一种从石蒜属植物中提取加兰他敏的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510066820.5 (22)申请日 2015.02.07 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104628736 A (43)申请公布日 2015.05.20 (73)专利权人 吉首大学 地址 427000 湖南省张家界市吉首大学林 产化工工程湖南省重点实验室 (72)发明人 田春莲王鹏刘小攀覃基信 (74)专利代理机构 深圳市兴科达知识产权代理 有限公司 44260 代理人 王翀 (51)Int.Cl. C07D 491/107(2006.01) (56)。

2、对比文件 CN 101157947 B,2011.04.20,权利要求1. CN 101704822 A,2010.05.12,全文. CN 101781305 A,2010.07.21,全文. CN 103772403 A,2014.05.07,全文. 审查员 张英姝 (54)发明名称 一种从石蒜属植物中提取加兰他敏的方法 (57)摘要 一种从石蒜属植物中提取加兰他敏的方法， 包括以下步骤： (1)提取： 称取经处理的石蒜粉 末， 以料液比1:10， 单位比例为g/mL， 加入pH为 4.5的水中， 加入石蒜粉末质量1.0-3.0的纤 维素酶与果胶酶的混合酶， 所述纤维素酶与果胶 酶的质量比。

3、为1:1， 在50下酶解20-100min， 然 后超声波处理5-25min， 5000r/min离心20min， 取 上清液即得加兰他敏提取液； (2)纯化： 溶剂萃 取； 阳离子交换树脂吸附； C18反相硅胶柱层 析； 正相硅胶柱层析； 重结晶： 将步骤所得 干燥物经乙醇溶解， 再结晶得到加兰他敏粗 品， 过滤， 在5060真空干燥得加兰他敏。 本发 明操作简单， 提取时间短、 提取率高、 溶剂用量 少、 成本较低； 纯化工艺环保， 且纯度高， 可达 99.2。 权利要求书2页 说明书4页 附图1页 CN 104628736 B 2017.03.08 CN 104628736 B 1.一种。

4、从石蒜属植物中提取加兰他敏的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)提取： 称取经处理的石蒜属植物粉末， 以料液比1:10， 单位比例为g/mL， 加入pH为 4.5的水中， 加入石蒜属植物粉末质量1.0-3.0的纤维素酶与果胶酶的混合酶， 所述纤 维素酶与果胶酶的质量比为1:1， 在50下酶解20-100min， 然后超声波处理5-25min， 5000r/min离心20min， 取上清液即得加兰他敏提取液； (2)纯化： 溶剂萃取： 将步骤(1)提取的加兰他敏提取液用NaOH调节pH至10， 按体积比1:1加入 萃取剂三氯甲烷， 摇匀， 静置过夜， 取下层氯仿相， HCl调节pH至2，。

5、 抽滤， 得加兰他敏萃取浓 缩液； 阳离子交换树脂吸附： 将步骤中萃取浓缩液经HCl调节pH至16， 用D-001型阳离 子交换树脂， 以上样速率1-3BV/h上样至饱和， 用含0.5-2.5mol/L氨水的40-80乙醇溶 液以3BV/h的洗脱速率进行洗脱， 干燥， 得干燥物 ； C18反相硅胶柱层析： C18填料预处理， 将20倍质量于步骤中干燥物 的C18填料装于 层析柱中， 然后以流动相溶解层析出来的层析物， 上样， 采用甲醇-水溶液分次洗脱， 收集洗 脱液， 浓缩， 真空冷冻干燥， 得干燥物； 正相硅胶柱层析： 用经预处理的20倍质量于步骤所得干燥物的柱层析用硅胶以 柱直径-柱高湿法。

6、装柱， 所述柱直径-柱高的比例为1:1030， 步骤所得干燥物与硅胶 混匀， 加入洗脱剂溶解， 所述洗脱剂为石油醚、 乙酸乙酯、 氯仿、 丙酮、 甲醇中的两种溶剂混 合； 蒸发溶剂后干法上样， 洗脱， 收集洗脱液， 浓缩， 真空冷冻干燥， 得干燥物； 重结晶： 将步骤所得干燥物经乙醇溶解， 再结晶得到加兰他敏粗品， 过滤， 在50 60真空干燥得加兰他敏。 2.根据权利要求1所述的从石蒜属植物中提取加兰他敏的方法， 其特征在于， 包括以下 步骤： (1)提取： 称取经处理的石蒜属植物粉末， 以料液比1:10， 单位比例为g/mL， 加入pH为 4.5的水中， 加入石蒜属植物粉末质量2.0-2.。

7、8的纤维素酶与果胶酶的混合酶， 所述纤 维素酶与果胶酶的质量比为1:1， 在50下酶解40-80min， 然后超声波处理5-25min， 5000r/ min离心20min， 取上清液即得加兰他敏提取液； (2)纯化 溶剂萃取： 将步骤(1)提取的加兰他敏提取液用NaOH调节pH至10， 按体积比1:1加入 萃取剂三氯甲烷， 摇匀， 静置过夜， 取下层氯仿相， HCl调节pH至2， 抽滤， 得加兰他敏萃取浓 缩液； 阳离子交换树脂吸附： 将步骤中萃取浓缩液经HCl调节pH至2， 用D-001型阳离子交 换树脂， 以上样速率3BV/h上样至饱和， 用含1.5mol/L氨水的70乙醇溶液以3BV/。

8、h的洗脱 速率进行洗脱， 干燥， 得干燥物 ； C18反相硅胶柱层析： C18填料预处理， 将20倍质量于步骤中干燥物 的C18填料装于 层析柱中， 然后以流动相溶解层析出来的层析物， 上样， 采用甲醇-水溶液分次洗脱， 收集洗 脱液， 浓缩， 真空冷冻干燥， 得干燥物； 正相硅胶柱层析： 用经预处理的20倍质量于步骤所得干燥物的柱层析用硅胶以 柱直径-柱高湿法装柱， 所述柱直径-柱高的比例为1:10， 步骤所得干燥物与硅胶混匀， 权利要求书 1/2 页 2 CN 104628736 B 2 加入洗脱剂溶解， 所述洗脱剂为石油醚、 乙酸乙酯、 氯仿、 丙酮、 甲醇中的两种溶剂混合； 蒸 发溶剂。

9、后干法上样， 洗脱， 收集洗脱液， 浓缩， 真空冷冻干燥， 得干燥物； 重结晶： 将步骤所得干燥物经乙醇溶解， 再结晶得到加兰他敏粗品， 过滤， 在50 60真空干燥得加兰他敏。 3.根据权利要求1或2所述的从石蒜属植物中提取加兰他敏的方法， 其特征在于， 所述 步骤中， 洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯， 所述乙酸乙酯与石油醚的体积比为8.4:1.6。 4.根据权利要求1或2所述的从石蒜属植物中提取加兰他敏的方法， 其特征在于， 所述 石蒜属植物为忽地笑、 红花石蒜、 玫瑰石蒜、 稻草石蒜或中国石蒜。 5.根据权利要求4所述的从石蒜属植物中提取加兰他敏的方法， 其特征在于， 所述石蒜 属植物为忽地笑。

10、。 6.根据权利要求1或2任一项所述的从石蒜属植物中提取加兰他敏的方法， 其特征在 于， 所述石蒜属植物粉末为忽地笑鳞茎粉末。 权利要求书 2/2 页 3 CN 104628736 B 3 一种从石蒜属植物中提取加兰他敏的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种加兰他敏的提取方法， 尤其是涉及一种从石蒜属植物中提取加兰 他敏的方法。 背景技术 0002 石蒜中加兰他敏等生物碱的化学合成方法已经有报道， 但从石蒜属植物中提取仍 是该类物质的一大重要来源， 现有技术中石蒜生物碱的提取方法主要有溶剂提取法、 超声 波提取法、 微波提取法、 超临界流体萃取等方法， 这些方法一般都存在环境污染严重、 生。

11、产 成本高等缺点。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是， 克服现有技术存在的上述缺陷， 提供一种提取时 间短、 溶剂用量少、 提取率高、 成本低的从石蒜属植物中提取加兰他敏的方法。 0004 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是， 一种从石蒜属植物中提取加兰他敏 的方法， 包括以下步骤： 0005 (1)提取： 称取经处理的石蒜粉末， 以料液比1:10， 单位比例为g/mL， 加入pH为4.5 的水中， 加入石蒜粉末质量1.0-3.0(优选2.0-2.8， 更优选2.5)的纤维素酶与果 胶酶的混合酶， 所述纤维素酶与果胶酶的质量比为1:1， 在50下酶解20-100min(优选4。

12、0- 80min， 更优选60min)， 然后超声波处理5-25min(优选15min-20min， 更优选15min)， 5000r/ min离心20min， 取上清液即得加兰他敏提取液； 0006 (2)纯化 0007 溶剂萃取： 将步骤(1)提取的加兰他敏提取液用NaOH调节pH至10， 按体积比1:1 加入萃取剂三氯甲烷， 摇匀， 静置过夜， 取下层氯仿相， HCl调节pH至2， 抽滤， 得加兰他敏萃 取浓缩液； 0008 阳离子交换树脂吸附： 将步骤中萃取浓缩液经HCl调节pH至16(优选pH为2) 用D-001型阳离子交换树脂， 以上样速率1-3BV/h(优选3BV/h)上样至饱和。

13、， 用含0.5- 2.5mol/L(优选1.5mol/L)氨水的40-80(优选70)乙醇溶液以3BV/h的洗脱速率进行 洗脱， 干燥， 得干燥物 ； 0009 C18反相硅胶柱层析： C18填料预处理， 将20倍质量于步骤中干燥物 的C18填料 装于层析柱中， 然后以流动相(流动相： V(乙腈) V(磷酸盐)为16 84)溶解层析出来的层析 物， 上样， 采用甲醇-水溶液分次洗脱， 收集洗脱液， 浓缩， 真空冷冻干燥， 得干燥物； 0010 正相硅胶柱层析： 用经预处理的20倍质量于步骤所得干燥物的柱层析用硅 胶(200-300目)以柱直径-柱高湿法装柱， 所述柱直径-柱高的比例为1:103。

14、0(优选1:10)， 步骤所得干燥物与硅胶混匀， 加入洗脱剂溶解， 所述洗脱剂为石油醚、 乙酸乙酯、 氯仿、 丙酮、 甲醇中的两种溶剂混合； 蒸发溶剂后干法上样， 洗脱， 收集洗脱液， 浓缩， 真空冷冻干 燥， 得干燥物； 说明书 1/4 页 4 CN 104628736 B 4 0011 重结晶： 将步骤所得干燥物经乙醇溶解， 再结晶得到加兰他敏粗品， 过滤， 在5060真空干燥得加兰他敏。 0012 进一步， 所述步骤中， 洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯， 所述乙酸乙酯与石油醚的体 积比为8.4:1.6。 0013 进一步， 所述石蒜属植物为忽地笑、 红花石蒜、 玫瑰石蒜、 稻草石蒜或中国石蒜(。

15、优 选忽地笑)。 0014 进一步， 所述石蒜粉末优选忽地笑鳞茎粉末。 0015 与现有技术相比， 本发明操作简单， 提取时间短、 提取率高、 提取次数少、 溶剂用量 少、 成本较低， 采用超声波协同酶法提取， 加兰他敏得率为0.02840； 纯化工艺环保， 且纯 度高， 可达99.2。 附图说明 0016 图1为本发明酶用量对加兰他敏得率的影响示意图； 0017 图2为本发明酶解时间对加兰他敏得率的影响示意图； 0018 图3为本发明超声时间对加兰他敏得率的影响示意图。 具体实施方式 0019 以下结合附图及实施例对本发明做进一步说明。 0020 实施例1 0021 本实施例包括以下步骤： 。

16、准确称取经处理的石蒜粉末2.0g， 以料液比1:10， 单位为 g/mL， 加入pH为4.5的水中， 分别加入原料质量1.0-3.0的纤维素酶与果胶酶的混合酶， 在50下酶解20-100min， 然后超声波处理5-25min， 5000r/min离心20min， 取上清液， 即得 加兰他敏提取液； 0022 (2)纯化 0023 溶剂萃取： 将步骤(1)提取的加兰他敏提取液用NaOH调节pH至10， 按体积比1:1 加入萃取剂三氯甲烷， 摇匀， 静置过夜， 取下层氯仿相， HCl调节pH至2， 抽滤， 得加兰他敏萃 取浓缩液； 0024 阳离子交换树脂吸附： 将步骤中萃取浓缩液经HCl调节pH。

17、为2， 用D-001型阳离 子交换树脂， 以上样速率3BV/h上样至饱和， 用含1.5mol/L氨水的70乙醇溶液以3BV/h的 洗脱速率进行洗脱， 干燥， 得干燥物 ； 0025 C18反相硅胶柱层析： C18填料预处理， 将20倍质量于步骤中干燥物 的C18填料 装于层析柱中， 然后以流动相(流动相： V(乙腈) V(磷酸盐)为16 84)溶解层析出来的层析 物， 上样， 采用甲醇-水溶液分次洗脱， 收集洗脱液， 浓缩， 真空冷冻干燥， 得干燥物； 0026 正相硅胶柱层析： 用经预处理的20倍质量于步骤所得干燥物的柱层析用硅 胶(200-300目)以柱直径-柱高湿法装柱， 所述柱直径-柱。

18、高的比例为1:10， 步骤所得干燥 物与硅胶混匀， 加入洗脱剂溶解， 所述洗脱剂为石油醚、 乙酸乙酯、 氯仿、 丙酮、 甲醇中的 两种溶剂混合； 蒸发溶剂后干法上样， 洗脱， 收集洗脱液， 浓缩， 真空冷冻干燥， 得干燥物； 0027 重结晶： 将步骤所得干燥物经乙醇溶解， 再结晶得到加兰他敏粗品， 过滤， 在5060真空干燥得纯度为99.2的加兰他敏。 说明书 2/4 页 5 CN 104628736 B 5 0028 步骤中， 洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯， 所述乙酸乙酯与石油醚的体积比为8.4: 1.6。 0029 参照附图1， 酶用量的影响情况， 准确称取经处理的石蒜粉末2.000g， 加。

19、入pH为4.5 的水20mL， 分别加入原料质量1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0的纤维素酶与果胶酶的混 合酶， 在50下酶解1h， 超声处理15min， 5000r/min离心20min， 取上清液， 定容至50mL。 结果 显示， 在1-2.5范围内加兰他敏得率随酶用量的增加而升高， 酶用量为2.5的效果最 佳。 0030 参照附图2， 酶解时间的影响， 称取石蒜粉末2.000g， 加入pH为4.5的水20mL， 加入 原料质量2.0的纤维素酶与果胶酶的混合酶， 在50下酶解20、 40、 60、 80、 100min， 超声处 理15min， 5000r/min离心20min。

20、， 取上清液， 定容至50mL。 结果可知， 酶解时间在20-60min内， 加兰他敏得率随时间增长而升高， 之后略有降低。 60min效果最佳。 0031 参照附图3， 超声时间的影响， 称取石蒜粉末2.000g， 加入pH为4.5的水20mL， 加入 原料质量2.0的纤维素酶与果胶酶的混合酶， 50酶解1h， 然后超声处理5、 10、 15、 20、 25min， 5000r/min离心20min， 取上清液， 定容至50mL， 加兰他敏得率在5-15min内随超声处 理时间的增长而增加， 15min时达最大值。 0032 以加兰他敏得率为指标， 进行直观分析和方差分析结果见表1、 表2。。

21、 0033 表1超声波协同酶法提取加兰他敏正交设计与结果 0034 0035 表2超声波协同酶法提取加兰他敏方差分析 0036 方差来源离差平方自由度均方F值P值 A7.15223.57612.4600.1 B15.10727.55426.3190.05 C13.10526.55222.8310.05 误差0.57 说明书 3/4 页 6 CN 104628736 B 6 总和35.934 0037 通过表1直观分析， 可知加兰他敏最佳提取工艺为A2B2C1。 根据方差分析(表2)， 酶 解时间、 超声时间对加兰他敏得率的影响显著(P0.05)； 酶用量对加兰他敏的提取有影响 (P0.1)。 。

22、影响加兰他敏得率的各因素主次顺序为酶解时间超声时间酶用量。 超声波 协同酶法提取加兰他敏的最优工艺参数为酶解时间1.0h、 超声时间10min、 酶用量2.5。 0038 在此最优工艺条件加兰他敏得率为0.02840。 0039 对比实施例 0040 超声波辅助提取石蒜中加兰他敏： 使用0.5的H2SO4水溶液， 料液比1:10(g:mL)， 70水浴下浸提2.5h然后超声波处理时间30min， 在此条件下提取2次， 加兰他敏得率为 0.02530。 0041 与实施例1相比， 加兰他敏得率低。 0042 对比实施例 0043 酶法提取石蒜中加兰他敏： 以料液比1:10(g:mL)加入pH为4.5的水中， 加入4的 纤维素酶与果胶酶混合酶在50水浴下酶解2h， 在此条件下提取2次， 加兰他敏得率为 0.02940。 0044 与实施例1相比， 实施例1加兰他敏得率虽比本实施例酶解法低了3.42， 但实施 例1提取的酶用量为单纯的酶解法的62.5， 酶解时间只有本实施例酶解法的1/2， 因此从 经济的角度考虑， 实施例1进行加兰他敏提取具有更大的优势。 说明书 4/4 页 7 CN 104628736 B 7 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 8 CN 104628736 B 8 。