技术领域
本发明涉及造影剂细胞损伤模型制备技术领域，具体涉及一种接近CIN患者血清HMGB-1含量的体外细胞培养方法。
背景技术
由于血管造影及介入诊疗技术在疾病诊断上具有不可替代的优势，碘造影剂的使用越来越广泛。然而，造影剂肾病的发生数量不断上升。至目前为止，造影剂肾病已成为医源性肾衰竭的第三大病因，发病率仅次于肾灌注不足和肾毒性药物。
造影剂肾病的发生机制未完全明确，其中血清高迁移率族蛋白-1(HMGB-1)是近年发现的一种高度保守的核蛋白，主要作用是稳定染色体结构并协助其功能，参与DNA复制、转录、重组和修复；HMGB-1作为一个经典的损伤相关模式分子，不仅有促进炎症反应、细胞分化等作用，而且还对线粒体自噬有重要的调控作用。碘造影剂引起体内升高，介导PINK1-Parkin信号通路致使肾小管上皮细胞线粒体自噬异常，是造影剂肾病发生的其中原因之一。由于伦理问题，不能直接在人体开展深入研究，分子机制往往需通过体外细胞实验证实，但至今虽然有通过在体外细胞培养液中加入造影剂而获得人肾小管上皮细胞损伤的报道，但得到的只是受损严重的人肾小管上皮细胞，与实际造影剂肾病患者体内损伤细胞及胞外环境相差很大，不利于相关药物的研发试验，甚至导致相关药物试验结果的错误。因此，目前尚未发现有建立合适的引起HMGB-1升高而导致肾小管上皮细胞损伤的稳定研究模型。
以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。
发明内容
本发明针对上述技术问题提供一种基于肾小管上皮细胞培养出与造影剂肾病患者术后血清HMGB-1含量类似、损伤更接近、体系毒素更少的细胞损伤模型的培养方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种接近CIN患者血清HMGB-1含量的体外细胞培养方法，包括如下步骤：
一种接近CIN患者血清HMGB-1含量的体外细胞培养方法，包括如下步骤：
(1)HK-2细胞复苏，将冻存管放在手心中先预热几秒，然后迅速投入到37℃的水浴箱中并不断摇动，待冻存管内的液体完全融化后，在300～500rmp下离心2～5min，离心完毕后，弃上清液，加入完全培养基，制成细胞重悬液；
(2)将步骤(1)制得的细胞重悬液在完全培养基内进行传代培养；
(3)细胞传代消化至观察到培养瓶内细胞随培养液呈现沙粒样滑落时，将培养液在950～1000rmp下离心4～6min，弃去上清液，加入完全培养基，制成细胞重悬液；
(4)将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜完全培养基中，接种密度为40％～50％，置于培养箱中培养；
(5)当细胞生长密度达80％～90％时，将细胞培养液在900～1100rmp下离心4～6min，加入完全培养基，制成细胞重悬液(细胞浓度为1.0～1.9*106个/ml)；
(6)将制成的细胞重悬液，按每50ul接种至2ml的新鲜完全培养基中，进行培养48h，换无血清培养基培养6h，然后加入浓度为45～55mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续培养5～7h后得到损伤模型细胞。
优选的，所述完全培养基为按10％FBS、1％双抗的比例配置。
优选的，所述第(3)和第(5)步骤中的离心速度为1000rmp，时间为5min。
优选的，所述第(5)步骤，制成的所述细胞重悬液其细胞浓度为1.875*106个/ml或1.475*106个/ml或1.125*106个/ml或1.7*106个/ml。
优选的，所述第(6)步骤，加入的碘克沙醇溶液浓度为50mgI/ml。
优选的，所述第(6)步骤，加入碘克沙醇溶液后，继续培养6h后得到损伤模型细胞。
优选的，所述第(1)～(6)步骤中涉及到的细胞培养，培养条件为37℃、5％CO2浓度培养箱中培养。
本发明与现有技术相比的有益效果：本发明通过将HK-2细胞进行传代培养后，通过离心、接种比例控制、培养时间控制等，能够实现整个培养体系的毒素最低，细胞生长状况最佳，同时，通过对各阶段进行HMGB-1蛋白检测，发现此时体系内细胞上清液的HMGB-1蛋白含量与患者术后血清HMGB-1含量十分接近，细胞损伤更接近，进而得到理想的细胞损伤模型。
具体实施方式
具体实施例1
一种接近CIN患者血清HMGB-1含量的体外细胞培养方法，包括如下步骤：
(1)HK-2细胞复苏，将冻存管放在手心中先预热几秒，然后迅速投入到37℃的水浴箱中并不断摇动，待冻存管内的液体完全融化后，在300～500rmp下离心2～5min，离心完毕后，弃上清液，加入完全培养基，制成细胞重悬液；
(2)将步骤(1)制得的细胞重悬液在按10％FBS、1％双抗的比例配置的完全培养基内置于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行传代培养；
(3)细胞传代消化至观察到培养瓶内细胞随培养液呈现沙粒样滑落时，将培养液在970rmp下离心5min，加入完全培养基制成细胞重悬液；
(4)将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜所述完全培养基中，接种密度为40％，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养；
(5)当细胞生长密度达90％时，将细胞培养液在900rmp下离心6min，加入完全培养基制成细胞重悬液(细胞浓度为1.875*106个/ml)；
(6)将制成的细胞重悬液，按每50ul接种至2ml的新鲜所述完全培养基中，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养48h后，换无血清培养基培养6h，然后向培养体系加入浓度为45mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养7h后得到损伤模型细胞。
具体实施例2
一种接近CIN患者血清HMGB-1含量的体外细胞培养方法，包括如下步骤：
(1)HK-2细胞复苏，将冻存管放在手心中先预热几秒，然后迅速投入到37℃的水浴箱中并不断摇动，待冻存管内的液体完全融化后，在300rmp下离心5min，离心完毕后，弃上清液，加入完全培养基，制成细胞重悬液；
(2)将步骤(1)制得的细胞重悬液在按10％FBS、1％双抗的比例配置的完全培养基内置于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行传代培养；
(3)细胞传代消化至观察到培养瓶内细胞随培养液呈现沙粒样滑落时，将培养液在960rmp下离心5min，弃去上清液，加入完全培养基制成细胞重悬液；
(4)将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜所述完全培养基中，接种密度为50％，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养；
(5)当细胞生长密度达90％时，将细胞培养液在1000rmp下离心5min，加入完全培养基制成细胞重悬液(细胞浓度1.475*106个/ml)；
(6)将制成的细胞重悬液，按每50ul接种至2ml的新鲜所述完全培养基中，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养48h，换无血清培养基培养6h，然后向培养体系加入浓度为50mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养6h后得到损伤模型细胞。
具体实施例3
一种接近CIN患者血清HMGB-1含量的体外细胞培养方法，包括如下步骤：
(1)HK-2细胞复苏，将冻存管放在手心中先预热几秒，然后迅速投入到37℃的水浴箱中并不断摇动，待冻存管内的液体完全融化后，在350rmp下离心4min，离心完毕后，弃上清液，加入完全培养基，制成细胞重悬液；
(2)将步骤(1)制得的细胞重悬液在按10％FBS、1％双抗的比例配置的完全培养基内置于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行传代培养；
(3)细胞传代消化至观察到培养瓶内细胞随培养液呈现沙粒样滑落时，将培养液在950rmp下离心6min，弃去上清液，加入完全培养基制成细胞重悬液；
(4)将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜所述完全培养基中，接种密度为40％，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养；
(5)当细胞生长密度达80％时，将细胞培养液在950rmp下离心5.5min，加入完全培养基制成细胞重悬液(细胞浓度为1.125*106个/ml)；
(6)将制成的细胞重悬液，按每50ul接种至2ml的新鲜所述完全培养基中，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养48h，换无血清培养基培养6h，然后向培养体系加入浓度为55mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养5h后得到损伤模型细胞。
具体实施例4
一种接近CIN患者血清HMGB-1含量的体外细胞培养方法，包括如下步骤：
(1)HK-2细胞复苏，将冻存管放在手心中先预热几秒，然后迅速投入到37℃的水浴箱中并不断摇动，待冻存管内的液体完全融化后，在500rmp下离心2min，离心完毕后，弃上清液，加入完全培养基，制成细胞重悬液；
(2)将步骤(1)制得的细胞重悬液在按10％FBS、1％双抗的比例配置的完全培养基内置于37℃、5％CO2浓度培养箱中进行传代培养；
(3)细胞传代消化至观察到培养瓶内细胞随培养液呈现沙粒样滑落时，将培养液在1000rmp下离心4min，弃去上清液，加入完全培养基制成细胞重悬液；
(4)将第(3)步骤中的细胞重悬液转接入新鲜所述完全培养基中，接种密度为40％，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养；
(5)当细胞生长密度达80％时，将细胞培养液在1100rmp下离心4min，加入完全培养基制成细胞重悬液(细胞浓度1.7*106个/ml)；
(6)将制成的细胞重悬液，按每50ul接种至2ml的新鲜所述完全培养基中，置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养48h，换无血清培养基培养6h，然后向培养体系加入浓度为55mgI/ml的碘克沙醇溶液，继续置于37℃、5％CO2浓度培养箱中培养5h后得到损伤模型细胞。
具体实施例5
本实施例与具体实施例3的区别仅在于：第(5)步骤中制成的所述细胞重悬液其细胞浓度为1.0*106个/ml。
具体实施例6
本实施例与具体实施例1的区别仅在于：第(5)步骤中制成的所述细胞重悬液其细胞浓度为1.9*106个/ml。