技术领域
本发明涉及一种防止黄酒在贮存过程中酸败的集成控制方法，属于黄酒酿造技术领域。
背景技术
黄酒是以稻米、黍米等为主要原料，经加曲、酵母等糖化发酵剂酿制而成的发酵酒，是我国独具民族特色的酒精饮料。新酿成的黄酒，口感粗糙，风味不协调，需要经过一定时间的贮存来提高其风味品质，此过程称为黄酒的老熟或陈酿。但由于黄酒中糖分、氨基酸等营养物质含量丰富，虽然贮存前经过杀菌处理，在黄酒贮存过程中仍时常出现微生物污染，造成黄酒酸度升高、酒质变差的现象(通常称为黄酒酸败)。传统陶坛贮存三年的酸败率能超过5％，对黄酒行业造成巨大的经济损失。传统黄酒一般采用陶坛进行贮存陈酿，但由于陶坛体积小(22.5kg～25kg)，占地大，劳动强度大，近年来大罐(60t～300t)黄酒贮存技术逐渐开始应用。大罐黄酒由于贮存体积大，微生物污染造成的黄酒酸败危害更大，这也严重制约了大罐贮存技术在黄酒行业的推广与应用。
通常在大罐设计时其上配有检测pH、压力、温度、液位、溶解氧等的探头装置，检测相应指标，但没有一个指标可以对染菌进行提前预警。比如通过观察pH的变化，虽然能够反映黄酒的酸败，但等到明显下降，此时黄酒很可能已经酸败；检测贮存黄酒压力变化，当压力由正压变为常压或负压时，若密封性良好、各装置无异常，取样检测染菌后，此时黄酒可能已经酸败；研究陈化过程黄酒中溶解氧变化，溶解氧减少过快，耗氧量增大，说明染菌的可能性很大，取样检测染菌后，此时黄酒可能已经酸败，所以以上方法都是相对滞后的方法。因此，建立一个安全、方便、快速、且能够对染菌提前预警的检测方法很有意义。
贮存黄酒酸败时，一般的处理方法是，将黄酒再次进行高温瞬时灭菌，灭菌温度为85℃～95℃，同时对大罐和相关管道实施清洗和杀菌，然后将杀菌后的黄酒重新输送至大罐中继续贮存，但是这样的方法对黄酒的风味有一定的影响，并且工序繁琐，耗费人力物力。如发现黄酒酸败非常严重时，大罐内的黄酒将被废弃，会造成严重的浪费。
发明内容
为了解决目前存在的黄酒大罐贮存存在的问题，本发明提供了一种防止黄酒在贮存过程中酸败的集成控制方法。经过研究发现，黄酒酸败微生物在40℃时，其生长受到明显抑制，若将贮存温度控制在40℃或以上时，即使有酸败微生物的污染，其酸败的风险也会较低。
本发明第一个目的是提供一种防止黄酒在贮存过程中酸败的集成控制方法，其特征在于，所述方法是通过调控黄酒贮存温度在40℃以上来抑制酸败微生物生长。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是在黄酒大罐贮存中应用，大罐的截面示意图见图1。
在本发明的一种实施方式中，所述方法按照(a)或(b)方案进行：
(a)15-35℃贮存黄酒，定期对黄酒进行酸败微生物预防检测，当检测到酸败微生物的含量超过100CFU/mL时，控制贮存温度为40-50℃保持30-40天后，将贮存温度调控为15-35℃，并连续检测黄酒中的酸败微生物；
(b)直接控制黄酒贮存温度保持在40-50℃进行黄酒贮存。
在本发明的一种实施方式中，所述酸败微生物预防检测是通过RT-PCR技术进行预防检测。
在本发明的一种实施方式中，其特征在于，所述RT-PCR的特异性引物对是序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示、序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示、序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示、序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示或者序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示引物对中的任意一对。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括在线监测控制装置，其中包括温度监测设备、温度显示设备和温度控制装置。
在本发明的一种实施方式中，所述温度检测设备包括用于插入储罐内监测黄酒温度的温度探头。
在本发明的一种实施方式中，所述方法的具体操作按照方案(a)或(b)进行：
(a)当黄酒经煎酒灭菌后，趁热转移至贮存大罐中，15-35℃贮存；定期对贮存黄酒中的酸败微生物进行RT-PCR预防检测；当在15-35℃贮存黄酒中酸败微生物含量超过100CFU/mL时，利用温度控制装置将贮存温度控制在40-50℃，抑制酸败微生物的生长；控制贮存温度为40-50℃保持30-40天后，将贮存温度重新恢复15-35℃，继续黄酒的贮存过程，同时利用RT-PCR检测方法对黄酒中的酸败微生物进行连续监测；
(b)或者直接通过温度控制装置控制黄酒贮存温度保持在40-50℃进行黄酒贮存，定期对贮存黄酒中的酸败微生物进行RT-PCR预防检测。
本发明第二个目的是提供一种上述方法在黄酒贮存中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是预防黄酒在贮存过程中发生酸败。
本发明的优点和效果：
本发明最大的优势在于能够对黄酒酸败做出预测，并做出相应的控制措施。本发明所述的检测和控制方法具有安全、方便、快速、且能够对黄酒酸败提前预警等特点。
附图说明
图1为黄酒贮存大罐截面示意图。图中标记：①为控温夹套，②为温度电极，③为温度显示仪表，④为取样口。
图2为采用的不同样品耐酸乳杆菌的普通PCR凝胶电泳图；
图3为标准品DNA的荧光定量PCR的扩增曲线图；
图4为标准品DNA的荧光定量PCR的溶解曲线图；
图5为标准品DNA的荧光定量PCR的标准曲线图；
图6为检测方法的灵敏性检测结果；
图7为检测方法的重复性检测结果；
图8为检测方法的准确性检测结果；
图9为黄酒贮存过程中检测到酸败微生物温度调控为40℃酸败微生物的菌落数量变化情况；
图10为黄酒贮存过程中检测到酸败微生物时将温度调控为50℃酸败微生物的菌落数量变化情况；
图11为黄酒贮存过程中检测到酸败微生物时将温度调控为45℃酸败微生物的菌落数量变化情况；
图12为黄酒贮存过程中不进行温度调控时酸败微生物的菌落数量变化情况；
图13为黄酒贮存过程中检测到酸败微生物时将温度调控为60℃酸败微生物的菌落数量变化情况。
具体实施方案
实施例1：黄酒腐败微生物的检测
步骤1，引物合成：
引物的序列为：
正向引物P1-F：5’-TCCAGCTTATGCGGAAGCAC-3’(序列如SEQ ID NO.1所示)；
反向引物P1-R：5’-AGTCCCAGAAAGCTTACGCA-3’(序列如SEQ ID NO.2所示)；
将所述引物用管子分装，并在管子上标明分装的日期及所述引物名称，用无菌水进行5倍稀释，作为引物原液，放于-20℃冰箱保存，使用时直接取用；
表1 引物相关信息
步骤2，普通PCR、电泳与测序来鉴定引物的特异性：
选择从不同酸败黄酒样品中筛选出的耐酸乳杆菌的培养液，使用细菌DNA快速抽提试剂盒，提取DNA，作为DNA模板进行普通PCR；
步骤2-1，普通PCR 25ul的反应体系：
将配置好的反应体系放于PCR仪进行基因片段的扩增；
步骤2-2，PCR扩增反应：
94℃预变性4min；94℃变性10s、60℃退火30s，扩增40个循环；72℃延伸10min；取7ul PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；
如图2，从耐酸乳杆菌的PCR电泳图中可以看出，不同样品的耐酸乳杆菌DNA的电泳条带单一，无二聚体且条带明亮，表明：设计的引物对于样品中的目的片段的扩增均具有很好的特异性，同时扩增片段大小与预期的扩增片段长度吻合，初步表明：设计的引物特异性较好，推荐退火温度为60℃。
步骤2-3，PCR产物测序。
表2 测序序列对比结果
样品编号 NCBI比对结果 相似度 GeneBank登录号 12 Lactobacillus acetotolerans 100％ AP014808.1 13 Lactobacillus acetotolerans 100％ AP014808.1 14 Lactobacillus acetotolerans 100％ AP014808.1 15 Lactobacillus acetotolerans 100％ AP014808.1
步骤3：标准品DNA的制备：
选择生长平稳期的耐酸乳杆菌的菌悬液，使用细菌DNA快速抽提试剂盒，提取DNA，测定DNA浓度后，将提取的样品DNA进行不同倍数稀释，作为DNA模板进行荧光定量PCR，同时将耐酸乳杆菌的菌悬液，进行10倍梯度稀释，共做6个稀释度：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，选择稀释度10-4、10-5、10-6进行平板涂布，培养一周后，进行微生物的菌落计数；
菌落计数结果：1.39×109CFU/mL。
步骤4，实时荧光定量PCR反应体系和反应程序的建立；
将已知菌浓的模板DNA进行梯度稀释，选取100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共8个浓度梯度作为模板进行荧光定量PCR，每个模板做3个平行；
步骤4-1，荧光定量PCR 20ul的反应体系：
步骤4-2，荧光定量PCR反应程序：
95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃30s，收集荧光信号，扩增40个循环；65℃-95℃升温，收集荧光信号，绘制熔解曲线；
步骤5，标准曲线的绘制：
将步骤3中制备的所述标准品DNA，进行10倍梯度稀释，共做8个稀释度：100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，将这8个稀释度作为标准品DNA模板，配置定量PCR体系并进行扩增，每个模板3个平行，以微生物浓度和相应的阈值循环数Ct作图，并进行线性拟合，得到标准曲线；
扩增曲线、熔解曲线及标准曲线分别如图3、图4和图5所示：从中可以看出，扩增曲线、熔解曲线都很好，同时标准曲线(y＝-3.5453x+43.13)的R2为0.9988，扩增效率为91.5％，均表明设计的荧光定量PCR引物特异性良好。
步骤6，实时荧光定量PCR检测方法的评估。
步骤6-1，实时荧光定量PCR检测方法的灵敏性评价：
将已知菌浓的模板DNA进行梯度稀释，选取100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共8个浓度梯度进行荧光定量PCR，通过反应确定出荧光定量PCR所能检测出的最低菌浓，即检测下限，对该方法的灵敏性进行评价；
实验结果如图6所示，菌浓为1.0×10^3的模板通过该方法也能检测到明显的荧光值，循环数(Ct)为30.78，说明该方法具有比较高的灵敏性。
步骤6-2，实时荧光定量PCR检测方法的重复性及稳定性评价：
将已知菌浓的不同稀释倍数的标准品DNA进行批内重复实验，每个标准品DNA设置3个平行，计算Ct值的变异系数；
批内重复的扩增曲线如图7所示，可见重复性较好。批内重复实验其对应的Ct值如表3所示，从表中可见，批内重复实验的变异系数值的平均值为0.28％，表明所建立的荧光定量方法具有很好的稳定性。批内重复实验的变异系数均远小于3.0％，误差极小，符合统计学规律，充分证实了该检测方法的良好重复性。
表3 荧光定量PCR方法批内重复实验
步骤6-3，实时荧光定量PCR检测方法的准确性评价：
将已知菌浓的不同稀释倍数的DNA样品作为未知样品，进行荧光定量PCR，计算实验的定量结果与实际菌浓的差异。
实验结果如图8所示，从图中可以看出，两次定量结果均与理论拷贝数相近，数量级上没有差异。说明该引物及相应的定量方法准确性高，可以很好地实现对耐酸乳杆菌的定量。
实施例2：酸败微生物集成控制的黄酒贮存过程
运用该黄酒贮存大罐进行一次试验，大罐示意图见图1。将煎酒后的60吨黄酒流经换热器后，趁热输送至已经清洗并沥干的大罐中，25℃条件下贮存。定期对贮存黄酒进行取样分析，利用RT-PCR的方法对黄酒中的酸败微生物进行快速检测，其酸败微生物的变化曲线如图9所示。
从图9可以看出，黄酒在贮存期间经历了三个阶段的变化，即微生物含量在安全范围之内，微生物生长阶段，微生物稳定阶段。在黄酒贮存的前31天，运用基于RT-PCR的快速检测方法在黄酒中检测到酸败微生物含量均在100CFU/mL以下；在31天时在黄酒中检测到酸败微生物含量高于100CFU/mL，此时开始启动温度控制装置的升温系统，将黄酒的贮存温度升高到40℃保持40天后降为25℃，并连续对黄酒中的酸败微生物进行检测，发现微生物在31～45天处于较快的生长阶段；从黄酒酸败微生物45天以后的检测结果可以看出，微生物的生长受到了控制，并且在71天温度降为25℃之后，酸败微生物没有再次繁殖，说明其中大部分微生物已经失去活性甚至死亡，虽然图9中酸败微生物的水平处于105CFU/mL，这是由于采用分子检测方法，即使微生物已经死亡，依然能够检测到其中的DNA。此外，伴随着微生物的降解，检测到的酸败微生物的数量有小幅度的下降。
贮存期结束后对该罐黄酒的理化指标进行了检测，结果显示黄酒的酒精度为16.7％(v/v)、总酸为7.6g/L、氨氮为0.41g/L、总糖为10.3g/L，均在国标规定的正常范围内，黄酒没有发生酸败。此次黄酒大罐贮存期间，根据酸败微生物的快速检测方法提前判断了其质量变化趋势，并做出了相应的控制措施，从而避免了经济损失。
实施例3：酸败微生物集成控制的黄酒贮存过程
运用该黄酒贮存大罐进行一次试验，将煎酒后的60吨黄酒流经换热器后，趁热输送至已经清洗并沥干的大罐中，25℃条件下贮存。定期对贮存黄酒进行取样分析，利用RT-PCR的方法对黄酒中的酸败微生物进行快速检测，其酸败微生物的变化曲线如图10所示。
从图10可以看出，黄酒在贮存期间经历了三个阶段的变化，即微生物含量在安全范围之内，微生物生长阶段，微生物稳定阶段。在黄酒贮存的前32天，运用基于RT-PCR的快速检测方法在黄酒中检测到酸败微生物含量均在100CFU/mL以下；在32天时在黄酒中检测到酸败微生物含量高于100CFU/mL，此时开始启动温度控制装置的升温系统，将黄酒的贮存温度升高到50℃保持30天后降为25℃，并连续对黄酒中的酸败微生物进行检测，发现微生物在32～39天处于较快的生长阶段；从黄酒酸败微生物39天以后的检测结果可以看出，微生物的生长受到了控制，并且在62天温度降为25℃之后，酸败微生物没有再次繁殖，处于稳定阶段，说明其中大部分微生物已经失去活性，并伴随着微生物的降解，检测到的酸败微生物的数量有一定的下降。
贮存期结束后对该罐黄酒的理化指标进行了检测，结果显示黄酒的酒精度为15.9％(v/v)、总酸为6.9g/L、氨氮为0.38g/L、总糖为11.2g/L，黄酒没有发生酸败。此次黄酒大罐贮存期间，根据酸败微生物的快速检测方法提前判断了其质量变化趋势，并做出了相应的控制措施，从而避免了经济损失。
实施例4：酸败微生物集成控制的黄酒贮存过程
运用该黄酒贮存大罐进行一次试验，将煎酒后的60吨黄酒流经换热器后，趁热输送至已经清洗并沥干的大罐中，25℃条件下贮存。定期对贮存黄酒进行取样分析，利用RT-PCR的方法对黄酒中的酸败微生物进行快速检测，其酸败微生物的变化曲线如图11所示。
从图11可以看出，黄酒在贮存期间经历了三个阶段的变化，即微生物含量在安全范围之内，微生物生长阶段，微生物稳定阶段。在黄酒贮存的前30天，运用基于RT-PCR的快速检测方法在黄酒中检测到酸败微生物含量均在100CFU/mL以下；在30天时在黄酒中检测到酸败微生物含量高于100CFU/mL，此时开始启动温度控制装置的升温系统，将黄酒的贮存温度升高到45℃保持35天后降为25℃，并连续对黄酒中的酸败微生物进行检测，发现微生物在30～41天处于较快的生长阶段；从黄酒酸败微生物41天以后的检测结果可以看出，微生物的生长受到了控制，并且在65天温度降为25℃之后，酸败微生物没有再次繁殖，处于稳定阶段，说明其中大部分微生物已经失去活性，并伴随着微生物的降解，检测到的酸败微生物的数量有较小幅度的下降。
贮存期结束后对该罐黄酒的理化指标进行了检测，结果显示黄酒的酒精度为16.2％(v/v)、总酸为7.1g/L、氨氮为0.43g/L、总糖为9.5g/L，均在国标规定的正常范围内，黄酒没有发生酸败。此次黄酒大罐贮存期间，根据酸败微生物的快速检测方法提前判断了其质量变化趋势，并做出了相应的控制措施，从而避免了经济损失。
实施例5：不进行温度调控的黄酒贮存过程
运用该黄酒贮存大罐进行一次试验，将煎酒后的60吨黄酒流经换热器后，趁热输送至已经清洗并沥干的大罐中，25℃条件下贮存。定期对贮存黄酒进行取样分析，利用RT-PCR的方法对黄酒中的酸败微生物进行快速检测，其酸败微生物的变化曲线如图12所示。
从图12可以看出，黄酒在贮存期间经历了三个阶段的变化，即微生物在安全范围之内，微生物生长阶段，微生物稳定阶段。在黄酒贮存的前35天，运用基于RT-PCR的快速检测方法在黄酒中检测到酸败微生物含量均在100CFU/mL以下；在35天时在黄酒中检测到酸败微生物含量高于100CFU/mL，此时不做温度调控，继续在25℃下贮存，微生物处于快速生长阶段；从黄酒酸败微生物69天以后的检测结果可以看出，酸败微生物的生长达到稳定阶段，达到了108CFU/mL的较高水平。
贮存期结束后对该罐黄酒的理化指标进行了检测，结果显示黄酒的酒精度为12.1％(v/v)、总酸为13.2g/L、氨氮为0.18g/L、总糖为2.5g/L，黄酒酸度明显升高，并伴随明显的恶臭，黄酒发生严重酸败。
实施例6：酸败微生物集成控制的黄酒贮存过程
运用该黄酒贮存大罐进行一次试验，将煎酒后的60吨黄酒流经换热器后，趁热输送至已经清洗并沥干的大罐中，25℃条件下贮存。定期对贮存黄酒进行取样分析，利用RT-PCR的方法对黄酒中的酸败微生物进行快速检测，其酸败微生物的变化曲线如图13所示。
从图13可以看出，黄酒在贮存期间经历了三个阶段的变化，即微生物含量在安全范围之内，微生物生长阶段，微生物稳定阶段。在黄酒贮存的前35天，运用基于RT-PCR的快速检测方法在黄酒中检测到酸败微生物含量均在100CFU/mL以下；在35天时在黄酒中检测到酸败微生物含量高于100CFU/mL，此时开始启动温度控制装置的升温系统，将黄酒的贮存温度升高到60℃保持30天后降为25℃继续贮存，并连续对黄酒中的酸败微生物进行检测，发现微生物在35～42天处于较缓的生长阶段；从黄酒酸败微生物42天以后的检测结果可以看出，微生物的生长受到了控制，处于稳定阶段，并伴随着微生物的降解，微生物的数量有较大幅度的下降。
贮存期结束后对该罐黄酒的理化指标进行了检测，结果显示黄酒的酒精度为15.2％(v/v)、总酸为7.3g/L、氨氮为0.32g/L、总糖为12.1g/L，均在国标规定的正常范围内，黄酒没有发生酸败，但是从感官角度分析，微生物的风味发生了改变。
实施例7：控制贮存温度的黄酒大罐贮存
运用该黄酒贮存大罐再进行一次试验，将煎酒后的60吨黄酒流经换热器后，趁热输送至已经清洗并沥干的大罐中。利用温度控制系统，将大罐黄酒贮存期间温度保持在40℃。定期对贮存黄酒进行取样分析，利用RT-PCR的方法对黄酒中的酸败微生物进行快速检测，但在黄酒贮存期间并没有在黄酒中检测到酸败微生物。
贮存期结束后对该罐黄酒的理化指标进行了检测，结果显示黄酒的酒精度为17.1％(v/v)、总酸为6.5g/L、氨氮为0.45g/L、总糖为11.6g/L，均在国标规定的正常范围内，黄酒酒质正常。
综上所述，建立一个安全、方便、快速、且能够对染菌提前预警的检测方法，根据酸败微生物的快速检测结果可以提前判断黄酒质量的变化趋势，从而提前避免经济损失。此外，该方法中的温度控制装置也可以黄酒贮存温度可控，减少黄酒生产对季节的依赖性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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