一种液泡膜氢离子焦磷酸酶基因AlVP1、其编码的蛋白及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610264657.8 (22)申请日 2016.04.25 (71)申请人 大连理工大学 地址 116024 辽宁省大连市高新园区凌工 路2号 (72)发明人 苏乔杨小丽 (74)专利代理机构 大连东方专利代理有限责任 公司 21212 代理人 贾汉生李馨 (51)Int.Cl. C12N 15/55(2006.01) C12N 9/14(2006.01) C12N 15/74(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A01H 5/00(2006.01) 。

2、C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种液泡膜氢离子焦磷酸酶基因AlVP1、 其 编码的蛋白及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种液泡膜氢离子焦磷酸酶 基因AlVP1、 其编码的蛋白及其应用。 本发明的基 因AlVP1来源于耐盐耐旱植物獐茅， 其编码的蛋 白AlVP1具有质子泵的功能， 能够为许多无机离 子的跨膜转运提供动力， 从而提高转基因植物的 耐旱性。 这种提高转基因植物的耐旱性的特性， 可通过转基因技术应用于农作物上， 从而应对日 益严重的干旱问题。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图5页 CN 105925593 A 2016.09.07 CN 105。

3、925593 A 1.一种来源于獐茅的液泡膜氢离子焦磷酸酶基因AlVP1， 其特征在于， 具有如SEQID NO:1所示的碱基序列。 2.具有与SEQIDNO:1所示的碱基序列95以上的同源性， 且编码与SEQIDNO:1所示 的碱基序列编码的蛋白质具有相同生物学功能的蛋白质的碱基序列。 3.如权利要求1所述基因编码的蛋白质AlVP1， 其具有如SEQIDNO:2所示的氨基酸序 列。 4.权利要求3所述蛋白质的衍生蛋白质， 其特征在于， 其具有如SEQIDNO:2所示的氨 基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、 缺失或添加而产生的氨基酸序列， 且该衍生蛋 白质与权利要求3所述的蛋白质具有相同的。

4、生物学功能。 5.一种含有权利要求1或2所述的碱基序列的重组表达载体。 6.含有权利要求5所述的重组表达载体， 其特征在于， 其表达载体为PTF101。 7.一种含有权利要求5所述重组表达载体的宿主细胞。 8.根据权利要求7所述的宿主细胞， 其特征在于， 该宿主细胞为根癌农杆菌EHA101菌 株。 9.如权利要求1所述的基因在培育耐干旱转基因植物中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105925593 A 2 一种液泡膜氢离子焦磷酸酶基因AlVP1、 其编码的蛋白及其 应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程技术领域， 本发明涉及一种液泡膜氢离子焦磷酸酶基因 AlVP1、 其编码的。

5、蛋白及该基因在提高植物耐旱性方面的作用。 背景技术 0002 干旱、 盐害与极端温度等非生物胁迫严重的制约着现代农业的发展。 这些非生物 胁迫会导致植物形态学、 生理、 生化以及分子水平的变化， 并进而影响植物的生长发育与产 量。 在众多非生物胁迫中， 干旱由于其广泛分布性已成为了限制农作物产量的主要因素， 目 前全球范围内有超过1/3的土地处于干旱和半干旱地区。 通过传统育种的方法提高农作物 对于非生物胁迫的耐受性虽然已取得了一定的进展， 但是植物对于逆境的耐受性往往是多 基因控制的， 因而使得该方法受到了限制。 近些年来， 通过转基因技术提高农作物对于干旱 胁迫的耐受性已成为一种现实而有效。

6、的手段。 0003 在较低水势下， 许多耐旱植株通过积累可溶性分子来维持细胞中的渗透压， 液泡 膜在该过程中发挥着重要作用。 这些可溶性分子主要包括无机酸、 糖及有机酸等， 而这类物 质的主动运输则依赖于两种质子泵H+-ATP酶和H+-PPase建立的跨液泡膜的质子梯度。 两类 焦磷酸酶在动、 植物及微生物的物质合成代谢和能量转化中起着重要作用， H+-ATP酶由多 个亚基组成， 是多基因编码的酶,， 其调控较为复杂， 因而通过基因工程的手段实现该酶在 其它植物中的异源表达较为困难。 H+-PPase是一种广泛存在于陆生植物中， 但仅在少数藻 类、 原生动物、 细菌以及原始细菌中发现的酶， 该。

7、酶仅含有一条多肽链。 与液泡膜H+-ATP酶 相比， 液泡膜H+-PPase结构较为简单， 因而更容易实现超表达。 该酶作为一种独特的质子 泵， 它能够将PPi水解为两个Pi， 不仅能够减弱过高浓度的PPi对于胞质中生物大分子合成 的影响， 而且能够利用水解产生的能量催化H+由细胞质进入到液泡中， 建立跨膜的质子梯 度， 为各种溶质分子(如阳离子、 阴离子、 氨基酸和糖类等)跨液泡膜的主动运输提供驱动 力。 0004 獐茅(Aeluropuslittoralis)是一种单子叶禾本科的耐旱植物， 与小麦同族， 主 要分布于中国的山东、 辽宁、 河北和江苏等省。 獐茅高约5-25cm， 具有发达的。

8、根状茎和匍匐 茎， 并且可依靠匍匐茎进行无性繁殖， 是防风固沙的优良植被； 作为优良牧草之一， 獐茅具 有很强的耐盐耐旱能力， 因此可以作为研究植物耐旱性的优良种质资源。 对于獐茅的研究 前期主要集中于其耐盐机制上， 包括獐茅的耐盐生理响应、 盐腺亚显微结构和耐盐分子机 制上， 而对于其耐旱性的研究比较少。 0005 本研究利用RT-PCR、 RACE及锚定PCR技术从獐茅中分离了AlVP1全长cDNA， 分析了 其编码蛋白质序列的结构特征、 进化关系及该基因在獐茅不同组织及非生物逆境胁迫处理 下的表达模式， 并使其在烟草和拟南芥中过表达， 研究AlVP1在干旱胁迫下的功能， 以期为 进一步揭。

9、示该基因的生物学功能及调控机制奠定基础。 说明书 1/9 页 3 CN 105925593 A 3 发明内容 0006 为了解决上述问题， 本发明公开一种液泡膜氢离子焦磷酸酶基因AlVP1、 其编码蛋 白及该基因在植物耐旱性方面的应用。 该基因是从獐茅中分离出来的， 是一种独特的质子 泵， 能够以无机焦磷酸为底物， 水解产生的能量驱动H+由细胞质运输到液泡中， 建立跨液泡 膜的质子梯度， 为许多无机离子的次级转运提供能量， 维持细胞的渗透势， 促进细胞对于水 分的吸收， 这预示着它在提高农作物耐旱性方面的应用价值。 过表达该基因能够提高转基 因烟草对于干旱胁迫的耐受性， 这种提高转基因植物的耐。

10、旱特性， 可通过转基因技术应用 于农作物上， 从而应对日益严重干旱问题。 0007 本发明的目的之一在于提供具有耐旱能力的液泡膜焦磷酸酶基因AlVP1， 该基因 是从獐茅中分离出来的， 具有序列表中SEQIDNO.1所示的碱基序列。 其序列由2802个碱基 组成， 自5 端第132到第2432位残基为该基因的开放阅读框序列。 0008 本发明的另一方面在于提供具有与上文所述的SEQIDNO:1所示的碱基序列95 以上的同源性， 且编码与SEQIDNO:1所示的碱基序列编码的蛋白质具有相同生物学功能 蛋白质的碱基序列。 0009 本发明的目的之二在于提供具有上文所述液泡膜焦磷酸酶基因AlVP1编。

11、码的蛋白 AlVP1， 具有如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列， 其是由766个氨基酸残基组成的蛋白质。 本 发明进一步提供所述液泡膜焦磷酸酶AlVP1编码的蛋白的衍生蛋白质， 即由序列表中SEQ IDNO.2的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基取代、 缺失或添加而产生的具有相同的 生物学功能的衍生蛋白质的氨基酸序列。 0010 本发明的目的之三在于提供一种重组表达载体， 该重组表达载体上含有上文所述 的碱基序列； 且在优选的技术方案中， 是以PTF101作为表达载体， 该植物表达载体含有除草 剂的抗性基因， 可以利用除草剂对转基因植株进行筛选。 0011 本发明的目的之四在于提供一种含有上。

12、文所述重组表达载体的宿主细胞， 所述宿 主细胞优选为根癌农杆菌EHA101菌株。 0012 本发明的目的之五在于提供上文所述的液泡膜焦磷酸酶基因AlVP1在培育耐干旱 转基因植物中的应用。 该基因的转基因植物在干旱胁迫下耐受性明显提高。 优选的技术方 案中， 该基因在提高烟草在干旱胁迫下的耐受性性能中有较好的应用效果。 0013 本发明的有益效果: 0014 本发明的基因AlVP1具有H+-PPase的功能， 该基因能提高转基因烟草在干旱胁迫 下的叶片相对含水量、 增加叶绿素的含量、 减少丙二醛的含量、 提高超氧化物歧化酶的活性 并促进根系的生长， 进而提高植物对于干旱胁迫的耐受性， 同时也预。

13、示着它在农作物耐旱 方面的应用价值。 附图说明 0015 图1为AlVP1基因克隆PCR电 泳图 ， 其中 ： A为保守区部分片段克隆 ， M为 DL2000marker， 泳道1为克隆所得保守区片段， 长度约为780bp； B为3 端部分片段克隆， M为 DL2000marker， 泳道1为克隆所得3 部分片段， 长度约为1.4Kb； C为5 端部分片段克隆， M为 DL2000marker， 泳道1为克隆所得5 部分片段， 长度约为1000bp； D为ORF全长PCR电泳图， M为 说明书 2/9 页 4 CN 105925593 A 4 DL5000marker， 泳道1为ORF， 全长。

14、2301bp。 将上述克隆所得序列测序后进行blast比对， 结果 表明所得片段均与VP家族基因存在较高同源性。 0016 图2为本发明的AlVP1基因编码的蛋白跨膜结构分析图， AlVP1具有14个跨膜结构 域， 表明它是一个典型的跨膜蛋白。 0017 图3为本发明的AlVP1基因编码的蛋白的进化分析图， 结果显示AlVP1与拟南芥、 小 米、 二穗短柄草及短花野生稻的II型液泡膜焦磷酸酶亲缘关系较远； 与同属于单子叶植物 的沟叶结缕草、 大麦及水稻的I型液泡膜焦磷酸酶亲缘关系最近； 与来源于双子叶植物拟南 芥、 欧洲油菜、 甜菜、 盐爪爪、 甘薯和番茄的I型焦磷酸酶亲缘关系次之。 0018。

15、 图4为不同胁迫条件下采用实时定量PCR的方法分析AlVP1基因在根中的表达结果 图， 结果表明该基因能够对不同的胁迫处理作出响应， 除冷胁迫外， 在其它四种胁迫条件下 AlVP1均呈现不同程度的上调表达， 其中对于NaCl胁迫的响应最为强烈。 0019 图5为不同胁迫条件下采用实时定量PCR的方法分析AlVP1基因在叶中的表达结果 图， qPCR分析结果表明， 在干旱、 NaCl以及缺钾胁迫下叶子中的AlVP1均呈现不同程度的下 调表达趋势， 干旱处理下下调表达最为明显， 在ABA处理下变化不显著， 而冷胁迫处理下则 呈现上调表达。 0020 图6为重组植物表达载体PTF101-AlVP1的。

16、结构图谱， 表明该基因可在35S启动子的 调控下组成型表达， 重组载体具有除草剂抗性。 0021 图7为除草剂筛选后所获得的阳性转基因烟草苗。 0022 图8为干旱胁迫条件下转基因以及野生型烟草的生长情况及各项生理指标的测定 结果。 具体实施方式 0023 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的应用范围。 下面实施例中未注明具体实验条件的试验方法， 通常按照 常规条件或分子克隆中所述条件， 或按照产品说明书上所提供的条件。 下面是实例中所用 的材料、 试剂等如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0024 试验中使用的试剂盒以及试剂： 。

17、无缝连接试剂盒： Trangene公司， pEASY-Uni SeamlessCloningandAseemblyKit； 质粒提取试剂盒： SangonBiotech公司， SanPrep柱 式质粒DNA小量抽提试剂盒。 0025 实施例1AlVP1基因cDNA的克隆与分析 0026 (1)獐茅总RNA提取 0027 称取50mg经过400mMNaCl处理的獐茅叶片， 于液氮中研磨成粉末。 待液氮挥发完 全后， 迅速将其转入含有1mL预冷Trizol试剂的离心管中， 充分混匀， 室温静置10min； 加入 0.2mL氯仿， 混合均匀， 室温静置5min； 于4低温离心机中， 12000r/m。

18、in离心15min， 将上清 液转移至新的离心管中； 加入等体积的异丙醇， 充分混匀， 室温静置10min； 于低温离心机中 4， 12000r/min离心15min； 弃上清， 加入1.0mL预冷的75乙醇(DEPC水配制)， 充分洗涤沉 淀， 4， 7500rpm离心5min； 弃上清， 于超净工作台中吹干至透明状， 加入适量RNase-free水 溶解沉淀。 1的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。 结果呈现了28S、 18S、 5S三种典型的RNA 带型， 各条带清晰， 无明显的拖尾现象， 表明提取的RNA无明显降解， 可进一步用于RT-PCR实 说明书 3/9 页 5 CN 10592。

19、5593 A 5 验。 0028 (2)单链cDNA的获得 0029以提取的獐茅叶片总RNA为模板(500ng)， 根据北京全式金公司 ReverseTranscriptase反转录说明书进行RT-PCR， 得到的单链cDNA可直接用于2nd- StrandcDNA的合成或者PCR扩增等。 0030 (3)獐茅AlVP1基因部分编码区的获得 0031 兼并引物设计： 根据NCBI上提供的沟叶结缕草、 水稻、 大麦、 拟南芥及番茄等植 物的VP家族氨基酸序列进行同源性比对， 在其高度保守区设计一对兼并引物， 序列分别为 表1中的CS-F和CS-R。 0032 PCR扩增： 以反转录获得的单链cD。

20、NA为模板， CS-F和CS-R为正反向引物， PCR扩增 AlVP1基因部分编码区。 将PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳分离(结果如图1A)， 至溴酚蓝指示 带位于凝胶2/3处， 在紫外灯下切下780bp区域的凝胶放入1.5mL离心管中， 用TaKaRa公司 (大连)的MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.3.0回收试剂盒进行回收。 0033 回收DNA片段连接、 转化与测序： 采用宝生物pMD18-Tvector试剂盒， 将回收后 的PCR产物直接与T载体相连， 连接产物用于大肠杆菌转化。 PCR检测呈阳性的克隆， 送测序， 测序后即可确定AlVP1基因的。

21、部分片段信息。 将阳性克隆的测序结果通过NCBI在线数据库 做核酸同源性比对， 结果表明克隆所得片段与小米、 玉米和高粱中H+-PPase同源性分别为 93、 91和91。 初步推断克隆所得片段是獐茅AlVP1基因编码区的部分序列。 0034 (4)RACE法克隆獐茅AlVP1基因3 cDNA 0035 3 RACE特异引物的设计： 根据已获得的獐茅AlVP1基因部分cDNA片段以及 TaKaRa(大连)公司的3 -fullRACEKit提供的引物3 RACEOuterPrimer/3 RACEInner Prime， 设计一对嵌套PCR引物： 3 正向特异性外侧引物3-GSP1， 巢式特异性。

22、内侧引物3- GSP2， 引物序列见表1。 0036 单链cDNA的获得： 按照Takara3 RACE试剂盒操作， 反转录所得单链cDNA作为巢 式PCR模版。 0037 巢式PCR反应： OuterPCR反应用外侧引物3-GSP1和3 RACEOuterPrimer进行 扩增。 InnerPCR反应以巢式第一轮PCR产物为模板， 用内侧引物3-GSP2和3 RACEInner Primer引物进行巢式扩增。 PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳分离(结果如图1B)、 切胶回收、 连 接克隆载体、 转化大肠杆菌感受态。 选取长度为1.4Kb左右的阳性克隆送测序。 测序结果通 过NCBI数据库做Bla。

23、st比对， 结果显示： 该序列与小米、 高粱、 玉米和水稻液泡膜焦磷酸酶基 因3 端序列相似度分别为93、 91、 90和86， 初步推断该片段是獐茅AlVP1基因3 端 部分序列。 0038 (5)锚定PCR法克隆AlVP1基因5 cDNA 0039 本实施例中AlVP1基因5 cDNA序列采用锚定PCR方法获得。 步骤如下： 根据已克隆 得到的AlVP1基因保守区序列设计2条特异性巢式引物， 以獐茅总RNA反转录成的cDNA为模 板， 用5-G0为引物进行单引物扩增， 在末端转移酶(TdT)的作用下， 在单链扩增产物的5 末 端加上寡聚鸟嘌呤Oligod(G)， 以加尾产物为模板， 利用特。

24、异性引物5-GSP1、 5-GSP2和 Oligod(C)为正反向引物对加尾的产物进行PCR扩增， 将PCR结果电泳， 切取目标条带回收 测序， 并鉴定。 PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳分离(图1C)、 切胶回收， 连接克隆载体， 转化大 说明书 4/9 页 6 CN 105925593 A 6 肠杆菌感受态， PCR检测长度约为1000bp的阳性克隆送测序。 通过NCBI数据库对测序结果进 行核苷酸同源性比对， 结果显示该序列与大麦、 玉米、 结缕草、 小米及水稻等的液泡膜焦磷 酸酶基因5 端序列的同源性分别为92、 91、 87、 85和81， 初步推断该片段是獐茅 AlVP1基因5 端部分。

25、序列。 0040 (6)獐茅AlVP1基因编码区的获得 0041 通过保守区扩增以及3 RACE和5 锚定实验后分别获得了781bp的保守区序列， 1266bp的3 端和755bp的5 端序列， 将上述克隆得到的3 端、 5 端以及保守区序列进行拼 接， 通过NCBI在线分析软件ORFfinder获得了一段具有完整开放阅读框的cDNA序列信息。 以獐茅叶片反转录得到的单链cDNA为模板， 以带有植物表达载体同源臂的AlVP1-S和 AlVP1-A为正反向引物PCR扩增AlVP1基因的ORF(图1D)， PCR产物测序后得到长度为2301bp 的开放阅读框序列， 与拼接的编码区序列结果完全一致，。

26、 将该基因命名为AlVP1。 0042 (7)生物信息学分析 0043 利用TMpred在线软件对AlVP1进行跨膜结构域预测， 结果表明AlVP1具有14个跨膜 结构域， 是一个跨膜蛋白(图2)。 系统发育分析表明AlVP1是典型的液泡膜氢离子焦磷酸酶 家族成员(图3)， 与已报导的其他植物I型液泡膜H+-PPase具有很高的同源性， 其中与沟叶 结缕草(Zoysiamatrella)I型液泡膜焦磷酸酶的同源性最高达96， 与水稻(Oryza sativa)、 番茄(Solanumlycopersicum)、 大麦(Hordeumvulgare)、 番薯(Ipomoea batatas)、 。

27、盐爪爪(Kalidiumfoliatum)、 油菜(Brassicanapus)、 拟南芥(Arabidopsis thaliana)及甜菜(Betavulgaris)的I型液泡膜焦磷酸酶同源性介于86-94之间， 而与 拟南芥(Arabidopsisthaliana)II型焦磷酸酶的一致性最低为39(表2)。 0044 表1.AlVP1基因克隆所用引物 说明书 5/9 页 7 CN 105925593 A 7 0045 0046 表2.AlVP1与其他高等植物VP家族氨基酸同源性分析 0047 名称来源同源性() ZmVP1Zoysiamatrella96 OsVP1Oryzasativa9。

28、4 SlVP1Solanumlycopersicum93 HVP1Hordeumvulgare92 IbAVP1Ipomoeabatatas89 KfVP1Kalidiumfoliatum87 BnVP1Brassicanapus87 AtVP1Arabidopsisthaliana87 BVP1Betavulgaris86 AVP2Arabidopsisthaliana39 0048 实施例2獐茅中AlVP1基因表达模式分析 0049 本实验所用獐茅材料种植于大连理工大学天台， 采用压条法进行无性繁殖， 以保 证其遗传背景的一致性。 待小苗于石英砂中定根后(约1-2周)将其从总株上剪下， 置。

29、于恒温 光照培养箱中缓苗10d。 缓苗结束后选取长势一致的植株分别进行干旱、 盐、 冷、 ABA以及缺 钾胁迫处理。 本实验采用30PEG6000处理24h的方法模拟自然干旱； 将獐茅植株置于4的 说明书 6/9 页 8 CN 105925593 A 8 冰箱中用于低温诱导处理； 400mmolL-1NaCl溶液浇灌用于盐胁迫诱导； 100 molL-1ABA 浇灌用于ABA胁迫处理； 不含钾的营养液浇灌用于诱导缺钾胁迫。 没有胁迫处理的植株作为 对照组。 各处理及对照组均设三个平行， 24h后取样， 分别收集其根和叶片并混合均匀提取 总RNA， 合成cDNA， 方法同实施例一。 以eEF为内。

30、参基因， 进行qRT-PCR， 引物碱基序列见表3。 0050 表3.qRT-PCR扩增引物 0051 0052 0053 结果表明， 相对于对照组， 除冷胁迫外， 在其它四种胁迫条件下根部中AlVP1均呈 现不同程度的上调表达， 其中对于NaCl胁迫的响应程度高于其他非生物胁迫(图4)； 在干 旱、 NaCl以及缺钾胁迫下叶子中的AlVP1均呈现不同程度的下调表达趋势， 干旱处理下下调 表达最为明显， 在ABA处理下变化不显著， 而冷胁迫处理下则呈现上调表达(图5)。 0054 实施例3转AlVP1基因烟草的获得 0055 (1)AlVP1基因植物表达载体构建 0056 植物表达载体PTF1。

31、01的获得： 采用生工生物工程有限公司质粒小提试剂盒提取 PTF101植物表达载体的质粒， 具体方法见说明书。 利用SmaI及SpeI两种限制性内切酶对 pTF101-35s植物表达载体进行双酶切反应， 使其线性化， 采用琼脂糖凝胶电泳对酶切后的 产物检测， 切下目标区域处的凝胶并用胶回收试剂盒进行回收纯化。 0057 AlVP1编码区的获得： 以反转录所得单链cDNA为模板， 分别以AlVP1-S及AlVP1-A 为正反向引物， 扩增AlVP1基因编码区。 利用1的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果， 切下目标 区域处的凝胶并用胶回收试剂盒进行回收纯化。 0058 连接： 利用无缝克隆试剂盒将回收。

32、纯化后的植物表达PTF101与AlVP1基因编码 区进行连接。 0059 采用热击法将连接液转化大肠杆菌DH5 ， PCR检测筛选出阳性克隆。 0060 阳性重组质粒转化农杆菌： 提取PTF101-AlVP1质粒， 转化农杆菌EHA101感受态 细胞。 根癌农杆菌EHA101感受态细胞的制备方法如下： 挑取EHA101单菌落于含有100mg/L利 福平和100mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中， 28， 180rpm振荡培养过夜。 取过夜培养的菌 体按1:100的比例接种到50mLYEB液体培养基中， 28， 180rpm振荡培养3-4h至细菌生长对 数期OD6000.5-0.6左右。 取5。

33、mL菌液于4， 4000rpm离心10min， 沉淀用5mL预冷的TE (pH7.5)洗涤一次， 加1mL新鲜的YEB培养基， 重新悬浮， 分装， -70保存。 0061 采用冻融法将质粒PTF101-AlVP1导入农杆菌， 方法如下： 取一管(0.2mL)根癌农杆 菌(Agribecteriumtumefaciens)EHA101菌株感受态细胞置冰上融化， 加入1g质粒 PTF101-AlVP1， 混匀， 然后依次在冰上、 液氮中及37水浴中放置5min， 用YEB液体培养基稀 释至1mL， 于28， 180rpm振荡培养2-4h； 取适量菌液涂布于含有100mg/L利福平、 100mg/L。

34、卡 说明书 7/9 页 9 CN 105925593 A 9 那霉素和50mg/L壮观霉素的YEB平板培养基上， 28培养36h左右长出抗性菌落， PCR及酶切 确定阳性克隆。 0062 (2)叶盘转化法转化烟草 0063 a.转化用烟草叶片的制备： 取生长二十天左右的无菌烟草叶片去除主脉， 用无菌 剪刀将其剪成1cm2的小块作为侵染用外植体。 0064 b.转化用农杆菌菌液的制备： 将从-80冰箱中取出来的含有重组表达载体的农 杆菌在固体的YEB培养基(YEB+100mg/LRif+100mg/LKan+50mg/LSpec)中进行划线培养。 挑取生长状态良好的单菌落接种于5ml含有上述抗生。

35、素的YEB液体培养基中， 28， 180rpm 过夜摇菌20h左右。 将过夜活化的农杆菌按照1:50的比例加入到不含抗生素的液体YEB中， 28振荡培养46h至OD600约为0.50.6。 0065 c.转化： 将剪好的烟草叶片放入上述农杆菌菌液中5-10min， 期间缓慢摇晃2-3次。 侵染结束后将叶片置于无菌的滤纸上以吸干残余的菌液， 远轴面向上置于分化培养基(MS+ 6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L)上28暗培养2d。 0066 d.抗性芽的筛选及转基因植株的生根培养： 共培养两天后， 叶盘周围会长出清晰 可见的农杆菌菌落， 此时用灭菌水将材料清洗一次， 转移到含有双丙氨膦和。

36、头孢霉素的筛 选培养基上进行筛选， 两周左右即可形成愈伤组织。 将烟草愈伤组织转移到新的筛选培养 基上继续培养至长出幼芽， 用灭菌手术刀切下2cm以上的幼芽， 置于生根培养基(MS+NAA 0.1mg/L+500mg/L头孢+双丙氨膦)上进行生根培养(图7)。 0067 实施例4干旱胁迫条件下转基因烟草的生理检测 0068 将PCR检测为阳性的T0代转基因烟草利用无性繁殖的方式进行扩增， 以获得足够 的苗用于生理实验。 将生长状态一致的T0代转基因烟草与野生型植株(WT)种植于花盆中， 并置于恒温光照培养箱中进行缓苗培养， 培养条件为25/23(昼/夜)， 光周期16h/8h (昼/夜)， 空。

37、气湿度60-70， 培养两周后进行干旱胁迫处理。 本实验采用苛扣浇水的方法模 拟自然条件下的干旱， 干旱处理前给所有植株浇以充足的水分， 之后不再浇水。 分别在干旱 处理的第0天、 第4天、 第8天、 第12天和第16取样测定叶片相对含水量(RWC)、 丙二醛(MDA)含 量、 叶绿素含量、 SOD酶活性以及根的干重等各项生理指标。 为保证实验结果的准确性， 各指 标的测定均设有三个重复。 0069 实验结果： 干旱胁迫16d后， 野生型植株出现了严重萎蔫及生长阻滞的现象， 而 AlVP1基因过表达的转基因烟草仍然正常生长(图8A)。 为进一步了解烟草叶片中水分的损 失状况， 本研究测定了干旱。

38、处理前后野生型及转基因烟草的RWC。 干旱处理之前转基因及野 生型烟草的叶片相对含水量并无显著差异， 其相对含水量分别为84和82， 在干旱胁迫 下二者叶片中RWC均会有所下降， 但野生型烟草植株下降程度要高于转基因植株， 在干旱胁 迫16d时野生型烟草的RWC为46， 而转基因烟草的RWC则为69(图8B)； 在正常生长条件 下， 野生型以及转基因烟草中MDA的含量均较低， 且二者并无明显差异； 随着干旱天数的不 断增加， 烟草叶片中MDA的含量不断上升， 在干旱处理16d， 野生型烟草中MDA的含量为正常 生长条件下的3倍， 而转基因烟草仅为正常条件下的2.4倍， 相比于转基因烟草， 野生。

39、型烟草 具有较高的MDA上升程度(图8C)； 干旱处理前转基因烟草中叶绿素含量要高于野生型植株， 干旱胁迫导致二者叶绿素流失的增加， 然而AlVP1过表达烟草中叶绿素流失的程度低于野 生型烟草(图8D)； 在正常生长条件下， 转基因植株中SOD的活性要高于野生型植株， 且随着 说明书 8/9 页 10 CN 105925593 A 10 干旱处理时间的的不断延长， 二者叶片中SOD的活性均不断提高， 干旱处理16d时AlVP1基因 过表达烟草中SOD的活性仍高于野生型烟草(图8E)； 增加的根部生长可能是导致转基因植 株具有较高的干旱胁迫耐受性的部分原因。 干旱处理16d后， 转基因烟草的根系。

40、明显发达于 野生型烟草(图8F)， 干重的测量结果也表明， AlVP1基因过表达的转基因烟草根系的干重是 野生型烟草的1.7倍(图8G)。 0070 因此， 该实验证明了过表达AlVP1基因能通过提高叶片相对含水量、 叶绿素含量、 SOD酶活性、 降低MDA含量及促进转基因植株根系的生长， 从而使得其具有优于野生型植株 的表型及生理特性， 最终在干旱胁迫下受到较少的伤害。 说明书 9/9 页 11 CN 105925593 A 11 0001 序列表 1/2 页 12 CN 105925593 A 12 0002 序列表 2/2 页 13 CN 105925593 A 13 图1 图2 说明书附图 1/5 页 14 CN 105925593 A 14 图3 图4 说明书附图 2/5 页 15 CN 105925593 A 15 图5 图6 图7 说明书附图 3/5 页 16 CN 105925593 A 16 说明书附图 4/5 页 17 CN 105925593 A 17 图8 说明书附图 5/5 页 18 CN 105925593 A 18 。