外显子， 并且测序结果完全准确。 本发明所述引物可以准确的扩展 出NF1基因第31-34号全外显子， 无论是野生型还是突变型。 对阳性标本的检测表明本发明 所述引物和方法及试剂盒能够检测出NF1基因突变。 说明书 8/8 页 11 CN 104745697 B 11 0001 SEQUENCE LISTING 0002 济南艾迪康医学检验中心有限公司 0003 检测NF1基因第31-34号全外显子的方法和。

41、引物 0004 0005 6 0006 PatentIn version 3.3 0007 1 0008 24 0009 DNA 0010 人工序列 0011 1 0012 cctcaaattc acttggagag agtt 24 0013 2 0014 25 0015 DNA 0016 人工序列 0017 2 0018 gggataaatc aaaccaaagg aacac 25 0019 3 0020 24 0021 DNA 0022 人工序列 0023 3 0024 atgaggactg attgattcag agtt 24 0025 4 0026 22 0027 DNA 0028 人工序列 0029 4 0030 aacagagcaa ctgagtaagt gg 22 0031 5 0032 19 0033 DNA 0034 人工序列 0035 5 0036 gtgtgaacaa gccctccat 19 0037 6 0038 22 序列表 1/2 页 12 CN 104745697 B 12 0039 DNA 0040 人工序列 0041 6 0042 cttagtccaa gaagatgcaa ag 22 序列表 2/2 页 13 CN 104745697 B 13 图1 图2 图3 图4 说明书附图 1/1 页 14 CN 104745697 B 14 。