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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310621194.2 (22)申请日 2012.12.21 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103848895 A (43)申请公布日 2014.06.11 (62)分案原申请数据 201210561409.1 2012.12.21 (73)专利权人 南昌大学 地址 330031 江西省南昌市红谷滩新区学 府大道999号 (72)发明人 何庆华许杨 (74)专利代理机构 南昌新天下专利商标代理有 限公司 36115 代理人 施秀瑾 (51)Int.Cl. 。
2、C07K 7/08(2006.01) C12N 15/31(2006.01) C12P 21/02(2006.01) C12N 15/63(2006.01) G01N 33/68(2006.01) (56)对比文件 CN 102584952 A,2012.07.18, US 2010068219 A1,2010.03.18, K.Thirumala-Devi et al.Phage- displayed peptides that mimic a atoxin B1 in serological reactivity. Journal of Applied Microbiology .2001。
3、,第90卷330-336. 邓省亮. 1.黄曲霉毒素Bl胶体金免疫层析 快速检测方法的研究 2.应用噬菌体展示肽库淘 选黄曲霉毒素B1模拟表位 . 中国优秀博硕士学 位论文全文数据库 （硕士） 工程科技I辑 .2006, (第10期),摘要， 第43、 45、 58页. 审查员 苗荻 (54)发明名称 黄曲霉毒素B1的线性十二肽抗原模拟表位 及其应用 (57)摘要 本发明属于生物技术领域， 涉及黄曲霉素B1 的抗原模拟表位， 其氨基酸序列为DPRKHIH。 本发 明黄曲霉素B1抗原模拟表位可以替换价格昂贵 且毒性强的AFB1标准品， 并作为竞争抗原或固相 包被抗原应用于AFB1的免疫学检测， 。
4、该抗原模拟 表位具有与天然AFB1分子相似的免疫反应特性， 效果非常好。 减少了AFB1对人体健康的危害， 节 约了成本， 具有很高的应用价值。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 103848895 B 2017.10.31 CN 103848895 B 1.黄曲霉素B1的线性十二肽抗原模拟表位， 其特征在于其氨基酸序列为VPYSPHYFERMI。 2.编码权利要求1所述线性十二肽抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸。 3.如权利要求2所述的核苷酸， 其序列为GTT CCG TAT TCG CCT CAT TAT TTT GAG CGT ATG ATT。 4.如权利要求1所述抗。
5、原模拟表位的制备方法， 其特征在于通过噬菌体扩增、 化学合成 或基因工程重组表达的方式进行大量制备； 所述噬菌体扩增是指将展示有黄曲霉素B1的线 性十二肽抗原模拟表位的噬菌体， 通过生物扩增的方式， 大量繁殖生产展示有黄曲霉素B1 的线性十二肽抗原模拟表位的噬菌体粒子； 所述化学合成指依据模拟表位模拟表位氨基酸 序列， 通过化学合成多肽的方式进行多肽合成； 所述基因工程重组表达的方式是指将编码 模拟表位的基因， 通过克隆至表达载体， 以多肽-融合蛋白的形式进行黄曲霉素B1的线性十 二肽抗原模拟表位的大量制备。 5.权利要求1所述抗原模拟表位在非疾病诊断治疗目的免疫学检测分析中的应用。 6.如权。
6、利要求5所述应用， 其特征在于黄曲霉素B1的线性十二肽抗原模拟表位以固相抗 原或竞争抗原在非疾病诊断治疗目的免疫学检测分析中的应用。 7.如权利要求5所述应用， 其特征在于黄曲霉素B1的线性十二肽抗原模拟表位作为固相 抗原在非疾病诊断治疗目的胶体金免疫层析检测分析中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103848895 B 2 黄曲霉毒素B1的线性十二肽抗原模拟表位及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及黄曲霉毒素B1抗原模拟表位及其应用。 背景技术 0002 黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1， AFB1)是主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢 产物， 。
7、广泛存在于花生、 棉籽、 玉米、 小麦和稻米等农作物中。 AFB1对人及动物肝脏组织有破 坏作用， 严重时可导致肝癌甚至死亡， 1993年被WHO的癌症研究机构划定为I类致癌物。 因 此， 食品中AFB1的检测对于人类健康意义重大。 0003 目前， 检测食品中AFB1的方法主要有高效液相色谱、 气相色谱、 薄层色谱及免疫学 检测等方法， 免疫学检测方法以其灵敏度高、 检测方便、 成本低廉等优势在AFB1的检测中得 到了广泛的应用。 然而， 在建立免疫学检测方法的过程中， 必须使用AFB1标准品为原料来制 备竞争抗原或者固相包被抗原， AFB1不仅价格昂贵而且具有极强的致癌性， 对检测人员的 。
8、健康和环境造成极大的威胁， 从而在一定程度上制约了免疫学检测方法的应用和推广。 有 鉴于此， 人们开始采用抗独特型抗体及抗原模拟表位技术来实现有害小分子物质标准品的 替代， 并取得了一定的进展。 噬菌体展示肽库技术的主要特点是可有效地筛选出与目标靶 体特异结合的噬菌体展示多肽， 该技术在探索受体与配体之间相互作用结合位点、 寻求高 亲和力生物活性的配体分子、 探索未知蛋白质空间结构表位、 新型疫苗的研制等方面应用 广泛。 0004 本发明通过用噬菌体展示肽库技术， 从肽库中筛选出能与靶分子 （抗AFB1单克隆 抗体） 特异性结合的多肽 （抗原模拟表位） ， 该抗原模拟表位具有与天然AFB1分子。
9、相似的免 疫反应特性， 通过获得的AFB1抗原模拟表位， 以代替价格昂贵且毒性强的AFB1标准品， 并作 为竞争抗原或固相包被抗原应用于AFB1的免疫学检测。 发明内容 0005 本发明以抗AFB1单克隆抗体为靶分子， 将靶分子固相包被于酶标板上， 分别投入 噬菌体随机展示环七、 十二肽库， 分别进行亲和淘选， 获得了两种AFB1的抗原模拟表位 （环 七肽及十二肽各1种） 。 它们的氨基酸序列如下： 0006 AFB1抗原模拟表位1： 从噬菌体随机环七肽库中筛选的AFB1抗原模拟表位 （多肽） ， 其氨基酸序列为： CDPRKHIHC。 0007 AFB1抗原模拟表位2： 从噬菌体随机十二肽库。
10、中筛选的AFB1抗原模拟表位 （多肽） ， 其氨基酸序列为： VPYSPHYFERMI。 0008 本发明还涉及编码上述抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸序列， 优选为GAT CCG CGT AAG CAT ATT CAT或GTT CCG TAT TCG CCT CAT TAT TTT GAG CGT ATG ATT。 0009 上述抗原模拟表位 （多肽） 结构中， 大写英文字母分别代表二十一种已知天然L-型 氨基酸残基或其D-型异构体的一种， 即C代表半胱氨酸残基， D代表天冬氨酸残基， P代表脯 氨酸残基， R代表精氨酸残基， K代表赖氨酸残基， H代表组氨酸残基， I代表异亮氨酸残基， V 。
11、说明书 1/6 页 3 CN 103848895 B 3 代表缬氨酸残基， Y代表酪氨酸残基， S代表丝氨酸残基， F代表苯丙氨酸残基， E代表谷氨酸 残基， M代表甲硫氨酸残基。 模拟表位1的N末端和C末端的两个半胱氨酸残基形成分子内二 硫键， 为环状结构。 0010 本发明提及的AFB1抗原模拟表位 （多肽） 可通过噬菌体扩增、 化学合成或基因工程 重组表达 0011 的方式进行大量制备。 噬菌体扩增是指将展示有AFB1抗原模拟表位 （多肽） 的噬菌 体， 通过生物扩增的方式， 大量繁殖生产展示有AFB1抗原模拟表位 （多肽） 的噬菌体粒子。 化 学合成是指依据公布的模拟表位1、 模拟表位。
12、2的氨基酸序列， 通过化学合成多肽的方式进 行多肽合成。 基因工程重组表达的方式是指将编码模拟表位1或模拟表位2的基因， 通过克 隆至表达载体， 以多肽-融合蛋白的形式进行AFB1抗原模拟表位的大量制备。 0012 本发明还涉及所述黄曲霉素B1抗原模拟表位在免疫学检测分析中的应用。 免疫学 检测的类型包括酶联免疫吸附检测、 胶体金免疫层析、 免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异 性反应的免疫学分析检测类型。 0013 本发明黄曲霉素B1抗原模拟表位 （CDPRKHIHC， VPYSPHYFERMI） 在应用时， 可以把合 成的模拟表位用于免疫学检测分析， 将通过噬菌体扩增获得的展示有AFB1抗原模。
13、拟表位 （多肽） 的噬菌体粒子直接用于分析检测， 当然， 也可以将AFB1抗原模拟表位从噬菌体上切 下来代替AFB1标准品来进行免疫学检测分析。 0014 还涉及黄曲霉素B1抗原模拟表位以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的 应用。 0015 还涉及黄曲霉素B1抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析检测分析中的 应用。 0016 前述黄曲霉素B1抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性强的AFB1标准品， 并作为 竞争抗原或固相包被抗原应用于AFB1的免疫学检测， 该抗原模拟表位具有与天然AFB1分子 相似的免疫反应特性， 效果非常好。 0017 本发明的有益效果是： 本发明黄曲霉素B1抗原模拟。
14、表位可以替换价格昂贵且毒性 强的AFB1标准品， 并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于AFB1的免疫学检测， 该抗原模拟表 位具有与天然AFB1分子相似的免疫反应特性， 效果非常好。 减少了AFB1对人体健康的危害， 节约了成本， 具有很高的应用价值。 附图说明 0018 图1为以AFB1抗原模拟表位1建立的间接竞争ELISA标准曲线。 检测范围4.0-31.3 ng/mL， IC50为11.7 ng/mL。 0019 图2为以AFB1抗原模拟表位2建立的间接竞争ELISA标准曲线。 检测范围4.6-50.1 ng/mL， IC50为15.2 ng/mL。 具体实施方式 0020 实施例1.AF。
15、B1抗原模拟表位的亲和淘选及其鉴定 0021 1） AFB1抗原模拟表位的亲和淘选： 具体方法为： 用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗 AFB1单克隆抗体， 并以终浓度100 g/mL 包被96孔酶标板， 4孵育过夜。 第二天用TBST 说明书 2/6 页 4 CN 103848895 B 4 (50 mM NaCl, pH 7.5包含0.1% Tween-20 (v/v) ) 洗涤10次后， 加入300 l封闭液 （3% BSA-PBS） 4孵育2小时。 2小时后弃封闭液， 用TBST洗涤5次， 每孔加入100 l噬菌体肽库 （噬菌体展示环七肽库或十二肽库， 购自NEB公司， 用。
16、TBS 10倍稀释噬菌体原液， 约1.01011 pfu） ， 22-26振荡反应1小时。 弃去未结合的噬菌体， 用TBST洗涤10次， 结合上的噬菌体用 0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2) 洗脱， 并立即用15 l 1 M Tris-HCl (pH 9.1) 中和。 取10 l洗脱噬菌体测滴度， 其余的用于感染20 mL生长至对数前期的E. coli ER2738菌株进行 扩增。 第三天用PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体， 并测定扩增后噬菌体的滴度。 0022 在第二、 第三轮的淘选过程中， 包被的抗AFB1单克隆抗体浓度分别为75 g/mL和 50 g/mL， 所用的TBS。
17、T浓度为0.25%和0.5%， 其余步骤同上。 0023 2） 阳性噬菌体克隆的鉴定： 从第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑取 20个噬菌体斑， 进行噬菌体的扩增， 采用间接酶联免疫吸附检测方法 （Indirect Enzyme Linked immunoasorbent assay, I-ELISA） 进行阳性噬菌体克隆的鉴定， 具体方法为： 首 先， 用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗AFB1单克隆抗体， 10 g/mL包被96孔酶标板， 4孵育过 夜。 第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v) )洗涤3次后， 用含有3%脱脂奶粉。
18、 的PBS进行封闭， 37孵育1小时； 投入100 l噬菌体斑扩增液 （1.01011 pfu） ， 以原始噬菌 体肽库作为阴性对照， 37 孵育1小时； 加入1:5000倍稀释的HRP标记抗M13噬菌体二抗100 l， 37 孵育1小时； 加入100l TMB底物液， 避光显色5min， 酶标仪 （Thermo Scientific Multiskan FC） 读取450 nm处的吸收值。 选取OD450大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克 隆。 0024 3) AFB1抗原模拟表位的鉴定： 采用间接竞争ELISA的方法进行AFB1抗原模拟表位 的鉴定， 具体方法为： 用10 mM PBS 。
19、(pH 7.4) 稀释抗AFB1单克隆抗体， 10 g/mL包被酶标 板， 4孵育过夜； 第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v) 洗涤3次后， 用含 有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭， 37孵育1小时； 投入50 l经间接ELISA鉴定为阳性的噬菌 体克隆 （1.01011 pfu） 和50 l AFB1标准品 （浓度范围为0-20 ng/ml） ， 37孵育1小时； 加 入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100 l， 37孵育1小时； 加入100l TMB底物液， 避光显色5min， 读取OD450， 能结合抗AFB1单克隆抗体， 且能。
20、被AFB1标准品所阻断的噬菌体， 鉴 定为AFB1的抗原模拟表位。 0025 实施例2.AFB1抗原模拟表位编码基因的测序及其氨基酸序列的确定 0026 将经过间接竞争ELISA鉴定展示有AFB1抗原模拟表位的噬菌体进行扩增， 提取噬 菌体的DNA测序模板。 简要过程如下： 进行噬菌体扩增， 在第一步离心后， 将800 l含噬菌体 上清转入一新离心管。 加入200 l PEG/NaCl沉淀噬菌体。 离心后将沉淀重悬于100 l碘化 物缓冲液 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 4 M NaI)， 加入250 l无水乙醇沉淀 DNA， 离心后再用70%乙醇洗。
21、涤沉淀 （DNA测序模板） 。 沉淀最终重悬于20 l灭菌水， 取2 l进 行琼脂糖凝胶电泳分析； 取5 L噬菌体模板进行DNA测序， 其-96 gIII 测序引物为： 5 - HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3 。 依据DNA测序结果及密码子表可获得AFB1抗原模拟表 位的氨基酸序列： CDPRKHIHC和VPYSPHYFERMI。 0027 实施例3.AFB1 抗原模拟表位作为竞争抗原在ELISA中的应用 0028 (1) 样品提取 0029 称取5g 样品 （谷物及其相关食品） ， 加入25 毫升 60 % 的甲醇-PBS溶液， 200 说明书 3/6 页 5 。
22、CN 103848895 B 5 rpm振荡5分钟； 将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤后， 取1毫升滤液加入4毫升 PBS （磷 酸盐缓冲液， pH=7.2） 混匀后， 即为样品提取液， 待用。 0030 （2） 包被及封闭 0031 用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗AFB1单克隆抗体， 10 g/mL包被酶标板， 4孵育 过夜。 第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v) 洗涤3次后， 用含有3%脱脂奶 粉的PBS进行封闭， 37孵育1小时后， 用PBST洗板6次待用。 0032 （3） 标准曲线的建立 0033 取出经步骤 （。
23、2） 处理好的板条， 每孔分别投入50 l展示有AFB1抗原模拟表位的噬 菌体 （1.01011 pfu） 和一系列不同浓度的50 l AFB1标准品， 37孵育1小时。 加入1:5000 稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗， 37孵育1小时。 然后用TMB底物显色， 读取OD450。 以AFB1 浓度对数为横坐标， 结合率 （加入AFB1的孔的OD450/未加入AFB1的孔的OD450100%） 为纵坐 标， 建立间接竞争标准曲线。 结果显示标准曲线呈S型， 线性相关性较好， 检测范围4.0-31.3 ng/mL， IC50为11.7 ng/mL （图1） 。 同样地， 以模拟表位2建立间接。
24、竞争ELISA标准曲线， 检测范 围4.6-50.1 ng/mL， IC50为15.2 ng/mL （图2） 。 0034 （4） 样品的检测 0035 取出经步骤 （2） 处理好的板条， 每孔分别投入50 l展示有AFB1抗原模拟表位的噬 菌体 （1.01011 pfu） 和待测样品提取液， 37孵育1小时。 加入1:5000稀释HRP标记的抗M13 噬菌体二抗， 37孵育1小时。 然后用TMB底物显色， 读取OD450， 计算结合率， 并根据标准曲 线， 倒推出样品中AFB1的含量。 0036 实施例4.AFB1 抗原模拟表位作为固相抗原在ELISA中的应用 0037 (1) 样品提取 0。
25、038 称取5g 样品 （谷物及其相关食品） ， 加入25 毫升 60 % 的甲醇-PBS溶液， 200 rpm 振荡5分钟； 将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤后， 取1毫升滤液加入4毫升 PBS （磷酸盐 缓冲液， pH=7.2） 0039 混匀后， 即为样品提取液， 待用。 0040 （2） 包被及封闭 0041 用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释展示有AFB1抗原模拟表位的噬菌体 （2.01011 pfu） ， 100微升包被于酶标板， 4孵育过夜。 第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v) 洗涤3次后， 用含有3%脱脂奶粉的。
26、PBS进行封闭， 37孵育1小时后， 用PBST洗板6次 待用。 0042 （3） 标准曲线的建立 0043 取出经步骤 （2） 处理好的板条， 每孔分别投入50 l 抗AFB1单克隆抗体 （0.5 ng/ ml） 和一系列不同浓度的50 l AFB1标准品， 37孵育1小时。 加入1:2000稀释HRP标记的羊 抗鼠IgG二抗， 37孵育1小时。 然后用TMB底物显色， 读取OD450。 以AFB1浓度对数为横坐标， 结合率 （加入AFB1的孔的OD450/未加入AFB1的孔的OD450100%） 为纵坐标， 建立间接竞争标准 曲线。 0044 （4） 样品的检测 0045 取出经步骤 （2。
27、） 处理好的板条， 每孔分别投入50 l 抗AFB1单克隆抗体 （0.5 ng/ ml） 和一系列不同浓度的50 l AFB1标准品， 37孵育1小时。 加入1:2000稀释HRP标记的羊 说明书 4/6 页 6 CN 103848895 B 6 抗鼠IgG二抗， 37孵育1小时。 然后用TMB底物显色， 读取OD450。 以AFB1浓度对数为横坐标， 结合率 （加入AFB1的孔的OD450/未加入AFB1的孔的OD450100%） 为纵坐标， 建立间接竞争标准 曲线 0046 实施例5.AFB1 抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析分析中的应用 0047 (1) 样品提取 0048 称取。
28、5g 样品 （谷物及其相关食品） ， 加入25 毫升 60 % 的甲醇-PBS溶液， 200 rpm 振荡5分钟； 将提取液用whatman 1号滤纸进行过滤后， 取1毫升滤液加入4毫升 PBS （磷酸盐 缓冲液， pH=7.2） 混匀后， 即为样品提取液， 待用。 0049 （2） 噬菌体及控制线的点阵 0050 用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释展示有AFB1抗原模拟表位的噬菌体 （2.01011 pfu） ， 用点阵仪或微量移液器将噬菌体划线于硝酸纤维素膜上 （孔径0.2-0.45微米） ， 作为 检测线； 将0.5 mg/ml的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗， 用点阵仪或微量移。
29、液划线于同一张硝酸 纤维素膜上 （位于检测线的上方， 距离大于5毫米） ， 作为控制线。 0051 （3） 胶体金标记AFB1抗体 0052 将AFB1抗体逐滴加入胶体金溶液 （pH=8.2） 中， 边滴边搅拌， 30分钟后， 取1% PEG加 入上述溶液中， 继续搅拌15分钟后加入十分之一体积的 10% BSA溶液， 搅拌15分钟后， 静置 30分钟， 离心后去上清， 得到胶体金标记的AFB1抗体溶液。 0053 （4） 胶体金检测卡的组装 0054 将胶体金标记的AFB1抗体点喷于胶金垫上 （1.0 微克/毫升） ， 将样品垫、 胶金垫， 点阵了检测线和控制线的硝酸纤维素膜和吸收纸进行组装。
30、， 切成试纸条， 装入检测卡中待 用。 0055 （5） 样品的检测 0056 将样品提取液加入样品垫中， 静置10分钟， 若样品中含有AFB1且超过胶体金检测 试纸的检测阈值， 则检测线区域不显色， 而控制线区域显色； 若样品中不含有AFB1且低于胶 体金检测试纸的检测阈值， 则检测线区域显色， 控制线区域也显色。 若控制线区域不显色， 表明试纸条失效。 0057 实施例5 AFB1抗原模拟表位的大量制备 0058 （1） 以噬菌体扩增的方式 0059 将展示有AFB1抗原模拟表位的噬菌体加入至20 ml接种有ER 2738的培养物中， 37 度220 rpm振荡培养4.5 h。 将培养物转。
31、入另一离心管中， 4 10000 rpm离心10 min， 将上 清的上部80 %转入一新鲜管中， 加入1/6体积的PEG/NaCl， 4 下静置120 min。 4 10000 rpm离心PEG/NaCL静置溶液 15 min。 弃上清， 短暂离心后吸去残留上清液。 加入1mL TBS进 行重悬， 即为噬菌体扩增液。 0060 （2） 以AFB1抗原模拟表位-融合蛋白的方式进行制备 0061 A. PCR扩增AFB1抗原模拟表位的外源编码基因 0062 PCR 反应体系： (50 L) 0063 10 Pyrobest Buffer (Mg2+ plus) 5 L 0064 dNTP Mix。
32、ture (each for 2.5 mM) 4 L 0065 M13KE insert extension primer (10 mM） 1 L 说明书 5/6 页 7 CN 103848895 B 7 0066 -96 gIII sequencing primer (10 mM) 1 L 0067 噬菌体DNA模板 1 L 0068 Pyrobest DNA Polymerase 0.5 L 0069 灭菌ddH2O 37.5 L 0070 PCR 反应条件： 0071 95 5min 0072 接着95 30 sec， 55 30 sec， 72 40sec， 72 10 min共30 。
33、cycles。 0073 采用 PCR 产物回收试剂盒纯化 PCR 产物， 微量核酸定量仪定量。 AFB1抗原模拟 表位1的编码基因序列为GAT CCG CGT AAG CAT ATT CAT； AFB1抗原模拟表位2的编码基因 序列为： GTT CCG TAT TCG CCT CAT TAT TTT GAG CGT ATG ATT。 0074 B. 外源编码基因及表达载体的双酶切 0075 分别采用ACC65I和Eag I 酶对外源编码基因和表达载体 （pMAl-pIII, NEB公司， 可表达MBP融合蛋白） 进行双酶切。 0076 C. 酶切后产物的连接及转化 0077 将质粒pMal-。
34、PIII 和目的片段以1 10 （摩尔比） 混匀， 于 16 水浴连接 12 h, 取10 L连接产物加至100 L感受态细胞TB1中， 充分混匀。 冰浴30 min后， 42 水浴热激 90 s， 立即冰浴5 min后补加600 L LB液体培养液， 37 ， 200 rpm培养1 h， 10000 rpm离 心2 min， 吸去上清留取约200 L， 涂布于LB-A固体 （Ampr） 培养基中， 37 过夜培养， 得到 阳性克隆。 0078 AFB1抗原模拟表位-MBP融合蛋白的表达 0079 将上述获得的阳性克隆子， 从平板上挑一单菌落接种于5 mL LB-A， 0.2%蔗糖中， 37，。
35、 220 r/min， 振荡培养过夜， 将过夜培养物按1 %接种量 （v/v） 接种于50 mL的LB-A， 0.2 %蔗糖培养基中， 分别接种3瓶， 37， 220 r/min振荡培养， 当培养物细菌浓度OD600达到0.6 时， 向三瓶培养物中加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L， 220 r/min振荡培养， 将诱导物 （PEG 溶液） 于4 ， 4000 g， 离心20 min收集菌体沉淀， 弃上清。 重悬细胞于400 mL 30 mM Tris- HCl， 20%蔗糖， pH 8.0 (80 mL/g细胞湿重)， 加入EDTA至1 mM， 室温下震荡5-10 min， 8000。
36、 g， 4， 离心20 min， 弃上清， 沉淀重悬于400 ml预冷的5 mM MgSO4， 冰上震荡10 min， 8000 g， 4， 离心20 min， 保留上清， 向上清液中加入8 mL 1 M Tris-HCl, pH 7.4， 获得AFB1抗 原模拟表位-MBP融合蛋白。 说明书 6/6 页 8 CN 103848895 B 8 0001 SEQUENCE LISTING 0002 南昌大学 0003 黄曲霉毒素B1的线性十二肽抗原模拟表位及其应用 0004 1 0005 4 0006 PatentIn version 3.3 0007 1 0008 9 0009 PRT 001。
37、0 人工序列 0011 1 0012 Cys Asp Pro Arg Lys His Ile His Cys 0013 1 5 0014 2 0015 12 0016 PRT 0017 人工序列 0018 2 0019 Val Pro Tyr Ser Pro His Tyr Phe Glu Arg Met Ile 0020 1 5 10 0021 3 0022 21 0023 DNA 0024 人工序列 0025 3 0026 gatccgcgta agcatattca t 21 0027 4 0028 36 0029 DNA 0030 人工序列 0031 4 0032 gttccgtatt cgcctcatta ttttgagcgt atgatt 36 序列表 1/1 页 9 CN 103848895 B 9 图 1 图 2 说明书附图 1/1 页 10 CN 103848895 B 10 。