一种SYBR Green I闭管快速鉴定胶原蛋白及明胶来源的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710404351.2 (22)申请日 2017.06.01 (71)申请人 淮海工学院 地址 222000 江苏省连云港市新浦区苍梧 路59号 申请人 江苏悠然生物科技有限公司 (72)发明人 张俊杰王永久段蕊潘霞 张博妍 (74)专利代理机构 南京纵横知识产权代理有限 公司 32224 代理人 何文豪 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (54)发明名称 一种SYBR Green I闭管快速鉴定胶原蛋白 。

2、及明胶来源的方法 (57)摘要 本发明公开了一种SYBRGreenI闭管快速 鉴定胶原蛋白及明胶来源的方法， 是在提取出胶 原蛋白及明胶DNA的基础上， 在含有SYBRGreen I染料的蜡封反应管中加入模板DNA、 引物、 dNTPs、 BstDNA聚合酶、 MgSO4等使其发生环介导 等温扩增反应； 本发明使用的SYBRGreenI染料 是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有 绿色激发波长的染料， 当DNA样品未发生特定的 LAMP反应时， 染料显淡橙色或无色， 当LAMP反应 发生时， 样品则呈现荧光绿的颜色， 整个操作过 程所需要的仪器设备简单， 消除了样品阳性污染 的影响， 。

3、时间短， 仅需2小时左右， 该检测方法经 济实惠、 结果可靠、 方便快捷、 适合基层快速检 测。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 107267603 A 2017.10.20 CN 107267603 A 1.一种SYBR Green I闭管快速鉴定胶原蛋白及明胶来源的方法， 其特征在于， 包括如 下步骤 （1） 制备含有SYBR Green I染料的微晶蜡封反应管；（2） 手工提取或使用试剂盒进行 提取样品DNA；（3） 样品DNA于蜡封反应管进行LAMP反应， 反应时设置去离子水为空白对照 组；（4） LAMP反应后将反应管迅速置于水浴锅中终止反应， 观察颜色变化以此判断待测样。

4、 品， 阳性出现荧光绿色， 阴性则出现淡橙色或无色。 2.根据权利要求1所述的一种SYBR Green I闭管快速鉴定胶原蛋白及明胶来源的方 法， 其特征在于： 所述SYBR Green I染料用量为0.05-5.00 l （1000X） 。 3.根据权利要求1所述的一种SYBR Green I闭管快速鉴定胶原蛋白及明胶来源的方 法， 其特征在于： 所述微晶蜡用量为0.01-1.00g， 将含有染料和微晶蜡的反应管置于水浴锅 中升温60-100， 1-10min去除， 室温冷却制得蜡封反应管。 4. 根据权利要求1所述的一种SYBR Green I闭管快速鉴定胶原蛋白及明胶来源的方 法， 其特。

5、征在于： 所述LAMP反应体系包括1xThermoPol缓冲液0.05-5.00 l， MgSO41-10mM， dNTPs 1-10 mM， Betaine溶液0.1-1.0M， 1-10UBst DNA聚合酶， 1-100umol/L的外引物F3和 B3各0.1-10 l， 1-100umol/L的内引物FIP和BIP各1-10 l以及1-10 l模板DNA， 1-100umol/L 环引物LF及LB用量为0.1-10 l， 灭菌水至10-100 l。 5.根据权利要求1所述的一种SYBR Green I闭管快速鉴定胶原蛋白及明胶来源的方 法， 其特征在于： LAMP反应条件为50-100。

6、水浴锅中反应20-200min， 所述终止反应条件为 60-100水浴锅中灭活10-100min。 6.根据权利要求1所述的一种SYBR Green I闭管快速鉴定胶原蛋白及明胶来源的方 法， 其特征在于： 所述LAMP反应引物序列经软件PrimerExplorer V5设计获得。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107267603 A 2 一种SYBR Green I闭管快速鉴定胶原蛋白及明胶来源的方法 技术领域 0001 本发明公开了胶原蛋白的来源的检测方法， 尤其是一种SYBR Green I闭管快速鉴 定胶原蛋白及明胶来源的方法。 背景技术 0002 胶原蛋白是一种生物性高分子物质，。

7、 是现今哺乳动物各组织器官中含量最为丰 富、 覆盖面积最大的一种蛋白质。 因其具备营养以及生理调节双重作用， 被广泛的应用于医 疗、 食品、 化妆品及包装材料等各领域。 目前， 市售的传统胶原蛋白主要来源于猪、 牛等陆生 动物， 但在伊斯兰教中， 含有猪明胶的非清真产品是严格禁止的， 而对于牛胶原蛋白而言， 由于口蹄疫及疯牛病的影响， 其生产销售也在一定程度上受到了限制。 近年来， 水产胶原蛋 白因其优良的理化特性和生理活性功能渐渐成为市售胶原蛋白最主要来源之一， 但水产胶 原蛋白价格较高， 市场上出现以猪牛等胶原蛋白掺假冒充水产胶原蛋白的情况。 0003 为解决上述宗教以及食品造价问题， 国。

8、内外学者先后采用了色谱及氨基酸组成分 分析法、 多克隆间接竞争ELISA法、 质谱法以及种属特异性PCR方法对蛋白来源进行了鉴定， 但操作流程复杂， 实验所需仪器较为昂贵。 LAMP技术作为众多核苷酸扩增技术中的一种， 是 日本学者Notomi于2000年在Nucleic Acids Res杂志上公开的一种新型基因诊断技术。 该 技术依赖一种具有链置换特性的Bst DNA聚合酶， 通过四条能够识别目标序列上六个特异 性区域的引物， 实现等温快速扩增， 可在1h之内， 将目标序列DNA扩增109-1010倍。 LAMP法自 发明以来因其特异性强、 灵敏度高、 反应迅速、 操作便捷等优势被广泛应用。

9、于微生物、 病毒 以及动植物的检测中。 0004 本发明在LAMP的基础上对其进行可视化操作， 增强其实用性， 并采用蜡封反应管 从源头消除LAMP反应可能带来的阳性污染。 研究中所使用的SYBR Green I染料是一种结合 于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。 当DNA样品未发生特定的LAMP反 应时， 染料显淡橙色或无色， 当LAMP反应发生时， 样品则呈现荧光绿的颜色。 。 整个操作过程 所需要的仪器设备简单， 时间短， 仅需2小时左右， 该检测方法经济实惠， 方便快捷， 适合基 层快速检测。 发明内容 0005 为了实现对市售对胶原蛋白及明胶来源的检测的目的， 本。

10、发明提供一种SYBR Green I闭管快速鉴定胶原蛋白及明胶的方法， 可快速鉴定水产胶原蛋白及明胶以及对食 品、 化妆品中胶原蛋白添加成分， 本发明提出了一种SYBR Green I闭管快速鉴定胶原蛋白 及明胶来源的方法， 其技术方案如下： 0006 一种SYBR Green I闭管快速鉴定胶原蛋白及明胶来源的方法， 其特征在于， 包括 如下步骤(1)制备含有SYBR Green I染料的微晶蜡封反应管； (2)手工提取或使用试剂盒进 行提取样品DNA； (3)样品DNA于蜡封反应管进行LAMP反应， 反应时设置去离子水为空白对照 组； (4)LAMP反应后将反应管迅速置于水浴锅中终止反应，。

11、 观察颜色变化以此判断待测样 说明书 1/5 页 3 CN 107267603 A 3 品， 阳性出现荧光绿色， 阴性则出现淡橙色或无色。 0007 进一步的， 所述SYBR Green I染料用量为0.05-5.00 l(1000X)。 0008 进一步的， 所述微晶蜡用量为0.01-1.00g， 将含有染料和微晶蜡的反应管置于水 浴锅中升温60-100， 1-10min去除， 室温冷却制得蜡封反应管。 0009 进一步的， 所述LAMP反应体系包括1xThermoPol缓冲液0.05-5.00 l， MgSO41- 10mM， dNTPs 1-10mM， Betaine溶液0.1-1.0M。

12、， 1-10UBst DNA聚合酶， 1-100umol/L的外引物 F3和B3各0.1-10 l， 1-100umol/L的内引物FIP和BIP各1-10 l以及1-10 l模板DNA， 1- 100umol/L环引物LF及LB用量为0.1-10 l， 灭菌水至10-100 l。 0010 进一步的， LAMP反应条件为50-100水浴锅中反应20-200min， 所述终止反应条件 为60-100水浴锅中灭活10-100min。 0011 进一步的， 所述LAMP反应引物序列经软件PrimerExplorer V5设计获得。 0012 本发明与现有技术相比， 有如下优点： 0013 使用LA。

13、MP技术对胶原蛋白样品进行检测， 其检测结果通过肉眼观察白色浑浊或绿 色荧光的生成来判断， 简便快捷， 适合基层快速诊断， 相比于其它检测技术， 本方法对实验 所需设备要求较低， 操作过程较为简单， 适用性较强， 避免了传统检测方法对仪器和试剂要 求高的缺点， 本发明在LAMP的基础上对其进行可视化操作， 增强其实用性， 采用蜡封反应管 从源头消除LAMP反应可能带来的阳性污染， 同时使用的SYBR Green I染料是一种结合于所 有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料， 当DNA样品未发生特定的LAMP反应 时， 染料显淡橙色或无色， 当LAMP反应发生时， 样品则呈现荧光绿的。

14、颜色， 整个操作过程所 需要的仪器设备简单， 时间短， 仅需2小时左右， 该检测方法经济实惠， 方便快捷， 适合基层 快速检测。 附图说明 0014 图1为微晶蜡闭管检测方法对鳕鱼胶原蛋白的检测结果。 0015 其中， 微晶蜡封反应管从左至右排列依次是： 鳕鱼胶原蛋白、 鮰鱼胶原蛋白、 猪肉、 牛肉、 猪明胶、 牛明胶、 牛胶原蛋白、 水。 盛放鳕鱼胶原蛋白的第一支反应管颜色成绿色， 其 他均为淡橙色。 0016 图2为微晶蜡闭管检测方法对斑点叉尾鮰胶原蛋白的检测结果。 0017 其中， 微晶蜡封反应管从左至右排列依次是： 鮰鱼胶原蛋白、 鳕鱼胶原蛋白、 猪肉、 牛肉、 猪明胶、 牛明胶、 牛。

15、胶原蛋白、 水。 盛放鮰鱼胶原蛋白的第一支反应管颜色为绿色， 其 他均为淡橙色。 具体实施方式 0018 下面结合附图对本发明做详细说明： 0019 一种SYBR Green I闭管快速鉴定胶原蛋白及明胶来源的方法， 包括如下步骤： 0020 (1)制备含有SYBR Green I染料的微晶蜡封反应管： 0021 微晶蜡固定样品称重约0.01-1.00g覆盖于含有SYBR Green I染料(0.05-5.00 l， 1000X)反应管的液面上， 将反应管放入水浴锅中， 升温至60-100， 1-10min中后取出， 室温 下冷却凝固。 说明书 2/5 页 4 CN 107267603 A 4。

16、 0022 (2)手工提取或使用试剂盒进行提取样品DNA： 0023 取胶原蛋白样品100mg-20g， 手工提取DNA或使用试剂盒进行DNA提取， 具体操作步 骤按照试剂盒或者试剂的说明书进行。 0024 (3)LAMP反应， 反应时设置去离子水为空白对照组： 0025 取1-10 l提取的DNA， 加入PCR管中， 同时在其中加入1xThermoPol缓冲液0.05- 5.00 l， MgSO41-10mM， dNTPs 1-10mM， Betaine溶液0.1-1.0M， 1-10UBst DNA聚合酶， 1- 100umol/L的外引物F3和B3各0.1-10 l， 1-100umol。

17、/L的内引物FIP和BIP各1-10 l以及1-10 l模板DNA， 1-100umol/L环引物LF及LB用量为0.1-10 l， 灭菌水至10-100 l， 反应体系配制 完成后， 将反应管放入可悬浮泡沫塑料微型管架中置于50-100水浴锅中反应20-200min。 0026 (4)LAMP反应后将反应管迅速置于水浴锅中终止反应： 0027 取出反应管， 迅速置于60-100水浴锅中反应10-100min终止实验， 观察其颜色变 化阳性出现荧光绿色， 阴性则出现淡橙色或无色。 0028 实施例1： 0029 鳕鱼胶原蛋白检测： 0030 (1)微晶蜡反应管的制备： 微晶蜡固定样品称重约0.。

18、05g覆盖于含有SYBR Green I 染料(0.05-5.00 l， 1000X)反应管的液面上， 将反应管放入水浴锅中， 升温至60， 10min中 后取出， 室温下冷却凝固。 0031 (2)DNA提取： 取鳕鱼胶原蛋白样品200mg， 使用DNeasy mericon Food Kit试剂盒 进行DNA提取， 具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。 0032 (3)LAMP反应： 取5 l提取的DNA， 加入PCR管中， 同时在其中加入1xThermoPol缓冲 液5.00 l， MgSO410mM， dNTPs 10mM， Betaine溶液1.0M， 10UBst DNA聚合酶， 1。

19、00umol/L的外 引物F3和B3各10 l， 100umol/L的内引物FIP和BIP各10 l以及10 l模板DNA， 100umol/L环引 物LF及LB用量为10 l， 灭菌水至100 l。 反应体系配制完成后， 将反应管放入可悬浮泡沫塑 料微型管架中置于100水浴锅中反应100min， 其中： 0033 0034 (4)取出反应管， 迅速置于100水浴锅中反应100min终止实验， 观察其颜色变化。 反应管中样品变为绿色的为阳性样品， 显色为淡橙色或无色的为阴性样品。 0035 实施例2： 0036 鳕鱼明胶检测： 0037 (1)微晶蜡反应管的制备： 微晶蜡固定样品称重约1.00。

20、g覆盖于含有SYBR Green I 染料(0.05-5.00 l， 1000X)反应管的液面上， 将反应管放入水浴锅中， 升温至100， 10min 说明书 3/5 页 5 CN 107267603 A 5 中后取出， 室温下冷却凝固。 0038 (2)DNA提取： 取鳕鱼明胶样品2g， 使用DNeasy mericon Food Kit试剂盒进行DNA 提取， 具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。 0039 (3)LAMP反应： 取10 l提取的DNA， 加入PCR管中， 同时在其中加入1xThermoPol缓冲 液0.05- l， MgSO4 5mM， dNTPs 5mM， Betaine。

21、溶液0.5M， 5UBst DNA聚合酶， 50umol/L的外引 物F3和B3各5 l， 100umol/L的内引物FIP和BIP各5 l以及5 l模板DNA， 100umol/L环引物LF 及LB用量为5 l， 灭菌水至100 l。 反应体系配制完成后， 将反应管放入可悬浮泡沫塑料微型 管架中置于100水浴锅中反应100min， 其中， 0040 0041 0042 (4)取出反应管， 迅速置于100水浴锅中反应100min终止实验， 观察其颜色变化。 反应管中样品变为绿色的为阳性样品， 显色为淡橙色或无色的为阴性样品。 0043 实施例3： 0044 斑点叉尾鮰胶原蛋白检测： 0045 。

22、(1)微晶蜡反应管的制备： 微晶蜡固定样品称重约1.00g覆盖于含有SYBR Green I 染料(0.05-5.00 l， 1000X)反应管的液面上， 将反应管放入水浴锅中， 升温至100， 8min中 后取出， 室温下冷却凝固。 0046 (2)DNA提取： 取斑点叉尾鮰胶原蛋白样品100mg， 使用DNeasy mericon Food Kit 试剂盒进行DNA提取， 具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。 0047 (3)LAMP反应： 取1 l提取的DNA， 加入PCR管中， 同时在其中加入1xThermoPol缓冲 液2.5 l， MgSO4 4mM， dNTPs 2.0mM， Be。

23、taine溶液0.2M， 8UBst DNA聚合酶， 10umol/L的外引 物F3和B3各0.625 l， 10umol/L的内引物FIP和BIP各5 l以及模板DNA1 l， 1-100umol/L环引 物LF及LB用量为0.1-10 l， 补足灭菌水至25 l。 反应体系配制完成后， 将反应管放入可悬浮 泡沫塑料微型管架中置于65水浴锅中反应2h， 其中， 说明书 4/5 页 6 CN 107267603 A 6 0048 0049 (4)取出反应管， 迅速置于100水浴锅中反应100min终止实验， 观察其颜色变化。 反应管中样品变为绿色的为阳性样品， 显色为淡橙色或无色的为阴性样品。 0050 以上所述， 仅为本发明的具体实施方式， 但本发明的保护范围并不局限于此， 任何 熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内， 可轻易想到变化或替换， 都应涵 盖在本发明的保护范围之内。 因此， 本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。 说明书 5/5 页 7 CN 107267603 A 7 图1 图2 说明书附图 1/1 页 8 CN 107267603 A 8 。