一种增加单核细胞贴壁数量的方法
技术领域
本发明涉及一种培养细胞的方法，特别是涉及一种在树突状细胞 制备过程中增加单核细胞的贴壁数量和贴壁能力的方法。
背景技术
树突状细胞(DC)是针对晚期恶性肿瘤的治疗而开发出的一种治疗 肿瘤疫苗。树突状细胞(DC)是体内最强的抗原递呈细胞，是机体免疫 的始作俑者，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。树突状 细胞作为瘤苗能有效地打破机体对肿瘤的耐受，激活T淋巴细胞，杀 伤并清除肿瘤细胞。在治疗肿瘤方面，DC既可用于独立的治疗方法， 治疗对化疗和放疗不敏感的病人，降低死亡率；又可用于辅助治疗方 法，防止手术后癌细胞的转移和复发。已报导的临床观察资料表明， 上述疗法的疗效超过以往所报道的各种生物疗法，被认为是最具希望 的抗肿瘤治疗方法，具有广泛的临床应用前景。
单核细胞是制备树突状细胞的主要细胞，在树突状细胞制备的过 程中，根据单核细胞可以粘附于细胞培养板或细胞培养瓶底部的特性， 将单核细胞和淋巴细胞、粒细胞分离开来，将贴壁的单核细胞进一步 培养，促使其分化为树突状细胞。因此单核细胞贴壁的数量决定了树 突状细胞制备的数量；增加单核细胞贴壁的数量，可以提高树突状细 胞的临床治疗效果。目前基本采用细胞培养液和细胞制成混悬液直接 加入到细胞培养瓶或细胞培养板中，
发明内容
本发明的目的是提供一种增加单核细胞贴壁数量的方法，用它制 备树突状细胞的数量能提高2-6倍，促使单核细胞贴壁的时间减少到 1/4-1/8，提高了树突状细胞的产量，缩短了操作时间。
一种增加单核细胞贴壁数量的方法，其特征是先将PH值为 7.5-10.0的细胞培养液加入细胞培养瓶或细胞培养板中，浸泡细胞培 养瓶或细胞培养板的底部5-30分钟，再将制备好的细胞混悬液加入到 细胞培养瓶或细胞培养板中，使每毫升液体中单核细胞总数在 1×107-2×108之间，然后在CO2培养箱中培养5-30分钟，取出后轻轻晃 动细胞培养瓶或细胞培养板，在倒置显微镜下观察单核细胞贴壁的数 量，贴壁细胞较少时，再放到CO2培养箱中培养10-20分钟。
本发明操作简单，缩短了单核细胞贴壁所需要的时间，获得大量 能分化成树突状细胞的单核细胞，提高了树突状细胞制备的数量，为 提高树突状细胞抗肿瘤临床治疗效果和大规模临床应用提供了支持。
具体实施方式
按本发明的方法，先将PH值为7.5-10.0的细胞培养液加入细胞 培养瓶或细胞培养板中，浸泡细胞培养瓶或细胞培养板的底部(贴壁 细胞粘附面)5-30分钟，再将制备好的细胞混悬液加入到细胞培养瓶 或细胞培养板中，使每毫升液体中单核细胞总数在1×107-2×108之间， 然后在CO2培养箱中培养5-30分钟，取出后轻轻晃动细胞培养瓶或细 胞培养板，在倒置显微镜下观察单核细胞贴壁的数量，如果贴壁细胞 较少，再放到CO2培养箱中培养10-20分钟。吸出未贴壁细胞(悬浮 细胞)，向贴壁细胞加入树突状细胞培养液，使这些贴壁细胞分化成树 突状细胞。
实施例1
李某某，男，47岁。患胃腺癌手术后，为防止肿瘤复发，做树突 状细胞抗肿瘤治疗。用血细胞分离机采集病人外周血单个核细胞，将 核细胞平均分为2份，一份按照本发明方法操作：将PH值为8.0的有 RPMI 1640细胞培养液30ML加入底面积为175CM2的细胞培养瓶中，浸 泡细胞培养瓶底部30分钟，将制备好的单个核细胞混悬液加入到细胞 培养瓶中，使最终浓度达到每毫升液体中的细胞数为1×108，加入葡 萄糖酸钙，使葡萄糖酸钙在液体中的重量百分浓度为0.1％，在CO2培 养箱中培养30分钟，取出后轻轻晃动细胞培养瓶，在倒置显微镜下观 察，细胞贴壁数量很多，将贴壁细胞做树突状细胞培养。另一份按照 现有方法操作。结果表明，现有方法获得的树突状细胞数为3.1×107， 而本发明的方法获得的树突状细胞数为14.9×107，是现有方法的4.8 倍。
实施例2
刘某某，男，65岁。患结肠癌并手术切除，为防止肿瘤复发做树 突状细胞抗肿瘤治疗。用血细胞分离机采集病人外周血单个核细胞， 将核细胞平均分为2份，一份按照本发明方法操作：将PH值为8.5 的RPMI 1640细胞培养液20ML加入底面积为175CM2的细胞培养瓶中， 将细胞培养瓶倾斜，使细胞培养液仅能浸泡细胞培养瓶底部的一半， 30分钟后，将制备好的单个核细胞混悬液加入到上述细胞培养瓶中， 使最终浓度为每毫升液体中的细胞数为2×107，不加葡萄糖酸钙，在 CO2培养箱中培养15分钟，取出后轻轻晃动细胞培养瓶，在倒置显微 镜下观察，在高倍镜下计数相同面积的经细胞培养液浸泡的和未经细 胞培养液浸泡的细胞贴壁数量。结果表明经细胞培养液浸泡的细胞贴 壁数量为528，未经细胞培养液浸泡的细胞贴壁数为235，本发明是现 有方法获得细胞贴壁数的2.24倍。
实施例3
李某某，女，67岁。手术切除卵巢癌后复发，经放疗治疗无效， 而做树突状细胞抗肿瘤治疗。用血细胞分离机采集病人外周血单个核 细胞，将核细胞平均分为2份，一份按照本发明方法操作：将PH值为 10的RPMI 1640细胞培养液20ML加入面积为175CM2的细胞培养板中， 浸泡细胞培养板10分钟，除去细胞培养液，将制备好的细胞浓度为每 毫升8×107单个核细胞的混悬液加入到细胞培养板中，加入葡萄糖酸 钙，使葡萄糖酸钙在液体中的重量百分浓度为0.2％，在CO2培养箱中 培养20分钟，取出后轻轻晃动细胞培养板，在倒置显微镜下观察细胞 贴壁的数量，将贴壁细胞做树突状细胞培养。另一份按照现有方法操 作。结果显示，现有方法获得的树突状细胞为5.1×107，而本发明的 方法获得树突状细胞为28.2×107，是原方法的5.5倍。
本发明用碱性细胞培养液浸泡细胞培养瓶或细胞培养板，使细胞 培养瓶或细胞培养板带有一定量的负电荷，这些负电荷促使单核细胞 贴附在培养瓶或细胞培养板的底面，加入少量的钙离子，有助于单核 细胞的贴附。用本发明方法对数十例肿瘤病人进行树突状细胞抗肿瘤 治疗效果表明，由于本发明所获得的树突状细胞多，所以临床效果远 好于现有方法。