技术领域
本发明涉及源自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的新型启 动子核酸分子、包括所述启动子的重组载体、用所述重组载体转化的宿主细 胞和利用所述宿主细胞表达靶基因的方法。
背景技术
棒状细菌已广泛用于生成在动物饲料、制药、食品等工业中具有多种应 用的化学物质，包括L-赖氨酸、L-苏氨酸和多种核酸。为了利用遗传工程和 代谢工程技术由所述棒状细菌开发高产率菌株，需要选择性调节棒状细菌中 多种代谢途径中涉及的基因的表达，并且由此需要有效用于这些基因调节的 启动子。
分离启动子的常规方法包括：(1)使用启动子探针载体随机克隆仅在克 隆的片段包含启动子活性时表达的报道基因上游的基因组DNA片段的方法； (2)利用基于基因-特异性探针的杂交法从基因文库中分离基因及其启动子的 方法；和(3)利用可诱导的cDNA探针和非-可诱导的cDNA探针的基因文 库差示杂交。
在棒状细菌中的基因表达中，基因通常在它们原始启动子的控制下表达 (Vasicova，P.，等，细菌学杂志(J.Bacteriol.)，181，6188-6191，(1999)，等)。 然而，与其他工业微生物诸如大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)等不同，用于在棒状细菌中基因表达的启动子序列的典型 结构尚是未知的。因此，通过以下步骤开发用于棒状细菌中的启动子：从与 对抗生素诸如氯霉素的抗性相关的基因中消除启动子区，利用合适的限制性 消化向该启动子位点引入从棒状细菌中分离的染色体DNA片段，用由此生成 的DNA分子转化棒状细菌，和评估获得的菌株的抗生素抗性(Eikmanns，B.J.， 等，基因(Gene)，102，93-98，(1991)；Patek，M.，等，微生物学(Microbiology)， 142，1297-1309，(1996))。然而，常规开发的启动子序列仍需要针对基因表达的 选择性、基因表达效率等进行改进。
我们通过下列步骤开发源自谷氨酸棒杆菌的新型启动子核酸分子：搜索 并通过聚合酶链反应(PCR)扩增推定的启动子区，将所述推定的启动子引入 到缺乏启动子的lysC基因的起始位点，和通过赖氨酸的生成确定lysC活性的 变化从而选择有效的启动子。
发明内容
技术问题
本发明提供源自谷氨酸棒杆菌的新型启动子核酸分子。
本发明还提供包括源自谷氨酸棒杆菌的新型启动子核酸分子的重组载 体。
本发明还提供用包括源自谷氨酸棒杆菌的新型启动子核酸分子的重组载 体转化的宿主细胞。
本发明还提供利用用包括源自谷氨酸棒杆菌的新型启动子核酸分子的重 组载体转化的宿主细胞表达靶基因的方法。
技术方案
按照本发明的一方面，提供具有SEQ ID NO：1或2核苷酸序列的启动子 核酸分子。
按照本发明的启动子核酸分子的核苷酸序列可以通过若干近期开发的技 术诸如定向进化或位点-指导的诱变之一被修饰到一定程度。本领域中的那些 技术人员应该容易理解与本发明的启动子序列具有70％或更高同源性的核苷 酸序列等价于本发明的启动子，条件是其保持表达靶基因的启动子活性。
因此，按照本发明的启动子核酸分子可以包括与SEQ ID NO：1或2的核 苷酸序列具有70％或更高同源性并且可以作为启动子使用的核苷酸序列。
术语“同源性”用于本文中表示与野生型核酸序列的序列相同的程度。 本发明的启动子可以包括具有这样的DNA序列的启动子，所述DNA序列与 本发明的新型启动子的核苷酸序列75％或更高，优选85％或更高，更优选90％ 或更高和最优选95％或更高地相同。同源性可以由肉眼或使用商购软件进行 比较。根据商购软件程序，可以以百分数(％)计算两种或更多序列之间的同 源性，并且可以计算相邻序列之间的同源性(％)。
另外，本发明的启动子核酸分子可以包括源自谷氨酸棒杆菌的启动子核 酸分子，其选自由包括与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列的启动子组成的 组。
术语“互补”用于本文中，表示核苷酸或核酸之间，例如，双链DNA分 子的两条链之间或寡核苷酸引物和待测序或扩增的单链核酸模板的引物结合 位点之间可能的杂交或碱基配对。
另外，本发明源自谷氨酸棒杆菌的启动子核酸分子包括源自谷氨酸棒杆 菌的启动子核酸分子的功能等价物。包括其功能片段的本发明启动子的功能 等价物可以包括具有至少一个碱基取代、缺失、插入或其组合的变体。
本发明的谷氨酸棒杆菌启动子核酸分子是源自棒状细菌的启动子，且优 选有效用作在原核细胞，具体地大肠杆菌和棒状细菌中表达目的基因的启动 子。
术语“启动子”用于本文中，表示RNA聚合酶与其结合从而起始基因转 录的DNA区域，其位于mRNA转录起始位点的上游，到5’方向。
具有本发明SEQ ID NO：1或2核苷酸序列的本发明启动子可以是基因 NCgl1504(SEQ ID NO：11)和基因NCgl1305(SEQ ID NO：12)的启动子，所述 基因是通过分析谷氨酸棒杆菌ATCC13032的约3000个基因的基因表达量选 择的。
在本文中，“具有核苷酸序列NCgl1504的基因”和“具有核苷酸序列 NCgl1305的基因”不仅指源自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032分别具有SEQ ID NOS：11和12核苷酸序列的基因，还指在属于棒杆菌(Corynebacterium)属 的微生物中表达与由NCgl1504或NCgl1305表达的那些基本相同的产物的基 因。术语“NCgl1504基因”和“NCgl1305基因”分别指“具有核苷酸序列 NCgl1504的基因”和“具有核苷酸序列NCgl1305的基因”。术语“基本相同” 用于本文中，表示活性和调节机制。具有核苷酸序列NCgl1504的基因可以是 具有SEQ ID NOS：11的核苷酸序列的基因，且具有核苷酸序列NCgl1305的 基因可以是具有SEQ ID NO：12的核苷酸序列的基因。
按照本发明的启动子核酸分子可以利用标准分子生物学技术，例如通过 使用适当引物序列的PCR分离或制备。其还可以通过使用自动化DNA合成 器的标准合成技术制备。
本发明还通过包括具有SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列的启动子和与所 述启动子可操作性连接的靶基因的编码序列的重组载体。
术语“载体”用于本文中，表示包括这样的DNA序列的DNA构建体， 所述DNA序列与适用于在合适的宿主细胞中表达的控制序列可操作性连接。 所述合适的控制序列包括指导转录的启动子、调节所述转录的任意操纵基因 序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和用于转录和翻译的序列。 所述载体可以是质粒、噬菌体粒子或仅是潜在的基因组插入物。当载体转化 相容的宿主时，该载体可以独立于宿主基因组进行复制和起作用，或在一些 情形中可以整合到宿主的基因组中。术语“可操作性连接的”用于本文中， 表示待表达的基因与其控制序列功能性连接，以使该基因正确表达。
包括按照本发明的谷氨酸棒杆菌启动子核酸分子的重组载体可以与编码 多种蛋白质的基因可操作性连接，从而重组地产生靶蛋白。欲使用本发明的 载体表达的靶基因可以是编码天冬氨酸激酶的lysC、编码二氢吡啶二羧酸还 原酶的dapB等，但并不仅限于此。
按照本发明的靶基因可以是编码天冬氨酸激酶的lysC。编码天冬氨酸激 酶的lysC可以具有SEQ ID NO：13的碱基序列(Ikeda等，微生物学和生物技术 应用(Appl Microbiol Biotechnol.)2002年2月；58(2)：217-23使用谷氨酸棒杆 菌基因组信息产生新型L-赖氨酸-生成突变体的新方法学(A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome information to generate a new L-lysine-producing mutant))。
按照本发明的重组载体可以是pDZ-NCgl1504-lysC，其包括具有与作为靶 基因的lysC编码序列(SEQ ID NO：13)可操作性连接的SEQ ID NO：1的核苷酸 序列的启动子。所述重组载体还可以是pDZ-NCgl1305-lysC，其包括具有与作 为靶基因的lysC编码序列(SEQ ID NO：13)可操作性连接的SEQ ID NO：2的核 苷酸序列的启动子。
本发明还提供用重组载体转化的宿主细胞，所述重组载体包括具有SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列的启动子。
所述宿主细胞，例如，原核细胞，优选大肠杆菌和棒状细菌，和更优选 棒状细菌可以被制备的重组载体转化，以使谷氨酸棒杆菌启动子核酸分子与 编码靶蛋白的基因可操作性连接，从而表达该靶蛋白。
所述“棒状细菌”可以是属于棒杆菌属或短杆菌(Brevibacterium)属的细菌， 具体地，谷氨酸棒杆菌，和更具体地，谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。本发明的 棒状细菌可以包括棒杆菌属的其他菌株，Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067，乳发酵短 杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869及其生成L-氨基酸的突变 体、或谷氨酸棒杆菌KFCC 10881，谷氨酸棒杆菌KFCC 11001等。
术语“转化”用于本文中，表示以这样的方式将DNA引入宿主中，所述 方式是其能够作为染色体外元件或通过染色体整合进行复制。
宿主细胞可以是用这样的重组载体转化的棒杆菌，所述重组载体包括具 有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的启动子和与所述启动子可操作性连接的lysC (SEQ ID NO：13)。宿主细胞可以优选地是谷氨酸棒杆菌(保藏号KCCM 10831)。
宿主细胞还可以是用这样的重组载体转化的棒杆菌，所述重组载体包括 具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的启动子和与所述启动子操作连接的lysC (SEQ ID NO：13)。宿主细胞可以优选地是谷氨酸棒杆菌(保藏号KCCM 10830)。
本发明还提供表达靶基因的方法，所述方法包括培养用具有源自谷氨酸 棒杆菌的启动子核酸分子的重组载体转化的宿主细胞。
与具有SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列的启动子可操作性连接的靶基因 可以是编码与合成终产物诸如赖氨酸和苏氨酸相关的蛋白质的基因。术语“表 达靶基因”用于本文中，表示生成合成途径I的终产物，所述合成途径I涉及 由靶基因编码的蛋白质。因此，表达靶基因的方法可以是通过培养用包括所 述靶基因的重组载体转化的宿主而生成合成途径的终产物的方法，在所述合 成途径中涉及由所述靶基因编码的蛋白质。
所述最终产物可以是赖氨酸。即本发明可以提供生成赖氨酸的方法，其 包括培养由重组载体转化的宿主细胞，所述重组载体包括编码赖氨酸合成中 涉及的蛋白质的lysC和与该基因可操作性连接的具有SEQ ID NO：1或2的核 苷酸序列的启动子。
在按照本发明的赖氨酸合成方法中，所述宿主细胞可以是由重组载体转 化的谷氨酸棒杆菌KCCM 10831或棒状细菌(Coryneform bacterium)KCCM 10830，所述重组载体包括与靶基因，即SEQ ID NO：13的lysC可操作性连接 的具有SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列的启动子。
转化的宿主细胞(转化体)的培养可以按照本领域中常用的方法进行。 已知的培养方法记述在Chmiel，(Bioprozesstechnik 1.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)；和Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag， Braunschweig/Wiesbaden，1994))中。
用于该培养的培养基需要达到以适当方式生长特定菌株的要求。用于棒 杆菌菌株的培养基公开在，例如，常规细菌学方法手册(Manual of Methods for General Bacteriology)，美国细菌学协会(American Society for Bacteriology).华 盛顿，美国，1981中。培养基的碳源可以是碳水化合物诸如葡萄糖、蔗糖、乳 糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素，油和脂肪诸如豆油、葵子油、蓖麻由(caster oil)和椰油，脂肪酸诸如棕榈酸、硬脂酸和亚麻酸，醇诸如甘油和乙醇，和 有机酸诸如乙酸。碳源可以单独或混合使用。氮源也可以是蛋白胨、酵母提 取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，或无机化合物，例 如，硫酸铵、硫化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可以单独或混合使用。 磷源可以是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或其钠盐。另外，所述培养基应该包含 生长所必需的金属盐，诸如硫酸镁或硫酸铁。最后，所述培养基还可以包括 生长的必需物质，诸如氨基酸和维生素。另外，还可以向培养基中加入合适 的前体。培养基的那些成分可以在培养过程中一批或基于持续的加入到培养 基中。
培养基的pH可以使用碱性化合物诸如氢氧化钠、氢氧化钾和氨水，或酸 性化合物诸如磷酸或硫酸，以适当的方式调节。另外，利用防沫剂诸如脂肪 酸聚乙二醇酯可以防止泡沫形成。氧或含-氧气体，例如空气，可以引入到培 养基中，从而维持充气状态。培养基的温度可以在20-45℃，和优选25-40℃ 的范围内。持续培养直至生成的靶物质的量达到其最大值。通常，培养进行 10-160小时。
将参考下列实施例更详细地描述本发明。下列实施例仅是为了举例说明 的目的，且不意欲限制本发明的范围。
有利效果
按照本发明，提供源自谷氨酸棒杆菌的新型启动子核酸序列以用于有效 表达目的基因。
附图说明
本发明的以上和其他目的、特征和其他优点将通过以下结合附图的详细 说明得到更加清楚的理解，在所述附图中：
图1示意性显示按照本发明的实施方案，为了研究启动子活性制备载体 的过程。
发明模式
实施例1：制备包括新型启动子序列的重组载体
1.选择关于源自谷氨酸棒杆菌的新型启动子的候选基因
在5L发酵器中培养谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，并收集细胞。利用基因 组DNA芯片(cDNA芯片，Genomictree，公司，韩国)确定谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的约3000种基因的mRNA表达水平。将基于总基因组表达分别占0.88％ 和0.43％的NCgl1504和NCgl1305基因选作本发明新型启动子的候选基因。
2.扩增推定的启动子区的DNA片段
谷氨酸棒杆菌基因组的核苷酸序列是已经完全确定并公知的(微生物学和 生物技术应用(Appl.Microbiol.Biotechnol.)，62(2-3)，99-109(2003)：GenBank 登记号NC_003450)。蛋白质(NCgl1504和NCgl1305)的序列信息获自全国卫 生研究所(NIH)Genbank(美国)数据库。为了扩增位于各种基因开放阅读 框(ORF)上游的推定的启动子区(SEQ ID NO：1-NCgl1504的启动子区，SEQ ID NO：2-NCgl1305的启动子区)，基于报告的核苷酸序列合成包括 EcoRV/BamHI和NdeI限制性位点的引物1-4。在PCR中，利用谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032的染色体DNA作为模板，分别使用引物1和2(SEQ ID NOS：3 和4)和引物3和4(SEQ ID NOS：5和6)，以30个94℃变性，55℃退火1分 钟和72℃聚合30秒的循环，扩增NCgl1504和NCgl1305基因的推定的启动 子区[Sambrook等，分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning，a Laboratory Manual)(1989)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratories)]。
3.制备用于染色体整合从而确定启动子活性的重组载体
为了确定获得的NCgl1504和NCgl1305的推定的启动子区在棒杆菌染色 体中活性，我们使用载体pDZ进行染色体整合(韩国专利申请号 1-2006-089672)，它是由Cheiljedang株式会社利用pACYC177(新英格兰生物 实验室(New England Biolab)，GenBank accetion#X06402)，即一种大肠杆菌 的克隆载体作为基本载体开发的。为了将基因插入棒杆菌染色体中，将具有 SEQ ID NOS：1或2的核苷酸序列的新型启动子插入到lysC起始位点前，从 而分别获得pDZ-Ncgl1504-lysC或pDZ-Ncgl1305-lysC载体。
以下列方式制备重组载体，其中将NCgl1504和NCgl1305的推定的启动 子位点插入到lysC基因中。为了扩增SEQ ID NO：13的lysC，将谷氨酸棒杆 菌ATCC 13032的染色体DNA用作模板，并利用引物5和6(SEQ ID NOS：7 和8)以及引物7和8(SEQ ID NOS：9和10)进行PCR(PCR条件：30次94℃ 变性，55℃退火1分钟和72℃延伸30秒的循环)。用EcoRV和Klenau消化 利用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)扩增的LysC片段，这两个平端片段连接， 并克隆到pCR2.1-lysC中。然后，利用EcoRV和NdeI裂解pCR.2.1-lysC和 NCgl1504或NCgl1305的启动子位点，并利用DNA连接酶将SEQ ID NO：1 或2的新型启动子插入到该限制性位点。然后，将克隆的片段转移到pDZ载 体中，从而制备pDZ-Ncgl1504-lysC和pDZ-Ncgl1305-lysC载体，如图1中 所示。
实施例2.用包括新型启动子序列的重组菌株转化
如微生物学和生物技术应用(Appl.Microbiol.Biotechnol.)(1999) 52：541-545中所公开地，利用制备的重组载体pDZ-NCgl1504-lysC或 pDZ-NCgl1305-lysC，通过电脉冲转化谷氨酸棒杆菌KFCC 10881，即L-赖氨 酸-生成菌株。在包含25mg/L卡那霉素(10g/L牛肉提取物，10g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，3.7g/L脑心浸液(BHI)和9.1g/L山梨糖醇)的 选择性培养基中选择转化的菌株，其中反应器上的新型启动子通过同源重组 整合到染色体中。根据该菌株是否在包括X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳 糖苷)的固体培养基中变蓝，可以鉴定载体的插入。在营养培养基中，通过摇 动，在30℃培养这样的菌株8小时，在所述菌株中载体通过第一次交叉插入 到染色体中，分别稀释将其到10-4-10-10并涂布到包括X-半乳糖的固体培养基 上。大多数菌落显示出蓝色，且在其中通过第二次交叉去除插入的载体序列 的菌株通过选择白色菌落筛选。利用针对卡那霉素的易感性，鉴定并通过测 序完全证实所选择的菌落。将其中lysC基因的启动子被Ncgl1504代替的菌株 称为CA01-0037，且将其中lysC基因的启动子被Ncgl1305代替的菌株称为 CA01-0036，且它们于2006年12月28日，分别以KCCM 10831和KCCM 10830 保藏在韩国微生物培养中心(Korean Culture Center of Microorganisms)。
实施例3：棒杆菌中启动子序列的活性
培养转化的菌株，从而按下述分析启动子序列的活性。
以1∶20的比例，将各种转化的谷氨酸棒杆菌菌株接种到装有25ml培养基 [20g葡萄糖，5g硫酸铵，5g酵母提取物，1.5g尿素，4g KH2PO4，8g K2HPO4， 0.5g MgSO4 7H2O，150μg生物素，1.5mg盐酸硫胺素，3mg泛酸钙，3mg烟酰 胺(基于1L蒸馏水)，pH 7.2]的250ml带边缘-挡板(corner-baffle)的摇瓶中， 并在30℃，在以200rpm摇动时培养直到该培养物达到对数生长中期 (OD600＝10)。当终止该培养时，通过离心收集细胞，并混悬在100mM Tris-HCl 缓冲液(pH 7.0)中，通过超声波裂解，并然后进行高速离心，以获得上清液。 使用来自该上清液的1mg蛋白质来测量lysC酶的活性(Black和Wright (1955b))。结果，在其中关于lysC的启动子被NCgl1504或NCgl1305代替的 菌株中证实了lysC活性的改变，如下表中所示。
表.通过赖氨酸的添加比较启动子活性
[表1]
[表]
菌株 启动子表达的相对程度 KFCC 10881 1 CA01-0036(KCCM 10830) 0.74 CA01-0037(KCCM 10831) 1.67
用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约
国际表格
致：CJ株式会社 由在本页底部确定的国际保藏机构在
500-5-GANAMDAEMUN-RO， 按照细则7.1原始发行的情形中接收
CHUNG-KU，首尔，
韩国
1在适用细则6.4(d)的情况下，该日期是取得国际保藏机构法律状态的日期；在取得国际保 藏机构的法律状态后在布达佩斯条约外进行的保藏转变为根据布达佩斯条约的保藏的情 况下，该日期是国际保藏机构收到微生物的日期。
表BP/4 独立页
——韩国微生物培养中心——————————————————————————————————————————————————————————————
Yoylim Bldg，361-221 Hongje-ldong，Seodaemun-gu，首尔120-091，韩国，Tel：82-2-391-0950，396-0950 Fax：82-2-392-2859，E-mail：kccmkfcckccm.or.kr
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1在适用细则6.4(d)的情况下，该日期是取得国际保藏机构法律状态的日期；在取得国际保 藏机构的法律状态后在布达佩斯条约外进行的保藏转变为根据布达佩斯条约的保藏的情 况下，该日期是国际保藏机构收到微生物的日期。
PA093091C-序列表
<110>CJ株式会社
<120>源自谷氨酸棒杆菌的新型启动子核酸分子
<160>13
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>500
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(500)
<223>NCgl1504启动子
<400>1
agcgttgccc ctaaagggct ctgctcgtct tccacgtgga gggtcgctga tctggaacca 60
gcggtgccga tgcgcggcaa agtgtcgaga aattggcgta ggggacgagg tgcccgagga 120
aaccattttc tgttttcagg ggcgttcgaa ttgggttgaa tctgctcgtc cttcgtcact 180
cgcatcattc tacgcaaggg agcggagaac atttacctcg catcagagtc tggtggtgac 240
ccgaaggggg atagtgtgag ctaaatctca aattatattc attttcggta attggaatga 300
agttttaaaa cacaccacct gtggccagca taaataaggt tacctttggt tggcttaggg 360
ttcgcttagt ttttatttat tgatgatttt tctacgtcta tttgcgctgg taggggggaa 420
gggattggac acgggaatgg aattagggaa cacttgtgtt gtctaaaggt gaaagctaaa 480
tcaagcagga ggtgacacca 500
<210>2
<211>500
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(500)
<223>NCgl1305的启动子
<400>2
ttttggcggg cgcttcggcg aaaatacatg ggcctacaac gccgtctaag cgtgaaactg 60
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tacgtttaga aaggtttgac 500
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增NCgl1504基因的启动子的引物1
<400>3
aggatatcgg atccagcgga gacatttacc tcg 33
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增NCgl1504基因的启动子的引物2
<400>4
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<210>5
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增NCgl1305基因的启动子的引物3
<400>5
aggatatcgg atccgtattc agcttgtttt ggg 33
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增NCgl1305基因的启动子的引物4
<400>6
gagcatatga aacctttcta aacgta 26
<210>7
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>用于扩增lysC的引物5
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>用于扩增lysC的引物6
<400>8
aggatatcct ttgtgcacct ttcgatc 27
<210>9
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<213>人工序列
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<223>用于扩增lysC的引物7
<400>9
gatatcatat ggccctggtc gtacagaa 28
<210>10
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<213>人工序列
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<400>10
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<210>11
<211>687
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>基因
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acttatcggc ttactgataa aggtcgctca atcttcggcc acgaatatga ttcccttgct 300
gcggcagctc tagccactct tcgagaggtc ggcggagatg atgcagtaag gcaatttgct 360
agaaagcgga tcgaaacaat tgttgagggt attaccccag cagatgtcac agatcaatca 420
atcgaagata cagccaaatc tttagttgaa gcttttagtc ggcatggtta tgcagcaact 480
gtcgatgcca ctcgaaacgg gttgcaactc tgccagcatc actgtccaat atctacagtc 540
gccacggaat ttccggaact gtgtgaggca gagcatcaag cagtctcaga acttttgggg 600
cagcacacgc aaccattggc aacaatcgcg gacggccacg gcatctgcac aacaaatatt 660
ccattgacac ccatcaaaca ctcctga 687
<210>12
<211>2052
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(2052)
<223>NCgl1305
<400>12
atggcgtcca aactgacgac gacatcgcaa catattctgg aaaaccttgg tggaccagac 60
aatattactt cgatgactca ctgtgcgact cgccttcgct tccaagtgaa ggatcaatcc 120
attgttgatc aacaagaaat tgactccgac ccatcagttc ttggcgtagt accccaagga 180
tccaccggta tgcaggtggt gatgggtgga tctgttgcaa actattacca agaaatcctc 240
aaacttgatg gaatgaagca cttcgccgac ggtgaagcta cagagagttc atccaagaag 300
gaatacggcg gagtccgtgg caagtactcg tggattgact acgccttcga gttcttgtct 360
gatactttcc gaccaatcct gtgggccctg cttggtgcct cactgattat taccttgttg 420
gttcttgcgg atactttcgg tttgcaagac ttccgcgctc caatggatga gcagcctgat 480
acttatgtat tcctgcactc catgtggcgc tcggtcttct acttcctgcc aattatggtt 540
ggtgccaccg cagctcgaaa gctcggcgca aacgagtgga ttggtgcagc tattccagcc 600
gcacttctta ctccagaatt cttggcactg ggttctgccg gcgataccgt cacagtcttt 660
ggcctgccaa tggttctgaa tgactactcc ggacaggtat tcccaccgct gattgcagca 720
attggtctgt actgggtgga aaagggactg aagaagatca tccctgaagc agtccaaatg 780
gtgttcgtcc cattcttctc cctgctgatt atgatcccag cgaccgcatt cctgcttgga 840
cctttcggca tcggtgttgg taacggaatt tccaacctgc ttgaagcgat taacaacttc 900
agcccattta ttctttccat cgttatccca ttgctctacc cattcttggttccacttgga 960
ttgcactggc cactaaacgc catcatgatc cagaacatca acaccctggg ttacgacttc 1020
attcagggac caatgggtgc ctggaacttc gcctgcttcg gcctggtcac cggcgtgttc 1080
ttgctctcca ttaaggaacg aaacaaggcc atgcgtcagg tttccctggg tggcatgttg 1140
gctggtttgc tcggcggcat ttccgagcct tccctctacg gtgttctgct ccgattcaag 1200
aagacctact tccgcctcct gccgggttgt ttggcaggcg gtatcgtgat gggcatcttc 1260
gacatcaagg cgtacgcttt cgtgttcacc tccttgctta ccatcccagc aatggaccca 1320
tggttgggct acaccattgg tatcgcagtt gcattcttcg tttccatgtt ccttgttctc 1380
gcactggact accgttccaa cgaagagcgc gatgaggcac gtgcaaaggt tgctgctgac 1440
aagcaggcag aagaagatct gaaggcagaa gctaatgcaa ctcctgcagc tccagtagct 1500
gctgcaggtg cgggagccgg tgcaggtgca ggagccgctg ctggcgctgc aaccgccgtg 1560
gcagctaagc cgaagctggc cgctggggaa gtagtggaca ttgtttcccc actcgaaggc 1620
aaggcaattc cactttctga agtacctgac ccaatctttg cagcaggcaa gcttggacca 1680
ggcattgcaa tccaaccaac tggaaacacc gttgttgctc cagcagacgc tactgtcatc 1740
cttgtccaga aatctggaca cgcagtggca ttgcgcttag atagcggagt tgaaatcctt 1800
gtccacgttg gattggacac cgtgcaattg ggcggcgaag gcttcaccgt tcacgttgag 1860
cgcaggcagc aagtcaaggc gggggatcca ctgatcactt ttgacgctga cttcattcga 1920
tccaaggatc tacctttgat caccccagtt gtggtgtcta acgccgcgaa attcggtgaa 1980
attgaaggta ttcctgcaga tcaggcaaat tcttccacga ctgtgatcaa ggtcaacggc 2040
aagaacgagt aa 2052
<210>13
<211>1500
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>基因
<222>(1)..(1500)
<223>217：起始1490：终止(lysC基因)
<400>13
tcgcgaagta gcacctgtca cttttgtctc aaatattaaa tcgaatatca atatatggtc 60
tgtttattgg aacgcgtccc agtggctgag acgcatccgc taaagcccca ggaaccctgt 120
gcagaaagaa aacactcctc tggctaggta gacacagttt ataaaggtag agttgagcgg 180
gtaactgtca gcacgtagat cgaaaggtgc acaaaggtgg ccctggtcgt acagaaatat 240
ggcggttcct cgcttgagag tgcggaacgc attagaaacg tcgctgaacg gatcgttgcc 300
accaagaagg ctggaaatga tgtcgtggtt gtcgtctccg caatgggaga caccacggat 360
gaacttctag aacttgcagc ggcagtgaat cccgttccgc cagctcgtga aatggatatg 420
ctcctgactg ctggtgagcg tatttctaac gctctcgtcg ccatggctat tgagtccctt 480
ggcgcagaag cccaatcttt cacgggctct caggctggtg tgctcaccac cgagcgccac 540
ggaaacgcac gcattgttga tgtcactcca ggtcgtgtgc gtgaagcact cgatgagggc 600
aagatctgca ttgttgctgg tttccagggt gttaataaag aaacccgcga tgtcaccacg 660
ttgggtcgtg gtggttctga caccactgca gttgcgttgg cagctgcttt gaacgctgat 720
gtgtgtgaga tttactcgga cgttgacggt gtgtataccg ctgacccgcg catcgttcct 780
aatgcacaga agctggaaaa gctcagcttc gaagaaatgc tggaacttgc tgctgttggc 840
tccaagattt tggtgctgcg cagtgttgaa tacgctcgtg cattcaatgt gccacttcgc 900
gtacgctcgt cttatagtaa tgatcccggc actttgattg ccggctctat ggaggatatt 960
cctgtggaag aagcagtcct taccggtgtc gcaaccgaca agtccgaagc caaagtaacc 1020
gttctgggta tttccgataa gccaggcgag gctgcgaagg ttttccgtgc gttggctgat 1080
gcagaaatca acattgacat ggttctgcag aacgtctctt ctgtagaaga cggcaccacc 1140
gacatcacct tcacctgccc tcgttccgac ggccgccgcg cgatggagat cttgaagaag 1200
cttcaggttc agggcaactg gaccaatgtg ctttacgacg accaggtcgg caaagtctcc 1260
ctcgtgggtg ctggcatgaa gtctcaccca ggtgttaccg cagagttcat ggaagctctg 1320
cgcgatgtca acgtgaacat cgaattgatt tccacctctg agattcgtat ttccgtgctg 1380
atccgtgaag atgatctgga tgctgctgca cgtgcattgc atgagcagtt ccagctgggc 1440
ggcgaagacg aagccgtcgt ttatgcaggc accggacgct aaagttttaa aggagtagtt 1500
1500