线粒体功能保护剂及其制备方法与应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510414874.6 (22)申请日 2015.07.16 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105001261 A (43)申请公布日 2015.10.28 (73)专利权人 中国人民解放军第四军医大学 地址 710032 陕西省西安市长乐西路17号 (72)发明人 王海波高鹏鹿成韬孙晓莉 丁桂荣 (74)专利代理机构 西安西达专利代理有限责任 公司 61202 代理人 谢钢 (51)Int.Cl. C07F 9/6558(2006.01) A61K 31。

2、/675(2006.01) A61P 25/28(2006.01) A61P 25/16(2006.01) 审查员 夏家栋 (54)发明名称 线粒体功能保护剂及其制备方法与应用 (57)摘要 本发明涉及结构式 （I） 所示的线粒体功能保 护剂及其制备方法与其在治疗帕金森和阿尔茨 海默病中的应用， 其中R1， R2， R3， R4独立的选自- NO2， -OH， -F， -Cl， -Br， -H， -OCH3， -CH3； n=19。 本 发明线粒体功能保护剂以三苯基膦阳离子为结 构单元， 与抗氧化成分 （氮氧自由基单元） 以共价 键结合， 以电位依赖方式在细胞膜电位和线粒体 膜电位共同驱动下，。

3、 带动整个分子快速富集于线 粒体， 从而实现新药分子的线粒体靶向性。 权利要求书1页 说明书8页 CN 105001261 B 2017.04.12 CN 105001261 B 1.结构通式 （I） 所示化合物的制备方法， 其特征在于： ， 其中， R1， R2， R3， R4独立的选自-NO2， -OH， -F， -Cl， -Br， -H， -OCH3， -CH3； n = 19； 技术路线如下， 。 2.根据权利要求1所述化合物的制备方法， 其特征在于包括以下步骤， （1） 将1H-吲哚-2-甲醛加到CH2Cl2中， 加入三乙胺和溴代酰溴进行反应， 反应结束后分 离出有机相， 洗涤、 干。

4、燥得白色固体产物； （2） 将上述白色产物和二羟胺溶于甲醇中回流反应， 生成的白色固体经过滤、 洗涤后， 将滤饼悬浮于CH2Cl2中， 在冰水浴下加入饱和NaIO4水溶液反应， 静置分层后， 水相用CH2Cl2 萃取， 合并有机相， 除去溶剂， 柱层析纯化得产物； （3） 在氮气保护下， 将步骤 （2） 产物和三苯基膦加到甲苯中， 加热至100反应， 减压除 去溶剂得到白色固体。 3.根据权利要求2所述化合物的制备方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中， 将白色固体溶解在 丙酮中， 用乙醚进行沉淀， 进一步纯化得到白色固体。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105001261 B 2 线粒体。

5、功能保护剂及其制备方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及一种线粒体功能保护剂及其制备方法与其在治疗帕金森和阿尔茨海 默病中的应用， 属于医药技术领域。 背景技术 0002 神经退行性疾病是一类临床表现为不同程度的记忆力、 感觉能力、 判断力、 思维能 力和运动能力等受损的慢性进行性神经系统变性疾病。 该类疾病主要包括阿尔茨海默症 （即老年痴呆症） 、 帕金森氏症及脊髓肌萎缩症等。 随着世界人口老龄化的到来， 神经退行性 疾病的发病率呈逐年上升趋势。 目前我国60岁以上的老龄人口已超过1.2亿， 神经退行性疾 病已成为威胁老年人健康的严重疾病。 0003 目前， 神经退行性疾病仍以药物治疗占。

6、主导地位， 例如临床上治疗帕金森症的药 物主要为影响多巴胺能神经药物左旋多巴和抗胆碱药物苯海索等， 然而这些药物不良反应 明显。 近期研究表明， 自由基和氧化应激反应造成的原发性神经元变性是神经退行性疾病 的一种重要致病因素。 大脑是人体耗氧量最多的一个器官， 代谢过程中容易产生大量的自 由基。 研究表明， 各种神经退行性疾病的发生均伴随着脑内氧化应激水平的增高， 脑细胞内 大分子物质过氧化， 产生大量有害氧自由基， 从而导致神经元细胞死亡或凋亡。 线粒体是氧 化损伤的主要靶细胞器。 虽然现有的抗氧化剂种类繁多， 如维生素E （生育酚） 、 辅酶Q、 姜黄 素等， 但由于这些传统的抗氧化剂选择。

7、性差， 并不能选择性的进入ROS爆发的线粒体， 对抵 抗神经退行性疾病引起的氧化损伤作用有限。 这提示线粒体靶向的抗氧化剂将会克服传统 抗氧化剂效能不足的缺点。 因此， 能够保护线粒体功能的新型靶向抗氧化剂已成为现阶段 研究治疗神经退行性疾病药物的新方向， 将具有重要的理论意义和临床应用前景。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一类含有可高效清除有害自由基的 “氮氧自由基” 结构单 元和具有线粒体靶向功能的三苯基膦阳离子结构单元的线粒体功能保护剂及其制备方法 与其在治疗帕金森和阿尔茨海默病中的应用。 0005 本发明的实现过程如下： 0006 结构通式 （I） 所示的化合物， 说明书 1。

8、/8 页 3 CN 105001261 B 3 0007 0008 其中， R1， R2， R3， R4独立的选自-NO2， -OH， -F， -Cl， -Br， -H， -OCH3， -CH3； 0009 n = 19。 0010 代表性结构如下， 0011 0012 0013 结构通式 （I） 所示的化合物的制备方法， 其技术路线为， 说明书 2/8 页 4 CN 105001261 B 4 0014 。 0015 结构通式 （I） 所示的化合物的制备方法， 包括以下步骤， 0016 （1） 将1H-吲哚-2-甲醛加到CH2Cl2中， 加入三乙胺和溴代酰溴进行反应， 反应结束 后分离出有机。

9、相， 洗涤、 干燥得白色固体产物； 0017 （2） 将上述白色产物和二羟胺溶于甲醇中回流反应， 生成的白色固体经过滤、 洗涤 后， 将滤饼悬浮于CH2Cl2中， 在冰水浴下加入饱和NaIO4水溶液反应， 静置分层后， 水相用 CH2Cl2萃取， 合并有机相， 除去溶剂， 柱层析纯化得产物； 0018 （3） 在氮气保护下， 将步骤 （2） 产物和三苯基膦加到甲苯中， 加热至100反应， 减 压除去溶剂得到白色固体。 0019 上述步骤 （3） 中， 将白色固体溶解在丙酮中， 然后用乙醚进行沉淀可进一步纯化。 0020 上述化合物可应用在制备抗帕金森和抗阿尔茨海默症单体药物或药物组合物中。 0。

10、021 上述药物是片剂、 胶囊剂、 散剂、 丸剂、 颗粒剂或乳剂。 0022 研究证实， 线粒体作为细胞能量的供给站， 供给神经元几乎全部能量需求， 是体内 主要的氧消耗场所， 是细胞内有害自由基 （活性氧ROS和活性氮RNS） 产生的主要部位， 也是 更强烈氧化应激的发源地， 是导致神经元损伤的重要原因。 传统的抗氧化剂选择性不强， 不 具备线粒体靶向性。 本发明提供了一类能高效清除有害自由基、 保护神经元细胞、 具有靶向 治疗帕金森、 老年性痴呆症等神经退行性疾病的氮氧自由基类药物结构， 其以三苯基膦阳 离子为结构单元， 将其与抗氧化成分 （氮氧自由基单元） 以共价键结合， 以电位依赖方式。

11、， 在 细胞膜电位和线粒体膜电位共同驱动下， 带动整个分子快速富集于线粒体， 从而实现新药 分子的线粒体靶向性。 同时， 三苯基膦阳离子与溴离子、 氯离子等结合成盐， 一方面使分子 具有较好的水溶性， 另一方面分子具有的亲脂性三苯基膦阳离子仍然可以很容易地通过生 物膜的疏水核心， 因此不需要特定的蛋白质载体。 本发明中涉及的新药分子对线粒体抗氧 化损伤的保护程度比传统的无选择性的抗氧化剂高出很多倍， 对老年痴呆症具有明显的抑 制作用， 效果强于阳性对照药姜黄素。 通过体外药效学试验证明： 该类药物对线粒体具有明 说明书 3/8 页 5 CN 105001261 B 5 确的保护作用， 对老年痴。

12、呆和帕金森有明显的治疗作用， 效果优于阳性对照药TEMPOL和姜 黄素。 具体实施方式 0023 实施例1： 化合物1的合成方法 0024 在4.41g （30 mmol） 1H-吲哚-2-甲醛和加到100 mL CH2Cl2中， 加入三乙胺4.4 mL， 在冰浴下磁力搅拌， 然后向反应液中缓慢滴加含有2.01 g （30 mmol） 溴代乙酰溴的30 mL CH2Cl2溶液。 滴加完毕后除去冰浴， 室温搅拌反应24 h， 分离出有机相， 用水洗涤两次， 有机 相用无水MgSO4干燥， 除去溶剂得白色固体产物， 柱层析纯化得产物7.16 g， 产率89%。 MS(m/ z): 266.01M+。

13、; 1H NMR(CDCl3): d 9.25 (s, 1H), 7.23(d, 1H), 7.20(d, 1H), 7.14 (s, 1H), 7.04(s, 1H), 4.90(m, 1H), 4.25(s, 1H), 3.11(d, 2H); Anal. Calcd for C11H10BrNO2: C,49.28; H, 3.76; N,5.22, Found: C,49.21; H, 3.79; N,5.28%。 0025 将上述产物2.68 g （10.0 mmol） 和1.48 g （10.0 mmol） 二羟胺溶于40 mL甲醇中， 回流反应12 h。 有白色固体生成， 过滤，。

14、 滤饼用少量甲醇洗涤。 将滤饼悬浮于30.0 mL CH2Cl2 中， 在冰水浴下加入饱和NaIO4水溶液， 搅拌1015min后停止反应。 静置分层后， 水相用10mL CH2Cl2萃取两次， 合并有机相， MgSO4干燥过夜， 过滤， 滤液减压除去溶剂， 柱层析纯化得产物 2.64 g， 产率67%。 MS(m/z) 394.22M+. Anal. Calcd for C17H21BrN3O3: C, 51.66; H, 5.36; N, 10.63. Found: C, 51.69; H, 5.34; N, 10.58. ESR: aN = 8.13 G, g = 2.0095。 002。

15、6 在氮气保护下， 将上步产物0.39 g （1.0 mmol） 和三苯基膦 （1.31 g， 5.0 mmol， 5 eq） 加到30 mL甲苯中， 加热至100， 搅拌反应 6h， 减压除去溶剂得到白色固体， 将固体溶 解在最小体积的丙酮 （约10mL） 中， 用乙醚从溶液中进行沉淀 （5次以上） 得到白色固体， 每一 次沉淀后轻轻倒出溶剂再进行沉淀最终得到产物0.45 g， 产率为69。 MS(m/z) 656.71M +. Anal. Calcd for C35H36BrN3O3P: C, 63.93; H, 5.52; N, 6.39. Found: C, 63.98; H, 5.5。

16、7; N, 6.31. ESR: aN = 7.98 G, g = 2.0076。 0027 实施例2： 化合物2的合成方法 0028 在6.21g （30 mmol） 5-甲氧基-6-甲氧基-1H-吲哚-2-甲醛和加到100 mL CH2Cl2中， 加入三乙胺4.4 mL， 在冰浴下磁力搅拌， 然后向反应液中缓慢滴加含有2.01 g （30 mmol） 溴 代丙酰溴的30 mL CH2Cl2溶液。 滴加完毕后除去冰浴， 室温搅拌反应24 h， 分离出有机相， 用 水洗涤两次， 有机相用无水MgSO4干燥， 除去溶剂得白色固体产物， 柱层析纯化得产物7.98 g， 产率78%。 MS(m/z)。

17、: 341.62 M+; 1H NMR(CDCl3): d 9.59 (d, 1H), 6.84(s, 1H), 6.73(s, 1H), 4.87(m, 1H), 3.81(s, 6H), 3.71(m, 2H), 3.15(m, 2H), 2.74(m, 2H); Anal. Calcd for C14H16BrNO2: C,49.14; H, 4.71; N,4.09, Found: C,49.17; H, 4.70; N,4.13%。 0029 将上述产物3.42 g （10.0 mmol） 和1.48 g （10.0 mmol） 二羟胺溶于40 mL甲醇中， 回流反应12 h。 有白。

18、色固体生成， 过滤， 滤饼用少量甲醇洗涤。 将滤饼悬浮于30.0 mL CH2Cl2 中， 在冰水浴下加入饱和NaIO4水溶液， 搅拌1015min后停止反应。 静置分层后， 水相用10mL CH2Cl2萃取两次， 合并有机相， MgSO4干燥过夜， 过滤， 滤液减压除去溶剂， 柱层析纯化得产物 2.76 g， 产率59%。 MS(m/z) 468.19M+. Anal. Calcd for C20H27BrN3O5: C, 51.18; H, 说明书 4/8 页 6 CN 105001261 B 6 5.80; N, 8.95. Found: C, 51.13; H, 5.87; N, 8.。

19、90. ESR: aN = 7.41 G, g = 2.0035。 0030 在氮气保护下， 将上步产物0.47 g （1.0 mmol） 和三苯基膦 （1.31 g， 5.0 mmol， 5 eq） 加到30 mL甲苯中， 加热至100， 搅拌反应 6h， 减压除去溶剂得到白色固体， 将固体溶 解在最小体积的丙酮 （约10mL） 中， 用乙醚从溶液中进行沉淀 （5次以上） 得到白色固体， 每一 次沉淀后轻轻倒出溶剂再进行沉淀最终得到产物0.52 g， 产率为71。 MS(m/z) 730.29M +. Anal. Calcd for C38H42BrN3O5P: C, 62.38; H, 5。

20、.79; N, 5.74. Found: C, 62.32; H, 5.75; N, 5.78. ESR: aN = 8.24 G, g = 2.0068。 0031 实施例3： 化合物5的合成方法 0032 在5.76g （30 mmol） 7-硝基-1H-吲哚-2-甲醛和加到100 mL CH2Cl2中， 加入三乙胺 4.4 mL， 在冰浴下磁力搅拌， 然后向反应液中缓慢滴加含有2.01 g （30 mmol） 溴代十一碳酰 溴的30 mL CH2Cl2溶液。 滴加完毕后除去冰浴， 室温搅拌反应24 h， 分离出有机相， 用水洗涤 两次， 有机相用无水MgSO4干燥， 除去溶剂得白色固体产。

21、物， 柱层析纯化得产物8.14 g， 产率 62%。 MS(m/z): 438.23M+; 1H NMR(CDCl3): d 9.72 (d, 1H), 8.17(d, 1H), 7.53(d, 1H), 7.39(d, 1H), 4.83(m, 1H), 3.32(m, 2H) 3.15(d, 2H), 2.241.23(m, 18H); Anal. Calcd for C20H27BrN2O4: C,54.68; H, 6.19; N,6.38, Found: C,54.62; H, 6.23; N,6.34%。 0033 将上述产物4.38 g （10.0 mmol） 和1.48 g （。

22、10.0 mmol） 二羟胺溶于40 mL甲醇中， 回流反应12 h。 有白色固体生成， 过滤， 滤饼用少量甲醇洗涤。 将滤饼悬浮于30.0 mL CH2Cl2 中， 在冰水浴下加入饱和NaIO4水溶液， 搅拌1015min后停止反应。 静置分层后， 水相用10mL CH2Cl2萃取两次， 合并有机相， MgSO4干燥过夜， 过滤， 滤液减压除去溶剂， 柱层析纯化得产物 4.13 g， 产率73%。 MS(m/z) 566.47M+. Anal. Calcd for C26H38BrN4O5: C, 55.12; H, 6.76; N, 9.89. Found: C, 55.17; H, 6.。

23、73; N, 9.81. ESR: aN = 7.64 G, g = 2.0077。 0034 在氮气保护下， 将上步产物0.56 g （1.0 mmol） 和三苯基膦 （1.31 g， 5.0 mmol， 5 eq） 加到30 mL甲苯中， 加热至100， 搅拌反应 6h， 减压除去溶剂得到白色固体， 将固体溶 解在最小体积的丙酮 （约10mL） 中， 用乙醚从溶液中进行沉淀 （5次以上） 得到白色固体， 每一 次沉淀后轻轻倒出溶剂再进行沉淀最终得到产物0.58 g， 产率为70。 MS(m/z) 827.34M +. Anal. Calcd for C44H53BrN4O5P: C, 63。

24、.76; H, 6.45; N, 6.76. Found: C, 63.72; H, 6.49; N, 6.71. ESR: aN = 7.36 G, g = 2.0091。 0035 实施例4： 化合物1治疗帕金森模型的药效学实验 0036 （1） 动物模型复制及给药： 雄性SD大鼠30只， 体重180220g， 购自第四军医大学实 验动物中心。 随机分为正常组、 帕金森 （PD） 模型组、 受试药物组， 每组各8只。 正常组不注射 6-OHDA， 模型组进行6-OHDA造模， 药物组于造模前5天每天灌胃给予0.5mM/kg （给药体积 3.0毫升， 5%DMSO溶解） 化合物1， 连续两周。

25、。 正常组和模型组给予生理盐水3.0 mL灌胃； 0037 （2） 行为学观察： 各组大鼠分别进行旋转行为观察4周。 即采用阿朴吗啡(0.5mg kg 体重)腹腔注射， 计数大鼠15min内每分钟平均旋转360度的次数； 0038 （3） TH免疫组织化学染色： 实验第4周后， 将大鼠深度麻醉， 用4 多聚甲醛心脏灌注 固定， 取中脑切片后进行TH染色： PBS洗(TH检测用含0.1 Triton X-100 PBS洗)5 rain， 3 说明书 5/8 页 7 CN 105001261 B 7 过氧化氢室温孵育15 min， PBS振洗3次， 加封闭血清室温孵育15 min， 加小鼠单克隆抗。

26、TH抗 体4过夜， PBS振洗3次(各次3 min)， 加入二抗， 37孵育15min， PBS振洗3次， 加入HRP标记 的卵白素-生物素复合物， 37孵育15 min， DAB显色、 梯度酒精脱水、 二甲苯透明， 中性树胶 封片。 每只大鼠取注射点附近中脑黑质断面5张切片计数黑质TH 阳性细胞数； 0039 （4） GSH和MDA水平测定： 实验第4周后， 迅速将各组大鼠断头取脑， 冰上分离中脑腹 侧组织， 吸水纸吸干称重后置于匀浆器内充分匀浆， 低温2000r min离心6min， 分别测定 GSH、 MDA含量； 0040 （5） 结果： 6-OHDA立体定向注射后第24周实验大鼠出现。

27、明显的旋转行为， 黑质神 经元数量 （TH） 显著减少， 药物治疗后大鼠旋转行为明显减少。 黑质多巴胺神经元数量显著 增加。 证实化合物1能够有效降低多巴胺能神经元变性损伤程度。 实验证实模型组大鼠黑质 GSH含量明显降低、 MDA含量升高， 而化合物1能够显著增加GSH活性和降低MDA活性， 增强机 体抗氧化能力。 0041 0042 0043 实施例5： 化合物2， 3， 4， 6治疗帕金森模型的药效学实验 0044 所选受试药物 （化合物2， 3， 4， 6） 浓度均为0.5mM/kg （给药体积3.0毫升， 5%DMSO溶 解） ， 观察其对TH， MDA含量和GSH活性变化的影响。 。

28、0045 说明书 6/8 页 8 CN 105001261 B 8 0046 0047 实施例6： MTT法测定化合物16对H2O2损伤的PC12细胞存活率的影响 0048 选择H2O2的终浓度为400M， 化合物16的浓度为10g/ml进行试验。 取细胞以l-2 l04/200l孔接种到96孔培养板上， 用含l0%FBS和5%HS的DMEM培养液培养至覆盖底部60- 70%进行试验。 加入化合物16的溶液和PBS预孵育30分钟后， 再加H2O2孵育4个小时。 加入MTT 溶液20闪/孔,放置37温箱中继续孵育4h后,弃上清液。 每孔加200l二甲基亚砜溶解甲 攒， 用酶标仪在570nm波长处测定吸光度值， 以正常对照为100%计算细胞存活率(%)。 0049 结果发现， H2O2能降低PC12细胞活性(28.8%，P0.01)， 化合物16均可拮抗H2O2对 PC12细胞的氧化损伤作用， 细胞存活率明显升高， 结果见表5。 同时发现， 化合物16对H2O2损 伤PC12细胞的保护作用强于前期合成的氮氧自由基。 由表中数据可见， 本发明新型氮氧自 由基具有比先前专利合成的药物结构更好的抗神经退行性疾病活性。 0050 说明书 7/8 页 9 CN 105001261 B 9 0051。 说明书 8/8 页 10 CN 105001261 B 10 。