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从大豆中提取叶酸的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610004854.6 (22)申请日 2016.01.05 (65)同一申请的已公布的文献号申请公布号 CN 105440036 A (43)申请公布日 2016.03.30 (73)专利权人吉林省农业科学院地址 133000 吉林省长春市生态大街1363 号 (72)发明人张玲孟繁磊张原宇王玉民李海云邢国杰董英山 (74)专利代理机构北京世誉鑫诚专利代理事务所(普通合伙) 11368 代理人孙国栋 (51)Int.Cl. C07D 475/04(2006.0。

2、1) G01N 21/31(2006.01) (56)对比文件 CN 101775016 A,2010.07.14,说明书第1-4 页. 邵丽华等. “主要粮食及果蔬叶酸含量分析” . 食品科学 .2014,1-7. 郭秀珠等. “果蔬中叶酸的提取分离及测定方法研究” . 食品科学 .2006,第27卷(第3期), 183-185. 迟晓星等. “叶酸的提取及抗氧化性研究” . 现代食品科技 .2011,第27卷(第10期),1234- 1237. 李富兰等. “蚕沙中叶酸的提取与分析检测” . 食品科技 .2009,第34卷(第10期),211- 213. 审查员高虎 (54。

3、)发明名称从大豆中提取叶酸的方法 (57)摘要本发明属于植物提取物的制备领域，具体地涉及一种大豆种子中叶酸的提取方法。人类和动物不能自身合成叶酸，各种作物是人类和动物获取这一维生素的主要来源。作物中叶酸的提取，常用的有单酶法和三酶法。不同食物中使用的三酶法提取条件是不同的，有必要对每种类型食物分别进行叶酸提取的优化。本发明提供了一种优化的从大豆种子中提取叶酸的方法，利用本方法，可以同时对上百个样品同时进行提取，使提取过程快捷高效。权利要求书1页说明书9页 CN 105440036 B 2017.03.08 CN 105440036 B 1.从大豆中。

4、提取叶酸的方法，包括以下步骤： (1)大豆样品制备：大豆种子粉碎获取豆粉，称取0.2g豆粉，置于AXYGEN EP管中，在样品中加入750 L叶酸提取缓冲液， 95孵育15min置于冰上冷却，加入5mm钢珠2粒，在组织研磨机中研磨样品，获得样品匀浆液； (2)大豆叶酸提取：在步骤(1)样品匀浆液中加入8 L -淀粉酶和750 L叶酸提取缓冲液以避免粘稠，室温放置10min，加入100 L蛋白酶， 37孵育1h； 100煮沸10min，冰上迅速冷却10min；在4， 14000rpm条件下，离心10min；吸取上清，按照2的体积比在上清中加入大鼠血清10。

5、 L，混匀后，于37培养2h； 100煮沸灭活10min，冰上迅速冷却10min；在4， 14000rpm条件下，离心15min；吸取上清分装于灭菌管中直接测定或冻存于-80，得大豆叶酸提取液，叶酸提取缓冲液成分： 50mM磷酸缓冲液， PH6.5， 1抗坏血酸钠盐， 0.12-巯基乙醇。 2.根据权利要求1所述的从大豆中提取叶酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)大豆样品制备和步骤(2)大豆叶酸提取，均在避光条件下进行。权利要求书 1/1 页 2 CN 105440036 B 2 从大豆中提取叶酸的方法技术领域 0001 本发明属于植物提取物的制备，具体地涉及。

6、一种大豆种子的提取和含量的测定方法。背景技术 0002 叶酸是水溶性B维生素，叶酸缺乏会引起婴儿神经管缺陷、癌症和心血管疾病等严重的健康问题(Kim et al.,1998； Geisel,2003； Choi&Friso,2005； Marisa et al.,2005)。人类和动物不能自身合成叶酸，各种作物是人类和动物获取这一维生素的主要来源。然而，在作物中叶酸的含量通常很低，尤其是在谷物中含量更低，如何获得作物中各种叶酸衍生物含量的可靠数据是这一研究领域的关键问题。作物中叶酸的提取，常用的有单酶法和三酶法。单酶法针对菠菜、黄瓜、卷心菜和香蕉等食物中的叶。

7、酸提取有效(Iwatani et al., 2003； Zhang et al.,2005)。三酶法对谷物类，土豆，豆类等的叶酸含量的提取效率高于单酶法，三酶法相对于单酶法能够更完全地提取富含碳水化合物或蛋白基质的叶酸(De Souza&Eitenmiller,1990； Tamura et al,1997； Pffeifer et al,1997； Rader et al, 1998； Aiso&Tamura,1998)。 Hyun等(2005)研究的食物叶酸提取步骤，适量样品在提取液中研磨成匀浆，匀浆液分装后冻存于-70直至叶酸提取，加入蛋白酶处理样品后， 100煮沸样。

8、品灭活蛋白酶，再利用 -淀粉酶和叶酸轭合酶共同孵育样品2小时，经离心后获取叶酸样品，与-70冻存样品。但是不同食物中使用的三酶法提取条件是不同的(Aiso&Tamura, 1998； Pandrangi et al.,2004)，有必要对每种类型食物分别进行叶酸提取的优化。 0003 目前国内国际流行的作物中叶酸含量检测方法是微生物法和高效液相色谱法。高效液相色谱法利用C18色谱柱进行样品分离后，结合紫外吸收，荧光检测和电化学检测能够对单个叶酸组分进行定量分析。高效液相色谱法能够快速、高效地分离不同叶酸衍生物，样品用量少，但是该方法的灵敏度低于微生物法，而且内。

9、源叶酸会干扰叶酸测定，给某些形式的叶酸定量带来困难(Zhang et al .,2005； Po-Prieto et al .,2006)。微生物法 (Microbiological Assay)是检测叶酸的经典方法，其原理是指示菌对叶酸的所有衍生物具有相同的生长反应速度，在一定条件下，微生物的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，根据微生物对样品中叶酸的吸收程度从而对叶酸进行定量(常娜宁等， 2010)。酪乳酸杆菌对单谷氨酸叶酸、二或三谷氨酸叶酸及其还原型衍生物均敏感，是最为常用的菌种 (Hyun et al.,2005)。叶酸分析中要求不同样品具有适当的稀释倍数。

10、，使用96孔酶标板对指示菌进行18-24h培养，并在分光光度计读取数值后计算样品中叶酸的含量。微生物法灵敏度高，结果准确，但重复性较差,而且只能检测总叶酸含量,但优点是不需要贵重的仪器或药品,所以成本较低,适用于大批量的样品检测。 0004 综上，有必要对大豆叶酸三酶法提取和微生物检测的方法进行优化，确定三种酶的最佳配比和微生物法检测的步骤，为筛选高叶酸含量的大豆优异种质提供科学的依据。发明内容说明书 1/9 页 3 CN 105440036 B 3 0005 发明旨在解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种大豆种子叶酸的提取和含量检测方法，旨在。

11、建立三酶法提取及微生物检测大豆种子中叶酸含量的方法，为筛选高叶酸含量的大豆优异种质提供科学的依据。 0006 本发明用到的材料和仪器如下： 0007 一、材料和试剂 0008 常规药品为国产分析纯试剂；磷酸缓冲液(AMERESCO公司生产)；叶酸(Sigma公司)； -淀粉酶(来源于米曲霉)和蛋白酶(来源于链霉素)(Sigma公司)；大鼠血清(中科晨宇 (北京)贸易有限公司)；乳酸菌液体培养基和叶酸培养基购自北京鼎国生物技术有限公司；乳酸菌菌株购自北京中原合聚经贸有限公司； 0009 二、仪器与设备 0010 AXYGEN系列EP管(自经科宏达公司)；叶酸检测试剂盒(P1。

12、001)购自德国拜发生物有限公司；高通量组织研磨机SPEX Geno 2000(美国SPEX公司生产)； 3-30K高速台式冷冻离心机(德国SIGMA)；酶标仪(美国Dynex Magellan Biosciences)。 0011 本发明提供了一种大豆种子叶酸的提取方法，包括以下步骤： 0012 (1)大豆样品制备：大豆种子粉碎获取豆粉，称取0.2g豆粉，置于AXYGEN EP管中，在样品中加入750 L叶酸提取缓冲液， 95孵育15min置于冰上冷却，加入5mm钢珠(2粒)，在组织研磨机中研磨样品，获得样品匀浆液； 0013 (2)大豆叶酸提取：在步骤(1)样品。

13、匀浆液中加入8 L -淀粉酶和750 L叶酸提取缓冲液以避免粘稠，室温放置10min，加入100 L蛋白酶， 37孵育1h； 100煮沸10min，冰上迅速冷却10min；在4， 14000rpm条件下，离心10min；吸取上清，按照2的体积比在上清中加入大鼠血清10 L，混匀后，于37培养2h； 100煮沸灭活10min，冰上迅速冷却10min；在4 ， 14000rpm条件下，离心15min；吸取上清分装于灭菌管中直接测定或冻存于-80，得大豆叶酸提取液。 0014 另外，根据本发明上述实施例大豆种子叶酸的提取方法还可以具有如下附加的技术特征： 00。

14、15 所述大豆样品制备步骤一中所述在组织研磨机中研磨的转速为1400rpm，时间为 5min。所述大豆样品制备步骤一中所述研磨均需在避光条件下操作，大豆叶酸提取步骤均需在避光条件下操作。 0016 所述大豆样品制备步骤二中所述缓冲液的组分为pH值6.5的50mM磷酸缓冲液，加入1的抗坏血酸钠盐，以及0.1的2-巯基乙醇。 0017 本发明的第二个目的，是提供了一种大豆种子叶酸含量的测定方法，包括以下步骤： 0018 一、乳酸菌液体培养基的配制：将4.85g乳酸菌液体培养基加入100mL水中， 121 灭菌15min； 0019 二、低叶酸培养基的配制：称取4.7g叶。

15、酸培养基粉末、 0.03g抗环血酸、 0.3mL叶酸标准储配液，加水溶解定容至100mL，过0.22 m滤膜灭菌备用； 0020 三、分析缓冲液的配制：称取Na2HPO4.2H2O 0.38g、 NaH2PO40.93g、抗环血酸1g加水溶解定容至100mL，过0.22 m滤膜灭菌备用； 0021 四、叶酸培养基的配制：称取叶酸培养基粉末9.4g，加水溶解定容至100mL，煮沸说明书 2/9 页 4 CN 105440036 B 4 5min，过0.22 m滤膜灭菌备用； 0022 五、叶酸标准样品制备：称取28mg叶酸溶于4mL5的K2HPO4溶液中，然后用。

16、分析缓冲液定容至250mL，再吸取0.5mL此溶液用步骤三制得的分析缓冲液定容至100mL，得浓度为 0.5 g/mL的标准储备液FA，分装到1.5mL EP管中并保存于-20； 0023 六、指示菌的制备：吸取乳酸菌保存菌液500 L加入到10mL乳酸菌液体培养基中， 37摇床培养24h，再次吸取培养好的菌液0.5mL加入到100mL低叶酸培养基中， 37摇床培养18h；三角瓶置于冰上冷却 20min；将预冷的甘油与培养物混合(体积比为40： 60)，充分搅拌均匀；分装菌液于1.5mL EP管中，液氮速冻后于-80保存； 0024 七、叶酸含量测定：利用步骤一。

17、制得的分析缓冲液将步骤五制得的FA溶液稀释250 倍，得到FA-1溶液，按照2:1比例利用分析缓冲液稀释，得到FA-2溶液； FA-1和FA-2溶液均用于制作标准曲线；将叶酸样品短暂离心，用分析缓冲液稀释样品30倍；在96孔板中，将150 L 分析缓冲液加入每个样品孔后，再将150 L FA-1、 FA-2和大豆叶酸待测液分别加入96孔板的第1列，从第1列吸取混合液150 l至第2列，在从第2列吸取混合液150 l至第3列，再从第3 列吸取混合液150 l至第4列，在从第4列吸取混合液150 l至第5列，再从第5列吸取混合液 150 l至第6列，最后将第6列的样。

18、品混合液弃去其中150 l；将加入指示菌的FACM培养基150 L加入96孔板中；将培养板置于37培养18-20h；在波长为580nm条件下，测定样品的OD值；根据测定数值建立标准曲线并计算出样品中包含的叶酸浓度。 0025 本发明的技术效果在于： 0026 1、本发明采用的样品研磨方法来替代手动磨样或搅拌机研磨方法，可以同时对上百个样品同时进行提取，在高效完成提取过程的同时减少了试验误差。 0027 2、本发明选取可来源于米曲霉的 -淀粉酶及来自链霉菌的蛋白酶和大鼠血清来提取大豆中的叶酸。 0028 3、本发明确定了 -淀粉酶、蛋白酶和大鼠血清的组合在8 L， 10。

19、0 L及10 L的条件下能够最大程度地提取大豆种子中的叶酸。 0029 4、本发明确定了微生物法测定叶酸含量的方法：将叶酸标准样品用分析缓冲液稀释250倍，得到FA-1溶液，按照2:1比例利用分析缓冲液稀释，得到FA-2溶液； FA-1和FA-2溶液均用于制作标准曲线；将叶酸样品短暂离心，用分析缓冲液稀释样品30倍；在96孔板中，将150 L分析缓冲液加入每个样品孔后，再将150 L FA-1、 FA-2和大豆叶酸待测液分别加入 96孔板的第1列，从第1列吸取混合液150 l至第2列，在从第2列吸取混合液150 l至第3列，再从第3列吸取混合液150 l至第4列。

20、，在从第4列吸取混合液150 l至第5列，再从第5列吸取混合液150 l至第6列，最后将第6列的样品混合液弃去其中150 l；将加入指示菌的FACM培养基150 L加入96孔板中；将培养板置于37培养18-20h；在波长为580nm条件下，测定样品的OD值；根据测定数值建立标准曲线并计算出样品中包含的叶酸浓度。具体实施方式 0030 下面详细描述本发明的实施例，所用仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。 0031 实施例1大豆样品制备 0032 大豆种子粉碎获取豆粉，称取豆粉0.2g，置于2mL AXYGEN EP管中，三次重复。在每说明书 3/。

21、9 页 5 CN 105440036 B 5 份样品中加入750 L叶酸提取缓冲液(50mM磷酸缓冲液， PH6.5， 1抗坏血酸钠盐， 0.1 2-巯基乙醇)，在95孵育15min置于冰上冷却，之后加入5mm钢珠，在组织研磨机中研磨样品(转速为1400rpm，时间为5min)。样品研磨过程均需避光操作。 0033 实施例2大豆叶酸提取 0034 在样品匀浆液中加入8 L -淀粉酶和750 L叶酸提取缓冲液以避免粘稠，室温放置 10min，加入100 L蛋白酶， 37孵育1hr； 100煮沸上述混合物10min以终止酶作用，冰上迅速冷却10min；在4， 14000rpm。

22、条件下，离心10min；吸取上清，按照2的体积在上清中加入大鼠血清10 L，混匀后，于37培养2h； 100煮沸灭活10min，冰上迅速冷却10min；在4 ， 14000rpm条件下，离心15min；吸取上清分装于灭菌管中直接测定或冻存于-80。样品提取过程均需避光操作。 0035 实施例3大豆叶酸的微生物检测方法 0036 (1)试剂配制 0037 乳酸菌液体培养基： 4.85g乳酸菌培养基质加入100mL水中， 121灭菌15min。 0038 低叶酸培养基：称取4.7g叶酸培养基粉末、 0.03g抗环血酸、 0.3mL叶酸标准储配液，加水溶解定容至100m。

23、L，过0.22 m滤膜灭菌备用。 0039 分析缓冲液：称取Na2HPO4.2H2O 0.38g、 NaH2PO40.93g、抗环血酸1g加水溶解定容至 100mL，过0.22 m滤膜灭菌备用。 0040 叶酸培养基：称取叶酸培养基粉末9.4g，加水溶解定容至100mL，煮沸5min，过0.22 m滤膜灭菌备用。 0041 (2)叶酸标准样品制备 0042 称取28mg叶酸溶于4mL5的K2HPO4溶液中，然后用分析缓冲液定容至250mL，在吸取0.5mL此溶液用分析缓冲液定容至100mL，得浓度为0.5 g/mL的标准储备液FA，分装到 1.5mL EP管中并保存于。

24、-20。 0043 (3)指示菌的制备 0044 吸取乳酸菌保存菌液500 L加入到10mL乳酸菌液体培养基中， 37摇床培养24h，再次吸取培养好的菌液0.5mL加入到100mL低叶酸培养基中， 37摇床培养18h；三角瓶置于冰上冷却20min。将预冷的甘油与培养物混合(体积比为40： 60)，充分搅拌均匀；分装菌液于 1.5mL EP管中，液氮速冻后于-80保存。 0045 (4)叶酸含量测定 0046 利用分析缓冲液FA溶液稀释250倍，得到FA-1溶液，按照2:1比例利用分析缓冲液稀释，得到FA-2溶液； FA-1和FA-2溶液均用于制作标准曲线；将叶酸样品短暂。

25、离心，用分析缓冲液稀释样品30倍；在96孔板中，将150 L分析缓冲液加入每个样品孔后，再将150 L FA- 1、 FA-2和大豆叶酸待测液分别加入96孔板的第1列，从第1列吸取混合液150 l至第2列，在从第2列吸取混合液150 l至第3列，再从第3列吸取混合液150 l至第4列，在从第4列吸取混合液150 l至第5列，再从第5列吸取混合液150 l至第6列，最后将第6列的样品混合液弃去其中150 l；将加入指示菌的FACM培养基150 L加入96孔板中；将培养板置于37培养18- 20h；在波长为580nm条件下，测定样品的OD值；根据测定数值建立标。

26、准曲线并计算出样品中包含的叶酸浓度。 0047 实施例4：发明效果的检测说明书 4/9 页 6 CN 105440036 B 6 0048 对本发明中 -淀粉酶、蛋白酶和大鼠血清三种酶的使用量进行摸索及优化， -淀粉酶的使用量分别为2、 4、 8、 10和20 L，蛋白酶(使用浓度为10mg/mL)的使用量分别为40、 80、 100、 150和200 L，大鼠血清的使用量分别为0、 10、 20、 30、 40 L。将不同的酶使用量按照三因素五水平进行组合，共125组。对125个组合的大豆品种Williams 82进行叶酸含量测定， 3次重复，结果见表1。经计算不。

27、同浓度条件下的叶酸含量均值发现， -淀粉酶、蛋白酶和大鼠血清的组合在8 L， 100 L及10 L的条件下能够最大程度地提取大豆种子中的叶酸。 0049 表1大豆品种Williams 82在不同酶组合中的叶酸含量(单位： g/100g) 0050 说明书 5/9 页 7 CN 105440036 B 7 0051 说明书 6/9 页 8 CN 105440036 B 8 0052 0053 分别称取不同大豆品种0.2g，置于2mLEP管中，三次重复。在每份样品中加入750 L 叶酸提取缓冲液，在95孵育15min置于冰上冷却，之后加入5mm钢珠，在组织研磨机中研磨样品(转速为。

28、1400rpm，时间为5min)。 0054 在样品匀浆液中加入8 L -淀粉酶和750 L叶酸提取缓冲液以避免粘稠，室温放置 10min，加入100 L -蛋白酶， 37孵育1hr； 100煮沸上述混合物10min以终止酶作用，冰上迅速冷却10min；在4， 14000rpm条件下，离心10min；在上清中加入大鼠血清10 L，混匀后，于37培养2hr； 100煮沸灭活10min，冰上迅速冷却10min；在4， 14000rpm条件下，离心 15min；吸取上清分装于灭菌管中直接测定。 0055 用分析缓冲液将标准储备液FA溶液稀释250倍，得到FA-1溶液，。

29、按照2:1比例利用分析缓冲液稀释，得到FA-2溶液。 FA-1和FA-2溶液均用于制作标准曲线；将叶酸样品短暂离心，用分析缓冲液稀释样品30倍。在96孔板中，将150 L分析缓冲液加入每个样品孔后，再将 150 L FA-1、 FA-2和提取水稻叶酸样品分别加入96孔板的第1列或第7列，从第1列或第7列吸取混合液150 l至第2孔或第8孔，依次类推，待第6列或第12列的样品混合液体积为300 L 后，弃去其中150 l；将加入指示菌的FACM培养基150 L加入96孔板中(指示菌/FACM培养基的比例为1:100)；将培养板置于37培养18-20hr；在波长为580nm条件下，测定样品的OD 值；根据测定数值建立标准曲线并计算出样品中包含的叶酸浓度。结果见表2. 0056 表2121份北方地区大豆种子的叶酸含量(单位： g/100g) 说明书 7/9 页 9 CN 105440036 B 9 0057 说明书 8/9 页 10 CN 105440036 B 10 0058 说明书 9/9 页 11 CN 105440036 B 11 。

摘要
申请专利号：	CN201610004854.6	申请日：	20160105
公开号：	CN105440036B	公开日：	20170308
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C07D475/04,G01N21/31	主分类号：	C07D475/04,G01N21/31
申请人：	吉林省农业科学院
发明人：	张玲,孟繁磊,张原宇,王玉民,李海云,邢国杰,董英山
地址：	133000 吉林省长春市生态大街1363号
优先权：	CN201610004854A
专利代理机构：	北京世誉鑫诚专利代理事务所(普通合伙)	代理人：	孙国栋
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内容摘要

本发明属于植物提取物的制备领域，具体地涉及一种大豆种子中叶酸的提取方法。人类和动物不能自身合成叶酸，各种作物是人类和动物获取这一维生素的主要来源。作物中叶酸的提取，常用的有单酶法和三酶法。不同食物中使用的三酶法提取条件是不同的，有必要对每种类型食物分别进行叶酸提取的优化。本发明提供了一种优化的从大豆种子中提取叶酸的方法，利用本方法，可以同时对上百个样品同时进行提取，使提取过程快捷高效。

权利要求书

1.从大豆中提取叶酸的方法，包括以下步骤：(1)大豆样品制备：大豆种子粉碎获取豆粉，称取0.2g豆粉，置于AXYGENEP管中，在样品中加入750μL叶酸提取缓冲液，95℃孵育15min置于冰上冷却，加入5mm钢珠2粒，在组织研磨机中研磨样品，获得样品匀浆液；(2)大豆叶酸提取：在步骤(1)样品匀浆液中加入8μLα-淀粉酶和750μL叶酸提取缓冲液以避免粘稠，室温放置10min，加入100μL蛋白酶，37℃孵育1h；100℃煮沸10min，冰上迅速冷却10min；在4℃，14000rpm条件下，离心10min；吸取上清，按照2％的体积比在上清中加入大鼠血清10μL，混匀后，于37℃培养2h；100℃煮沸灭活10min，冰上迅速冷却10min；在4℃，14000rpm条件下，离心15min；吸取上清分装于灭菌管中直接测定或冻存于-80℃，得大豆叶酸提取液，叶酸提取缓冲液成分：50mM磷酸缓冲液，PH＝6.5，1％抗坏血酸钠盐，0.1％2-巯基乙醇。 2.根据权利要求1所述的从大豆中提取叶酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)大豆样品制备和步骤(2)大豆叶酸提取，均在避光条件下进行。

说明书

技术领域

本发明属于植物提取物的制备，具体地涉及一种大豆种子的提取和含量的测定方法。

背景技术

叶酸是水溶性B维生素，叶酸缺乏会引起婴儿神经管缺陷、癌症和心血管疾病等严重的健康问题(Kim et al.,1998；Geisel,2003；Choi&Friso,2005；Marisa et al.,2005)。人类和动物不能自身合成叶酸，各种作物是人类和动物获取这一维生素的主要来源。然而，在作物中叶酸的含量通常很低，尤其是在谷物中含量更低，如何获得作物中各种叶酸衍生物含量的可靠数据是这一研究领域的关键问题。作物中叶酸的提取，常用的有单酶法和三酶法。单酶法针对菠菜、黄瓜、卷心菜和香蕉等食物中的叶酸提取有效(Iwatani et al.,2003；Zhang et al.,2005)。三酶法对谷物类，土豆，豆类等的叶酸含量的提取效率高于单酶法，三酶法相对于单酶法能够更完全地提取富含碳水化合物或蛋白基质的叶酸(De Souza&Eitenmiller,1990；Tamura et al,1997；Pffeifer et al,1997；Rader et al,1998；Aiso&Tamura,1998)。Hyun等(2005)研究的食物叶酸提取步骤，适量样品在提取液中研磨成匀浆，匀浆液分装后冻存于-70℃直至叶酸提取，加入蛋白酶处理样品后，100℃煮沸样品灭活蛋白酶，再利用α-淀粉酶和叶酸轭合酶共同孵育样品2小时，经离心后获取叶酸样品，与-70℃冻存样品。但是不同食物中使用的三酶法提取条件是不同的(Aiso&Tamura,1998；Pandrangi et al.,2004)，有必要对每种类型食物分别进行叶酸提取的优化。

目前国内国际流行的作物中叶酸含量检测方法是微生物法和高效液相色谱法。高效液相色谱法利用C18色谱柱进行样品分离后，结合紫外吸收，荧光检测和电化学检测能够对单个叶酸组分进行定量分析。高效液相色谱法能够快速、高效地分离不同叶酸衍生物，样品用量少，但是该方法的灵敏度低于微生物法，而且内源叶酸会干扰叶酸测定，给某些形式的叶酸定量带来困难(Zhang et al.,2005；Póo-Prieto et al.,2006)。微生物法(Microbiological Assay)是检测叶酸的经典方法，其原理是指示菌对叶酸的所有衍生物具有相同的生长反应速度，在一定条件下，微生物的生长繁殖与培养基中叶酸含量呈正比关系，根据微生物对样品中叶酸的吸收程度从而对叶酸进行定量(常娜宁等，2010)。酪乳酸杆菌对单谷氨酸叶酸、二或三谷氨酸叶酸及其还原型衍生物均敏感，是最为常用的菌种(Hyun et al.,2005)。叶酸分析中要求不同样品具有适当的稀释倍数，使用96孔酶标板对指示菌进行18-24h培养，并在分光光度计读取数值后计算样品中叶酸的含量。微生物法灵敏度高，结果准确，但重复性较差,而且只能检测总叶酸含量,但优点是不需要贵重的仪器或药品,所以成本较低,适用于大批量的样品检测。

综上，有必要对大豆叶酸三酶法提取和微生物检测的方法进行优化，确定三种酶的最佳配比和微生物法检测的步骤，为筛选高叶酸含量的大豆优异种质提供科学的依据。

发明内容

发明旨在解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种大豆种子叶酸的提取和含量检测方法，旨在建立三酶法提取及微生物检测大豆种子中叶酸含量的方法，为筛选高叶酸含量的大豆优异种质提供科学的依据。

本发明用到的材料和仪器如下：

一、材料和试剂

常规药品为国产分析纯试剂；磷酸缓冲液(AMERESCO公司生产)；叶酸(Sigma公司)；α-淀粉酶(来源于米曲霉)和蛋白酶(来源于链霉素)(Sigma公司)；大鼠血清(中科晨宇(北京)贸易有限公司)；乳酸菌液体培养基和叶酸培养基购自北京鼎国生物技术有限公司；乳酸菌菌株购自北京中原合聚经贸有限公司；

二、仪器与设备

AXYGEN系列EP管(自经科宏达公司)；叶酸检测试剂盒(P1001)购自德国拜发生物有限公司；高通量组织研磨机SPEX Geno 2000(美国SPEX公司生产)；3-30K高速台式冷冻离心机(德国SIGMA)；酶标仪(美国Dynex Magellan Biosciences)。

本发明提供了一种大豆种子叶酸的提取方法，包括以下步骤：

(1)大豆样品制备：大豆种子粉碎获取豆粉，称取0.2g豆粉，置于AXYGEN EP管中，在样品中加入750μL叶酸提取缓冲液，95℃孵育15min置于冰上冷却，加入5mm钢珠(2粒)，在组织研磨机中研磨样品，获得样品匀浆液；

(2)大豆叶酸提取：在步骤(1)样品匀浆液中加入8μLα-淀粉酶和750μL叶酸提取缓冲液以避免粘稠，室温放置10min，加入100μL蛋白酶，37℃孵育1h；100℃煮沸10min，冰上迅速冷却10min；在4℃，14000rpm条件下，离心10min；吸取上清，按照2％的体积比在上清中加入大鼠血清10μL，混匀后，于37℃培养2h；100℃煮沸灭活10min，冰上迅速冷却10min；在4℃，14000rpm条件下，离心15min；吸取上清分装于灭菌管中直接测定或冻存于-80℃，得大豆叶酸提取液。

另外，根据本发明上述实施例大豆种子叶酸的提取方法还可以具有如下附加的技术特征：

所述大豆样品制备步骤一中所述在组织研磨机中研磨的转速为1400rpm，时间为5min。所述大豆样品制备步骤一中所述研磨均需在避光条件下操作，大豆叶酸提取步骤均需在避光条件下操作。

所述大豆样品制备步骤二中所述缓冲液的组分为pH值6.5的50mM磷酸缓冲液，加入1％的抗坏血酸钠盐，以及0.1％的2-巯基乙醇。

本发明的第二个目的，是提供了一种大豆种子叶酸含量的测定方法，包括以下步骤：

一、乳酸菌液体培养基的配制：将4.85g乳酸菌液体培养基加入100mL水中，121℃灭菌15min；

二、低叶酸培养基的配制：称取4.7g叶酸培养基粉末、0.03g抗环血酸、0.3mL叶酸标准储配液，加水溶解定容至100mL，过0.22μm滤膜灭菌备用；

三、分析缓冲液的配制：称取Na2HPO4.2H2O 0.38g、NaH2PO40.93g、抗环血酸1g加水溶解定容至100mL，过0.22μm滤膜灭菌备用；

四、叶酸培养基的配制：称取叶酸培养基粉末9.4g，加水溶解定容至100mL，煮沸5min，过0.22μm滤膜灭菌备用；

五、叶酸标准样品制备：称取28mg叶酸溶于4mL5％的K2HPO4溶液中，然后用分析缓冲液定容至250mL，再吸取0.5mL此溶液用步骤三制得的分析缓冲液定容至100mL，得浓度为0.5μg/mL的标准储备液FA，分装到1.5mL EP管中并保存于-20℃；

六、指示菌的制备：吸取乳酸菌保存菌液500μL加入到10mL乳酸菌液体培养基中，37℃摇床培养24h，再次吸取培养好的菌液0.5mL加入到100mL低叶酸培养基中，37℃摇床培养18h；三角瓶置于冰上冷却 20min；将预冷的甘油与培养物混合(体积比为40：60)，充分搅拌均匀；分装菌液于1.5mL EP管中，液氮速冻后于-80℃保存；

七、叶酸含量测定：利用步骤一制得的分析缓冲液将步骤五制得的FA溶液稀释250倍，得到FA-1溶液，按照2:1比例利用分析缓冲液稀释，得到FA-2溶液；FA-1和FA-2溶液均用于制作标准曲线；将叶酸样品短暂离心，用分析缓冲液稀释样品30倍；在96孔板中，将150μL分析缓冲液加入每个样品孔后，再将150μL FA-1、FA-2和大豆叶酸待测液分别加入96孔板的第1列，从第1列吸取混合液150μl至第2列，在从第2列吸取混合液150μl至第3列，再从第3列吸取混合液150μl至第4列，在从第4列吸取混合液150μl至第5列，再从第5列吸取混合液150μl至第6列，最后将第6列的样品混合液弃去其中150μl；将加入指示菌的FACM培养基150μL加入96孔板中；将培养板置于37℃培养18-20h；在波长为580nm条件下，测定样品的OD值；根据测定数值建立标准曲线并计算出样品中包含的叶酸浓度。

本发明的技术效果在于：

1、本发明采用的样品研磨方法来替代手动磨样或搅拌机研磨方法，可以同时对上百个样品同时进行提取，在高效完成提取过程的同时减少了试验误差。

2、本发明选取可来源于米曲霉的α-淀粉酶及来自链霉菌的蛋白酶和大鼠血清来提取大豆中的叶酸。

3、本发明确定了α-淀粉酶、蛋白酶和大鼠血清的组合在8μL，100μL及10μL的条件下能够最大程度地提取大豆种子中的叶酸。

4、本发明确定了微生物法测定叶酸含量的方法：将叶酸标准样品用分析缓冲液稀释250倍，得到FA-1溶液，按照2:1比例利用分析缓冲液稀释，得到FA-2溶液；FA-1和FA-2溶液均用于制作标准曲线；将叶酸样品短暂离心，用分析缓冲液稀释样品30倍；在96孔板中，将150μL分析缓冲液加入每个样品孔后，再将150μL FA-1、FA-2和大豆叶酸待测液分别加入96孔板的第1列，从第1列吸取混合液150μl至第2列，在从第2列吸取混合液150μl至第3列，再从第3列吸取混合液150μl至第4列，在从第4列吸取混合液150μl至第5列，再从第5列吸取混合液150μl至第6列，最后将第6列的样品混合液弃去其中150μl；将加入指示菌的FACM培养基150μL加入96孔板中；将培养板置于37℃培养18-20h；在波长为580nm条件下，测定样品的OD值；根据测定数值建立标准曲线并计算出样品中包含的叶酸浓度。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所用仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1大豆样品制备

大豆种子粉碎获取豆粉，称取豆粉0.2g，置于2mL AXYGEN EP管中，三次重复。在每份样品中加入750μL叶酸提取缓冲液(50mM磷酸缓冲液，PH＝6.5，1％抗坏血酸钠盐，0.1％2-巯基乙醇)，在95℃孵育15min置于冰上冷却，之后加入5mm钢珠，在组织研磨机中研磨样品(转速为1400rpm，时间为5min)。样品研磨过程均需避光操作。

实施例2大豆叶酸提取

在样品匀浆液中加入8μLα-淀粉酶和750μL叶酸提取缓冲液以避免粘稠，室温放置10min，加入100μL蛋白酶，37℃孵育1hr；100℃煮沸上述混合物10min以终止酶作用，冰上迅速冷却10min；在4℃， 14000rpm条件下，离心10min；吸取上清，按照2％的体积在上清中加入大鼠血清10μL，混匀后，于37℃培养2h；100℃煮沸灭活10min，冰上迅速冷却10min；在4℃，14000rpm条件下，离心15min；吸取上清分装于灭菌管中直接测定或冻存于-80℃。样品提取过程均需避光操作。

实施例3大豆叶酸的微生物检测方法

(1)试剂配制

乳酸菌液体培养基：4.85g乳酸菌培养基质加入100mL水中，121℃灭菌15min。

低叶酸培养基：称取4.7g叶酸培养基粉末、0.03g抗环血酸、0.3mL叶酸标准储配液，加水溶解定容至100mL，过0.22μm滤膜灭菌备用。

分析缓冲液：称取Na2HPO4.2H2O 0.38g、NaH2PO40.93g、抗环血酸1g加水溶解定容至100mL，过0.22μm滤膜灭菌备用。

叶酸培养基：称取叶酸培养基粉末9.4g，加水溶解定容至100mL，煮沸5min，过0.22μm滤膜灭菌备用。

(2)叶酸标准样品制备

称取28mg叶酸溶于4mL5％的K2HPO4溶液中，然后用分析缓冲液定容至250mL，在吸取0.5mL此溶液用分析缓冲液定容至100mL，得浓度为0.5μg/mL的标准储备液FA，分装到1.5mL EP管中并保存于-20℃。

(3)指示菌的制备

吸取乳酸菌保存菌液500μL加入到10mL乳酸菌液体培养基中，37℃摇床培养24h，再次吸取培养好的菌液0.5mL加入到100mL低叶酸培养基中，37℃摇床培养18h；三角瓶置于冰上冷却20min。将预冷的甘油与培养物混合(体积比为40：60)，充分搅拌均匀；分装菌液于1.5mL EP管中，液氮速冻后于-80℃保存。

(4)叶酸含量测定

利用分析缓冲液FA溶液稀释250倍，得到FA-1溶液，按照2:1比例利用分析缓冲液稀释，得到FA-2溶液；FA-1和FA-2溶液均用于制作标准曲线；将叶酸样品短暂离心，用分析缓冲液稀释样品30倍；在96孔板中，将150μL分析缓冲液加入每个样品孔后，再将150μL FA-1、FA-2和大豆叶酸待测液分别加入96孔板的第1列，从第1列吸取混合液150μl至第2列，在从第2列吸取混合液150μl至第3列，再从第3列吸取混合液150μl至第4列，在从第4列吸取混合液150μl至第5列，再从第5列吸取混合液150μl至第6列，最后将第6列的样品混合液弃去其中150μl；将加入指示菌的FACM培养基150μL加入96孔板中；将培养板置于37℃培养18-20h；在波长为580nm条件下，测定样品的OD值；根据测定数值建立标准曲线并计算出样品中包含的叶酸浓度。

实施例4：发明效果的检测

对本发明中α-淀粉酶、蛋白酶和大鼠血清三种酶的使用量进行摸索及优化，α-淀粉酶的使用量分别为2、4、8、10和20μL，蛋白酶(使用浓度为10mg/mL)的使用量分别为40、80、100、150和200μL，大鼠血清的使用量分别为0、10、20、30、40μL。将不同的酶使用量按照三因素五水平进行组合，共125组。对125个组合的大豆品种Williams 82进行叶酸含量测定，3次重复，结果见表1。经计算不同浓度条件下的叶酸含量均值发现，α-淀粉酶、蛋白酶和大鼠血清的组合在8μL，100μL及10μL的条件下能够最大程度地提取大豆种子中的叶酸。

表1大豆品种Williams 82在不同酶组合中的叶酸含量(单位：μg/100g)

分别称取不同大豆品种0.2g，置于2mLEP管中，三次重复。在每份样品中加入750μL叶酸提取缓冲液，在95℃孵育15min置于冰上冷却，之后加入5mm钢珠，在组织研磨机中研磨样品(转速为1400rpm，时间为5min)。

在样品匀浆液中加入8μLα-淀粉酶和750μL叶酸提取缓冲液以避免粘稠，室温放置10min，加入100μLα-蛋白酶，37℃孵育1hr；100℃煮沸上述混合物10min以终止酶作用，冰上迅速冷却10min；在4℃，14000rpm条件下，离心10min；在上清中加入大鼠血清10μL，混匀后，于37℃培养2hr；100℃煮沸灭活10min，冰上迅速冷却10min；在4℃，14000rpm条件下，离心15min；吸取上清分装于灭菌管中直接测定。

用分析缓冲液将标准储备液FA溶液稀释250倍，得到FA-1溶液，按照2:1比例利用分析缓冲液稀释，得到FA-2溶液。FA-1和FA-2溶液均用于制作标准曲线；将叶酸样品短暂离心，用分析缓冲液稀释样品30倍。在96孔板中，将150μL分析缓冲液加入每个样品孔后，再将150μL FA-1、FA-2和提取水稻叶酸样品分别加入96孔板的第1列或第7列，从第1列或第7列吸取混合液150μl至第2孔或第8孔，依次类推，待第6列或第12列的样品混合液体积为300μL后，弃去其中150μl；将加入指示菌的FACM培养基150μL加入96孔板中(指示菌/FACM培养基的比例为1:100)；将培养板置于37℃培养18-20hr；在波长为580nm条件下，测定样品的OD值；根据测定数值建立标准曲线并计算出样品中包含的叶酸浓度。结果见表2.

表2121份北方地区大豆种子的叶酸含量(单位：μg/100g)