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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610479603.3 (22)申请日 2016.06.28 (71)申请人 焦作健康元生物制品有限公司 地址 454003 河南省焦作市马村区万方工 业园区焦作健康元生物制品有限公司 (72)发明人 林楠棋张欣张书汁李占涛 李兆如 (74)专利代理机构 焦作市科彤知识产权代理事 务所(普通合伙) 41133 代理人 秦贞明 (51)Int.Cl. C12P 19/38(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种微生物发酵法生产 -胸苷的。
2、生产工艺 (57)摘要 本发明公开了一种微生物发酵法生产 -胸 苷的生产工艺， 包括菌种培养、 种子培养和发酵 培养工艺得到发酵液， 通过优化发酵条件， 减少 发酵级数， 并且使工艺易于控制， 调整培养基的 配方， 降低发酵成本。 本发明的有益效果为： 本发 明工艺简单， 发酵级数少， 工艺稳定易于控制， 成 本较低， 适合工业生产。 权利要求书1页 说明书4页 CN 105950689 A 2016.09.21 CN 105950689 A 1.一种微生物发酵法生产 -胸苷的生产工艺， 其特征在于， 包括以下步骤， （1） 菌种培养 a1.将细菌接种于盛有培养基的培养皿A中， 于36-37培。
3、养22-24h； 将生长成熟的菌 种继续接种于培养皿B中， 于36-37培养12-16h； b1.将培养皿B用生理盐水冲洗， 得菌液， 备用； （2） 种子培养 a2.向种子罐中加入适量的水， 依次加入酵母浸粉5-25g/L， 氯化钠3-10g/L， 磷酸二 氢钾1-5g/L， 磷酸氢二钾1-5g/L， 硫酸铵1-5g/L， 甘油10-60g/L， 消泡剂0-1g/L， 搅拌 混匀； b2.用碱液将PH调至7.2-7.8， 高温高压灭菌； c2.将罐温降到35-40， 用将菌液接入种子罐， 罐温35-40， 罐压0.03-0.07Mpa， 培 养时间为5-24h， 得种子液； （3） 发酵培养。
4、 a3.培养基配方为： 六偏磷酸钠2-10g/L、 磷酸二氢钾2-10g/L、 磷酸氢二铵2-10g/ L、 柠檬酸0.1-1g/L、 甘氨酸1-5g/L、 酵母浸粉0-40g/L、 脱脂豆粉10-50g/L、 玉米浆0- 100g/L、 胰蛋白胨0-10g/L、 氯化钙0-5g/L、 消泡剂0.2-0.8g/L、 三氯化铁0.01-0.05g/ L、 硫酸亚铁0.01-0.05g/L、 烟酸0.005-0.02g/L、 维生素B10.005-0.02g/L， 将配好的培 养基加入发酵罐中； b3.用氨水调pH至7.2-7.8， 高温高压灭菌； c3.将罐温降到30-37， 分别加入葡萄糖2-。
5、10g/L， 七水合硫酸镁1-5g/L， 碳酸钙2- 10g/L， 混匀； d3.将种子液接种至发酵罐中， 罐温30-37， 罐压0.03-0.07Mpa， 培养时间为1-5天， 得发酵液。 2.根据权利要求1所述的一种微生物发酵法生产 -胸苷的生产工艺， 其特征在于， 发酵 培养过程中， 培养至2-10h时开始连续向培养基中加适量的葡萄糖溶液， 控制还原糖的含量 在0.1-1%。 3.根据权利要求1所述的一种微生物发酵法生产 -胸苷的生产工艺， 其特征在于， 种子 培养和发酵培养的过程中， 接种方式均采用差压法。 4.根据权利要求1所述的一种微生物发酵法生产 -胸苷的生产工艺， 其特征在于，。
6、 所述 消泡剂为聚醚。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105950689 A 2 一种微生物发酵法生产 -胸苷的生产工艺 技术领域 0001 本发明属于发酵工程技术领域， 特别是涉及一种微生物发酵法生产 -胸苷的生产 工艺。 背景技术 0002 -胸苷全称为 -2 -脱氧胸苷， 是一种天然化合物， 是组成脱氧核糖核酸 （DNA） 这 一生物大分子的四个天然核苷之一。 现在已知核苷及其变形的核苷在癌症化疗和作为抗病 毒化合物方面起着极其重要的作用， 到目前为止国际许可应用的抗病毒的药物， 绝大多数 是核苷衍生物。 -胸苷是抗艾滋病毒药物AZT （叠氮胸苷） 和D4T （司他夫定） 最理想的原。
7、料 药， 也可作为医药中间体， 直接出口， 所以合成 -胸苷具有十分重要的意义和经济价值。 0003 目前， 胸苷的生产主要有化学合成法， DNA酶解法和发酵法。 化学合成法有多种途 径， -胸苷是1935年被人们用化学方法合成出来的， 但是化学合成法存在污染大， 原料不易 得， 收率低等问题。 DNA酶解法是指将DNA酶解后， 分离出四种核苷酸， 但是分离过程极为复 杂， 而且成本较高。 发酵法是利用基因工程重组大肠杆菌， 高效的合成胸苷， 工艺简单， 周期 短， 含量高， 原料易得， 分离简单， 环境污染小。 然而发酵法目前还处在实验室研发阶段， 所 用的原料昂贵， 成本较高， 在国内还没。
8、有形成产业化。 目前我国生产 -胸苷的厂家屈指可 数， 大多采用化学合成法。 发明内容 0004 本发明的目的就在于克服上述不足， 提供一种微生物发酵法生产 -胸苷的生产工 艺。 0005 为达到上述目的， 本发明是按照以下技术方案实施的： 一种微生物发酵法生产 -胸苷的生产工艺， 包括以下步骤， （1） 菌种培养 a1.将细菌接种于盛有培养基的培养皿A中， 于36-37培养22-24h； 将生长成熟的菌 种继续接种于培养皿B中， 于36-37培养12-16h； b1.将培养皿B用生理盐水冲洗， 得菌液， 备用； （2） 种子培养 a2.向种子罐中加入适量的水， 依次加入酵母浸粉5-25g/L。
9、， 氯化钠3-10g/L， 磷酸二 氢钾1-5g/L， 磷酸氢二钾1-5g/L， 硫酸铵1-5g/L， 甘油10-60g/L， 消泡剂0-1g/L， 搅拌 混匀； b2.用碱液将PH调至7.2-7.8， 高温高压灭菌； c2.将罐温降到35-40， 用将菌液接入种子罐， 罐温35-40， 罐压0.03-0.07Mpa， 培 养时间为5-24h， 得种子液； （3） 发酵培养 a3.培养基配方为： 六偏磷酸钠2-10g/L、 磷酸二氢钾2-10g/L、 磷酸氢二铵2-10g/ 说明书 1/4 页 3 CN 105950689 A 3 L、 柠檬酸0.1-1g/L、 甘氨酸1-5g/L、 酵母浸粉。
10、0-40g/L、 脱脂豆粉10-50g/L、 玉米浆0- 100g/L、 胰蛋白胨0-10g/L、 氯化钙0-5g/L、 消泡剂0.2-0.8g/L、 三氯化铁0.01-0.05g/ L、 硫酸亚铁0.01-0.05g/L、 烟酸0.005-0.02g/L、 维生素B10.005-0.02g/L， 将配好的培 养基加入发酵罐中； b3.用氨水调pH至7.2-7.8， 高温高压灭菌； c3.将罐温降到30-37， 分别加入葡萄糖2-10g/L， 七水合硫酸镁1-5g/L， 碳酸钙2- 10g/L， 混匀； d3.将种子液接种至发酵罐中， 罐温30-37， 罐压0.03-0.07Mpa， 培养时间。
11、为1-5天， 得发酵液。 0006 进一步的， 发酵培养过程中， 培养至2-10h时开始连续向培养基中加适量的葡萄糖 溶液， 控制还原糖的含量在0.1-1%。 0007 进一步的， 种子培养和发酵培养的过程中， 接种方式均采用差压法。 0008 进一步的， 所述消泡剂为聚醚。 0009 与现有技术相比， 本发明的有益效果为： 1.通过优化发酵条件， 减少了发酵级数， 缩短了工艺流程； 2.工艺关键控制点由之前的控制溶氧改为控制pH， 使得发酵水平大幅提高， 并且稳定 性较好； 3.发酵生产过程中对配方进行优化， 减少昂贵原料的使用， 成本大幅降低， 解决了发酵 法实验阶段成本高的问题。 001。
12、0 本发明工艺简单， 发酵级数少， 工艺稳定易于控制， 成本较低， 适合工业生产。 具体实施方式 0011 下面结合具体实施例对本发明作进一步描述， 在此发明的示意性实施例以及说明 用来解释本发明， 但并不作为对本发明的限定。 0012 实施例1 一种微生物发酵法生产 -胸苷的生产工艺， 包括以下步骤， （1） 菌种培养 a1.将细菌接种于盛有培养基的培养皿A中， 于37培养22h； 将生长成熟的菌种继续 接种于培养皿B中， 于37培养14h； b1.将培养皿B用生理盐水冲洗， 得菌液， 备用； （2） 种子培养 a2.向种子罐中加入适量的水， 依次加入酵母浸粉15g/L， 氯化钠8g/L， 。
13、磷酸二氢钾3 g/L， 磷酸氢二钾3g/L， 硫酸铵3g/L， 甘油30g/L， 聚醚0.3g/L， 搅拌混匀； b2.用碱液将PH调至7.2， 高温高压灭菌； c2.将罐温降到35， 采用差压法将菌液接入种子罐， 罐温37， 罐压0.03Mpa， 培养时 间为18h， 得种子液； （3） 发酵培养 a3.培养基配方为： 六偏磷酸钠5g/L、 磷酸二氢钾4g/L、 磷酸氢二铵4g/L、 柠檬酸 0.3g/L、 甘氨酸3g/L、 酵母浸粉20g/L、 脱脂豆粉20g/L、 玉米浆50g/L、 胰蛋白胨4g/L、 说明书 2/4 页 4 CN 105950689 A 4 氯化钙2g/L、 聚醚0.。
14、4g/L、 三氯化铁0.02g/L、 硫酸亚铁0.03g/L、 烟酸0.005g/L、 维生 素B10.005g/L， 将配好的培养基加入发酵罐中； b3.用氨水调pH至7.2， 高温高压灭菌； c3.将罐温降到37， 分别加入葡萄糖5g/L， 七水合硫酸镁2g/L， 碳酸钙5g/L， 混 匀； d3.采用差压法将种子液接种至发酵罐中， 罐温37， 罐压0.03Mpa， 培养时间为3天。 发酵培养过程中， 培养至5h时开始连续向培养基中加适量的葡萄糖溶液， 控制还原糖的含 量在0.5%， 得发酵液。 0013 实施例2 一种微生物发酵法生产 -胸苷的生产工艺， 包括以下步骤， （1） 菌种培养。
15、 a1.将细菌接种于盛有培养基的培养皿A中， 于37培养22h； 将生长成熟的菌种继续 接种于培养皿B中， 于37培养16h； b1.将培养皿B用生理盐水冲洗， 得菌液， 备用； （2） 种子培养 a2.向种子罐中加入适量的水， 依次加入酵母浸粉15g/L， 氯化钠8g/L， 磷酸二氢钾5 g/L， 磷酸氢二钾5g/L， 硫酸铵5g/L， 甘油40g/L， 聚醚0.5g/L， 搅拌混匀； b2.用碱液将PH调至7.5， 高温高压灭菌； c2.将罐温降到40， 采用差压法将菌液接入种子罐， 罐温36， 罐压0.05Mpa， 培养 时间为20h， 得种子液； （3） 发酵培养 a3.培养基配方为：。
16、 六偏磷酸钠6g/L、 磷酸二氢钾7g/L、 磷酸氢二铵7g/L、 柠檬酸 0.4g/L、 甘氨酸4g/L、 酵母浸粉20g/L、 脱脂豆粉30g/L、 玉米浆60g/L、 胰蛋白胨4g/L、 氯化钙4g/L、 聚醚0.6g/L、 三氯化铁0.03g/L、 硫酸亚铁0.03g/L、 烟酸0.01g/L、 维生素 B10.01g/L， 将配好的培养基加入发酵罐中； b3.用氨水调pH至7.6， 高温高压灭菌； c3.将罐温降到37， 分别加入葡萄糖8g/L， 七水合硫酸镁2g/L， 碳酸钙5g/L， 混 匀； d3.采用差压法将种子液接种至发酵罐中， 罐温37， 罐压0.05Mpa， 培养时间为。
17、5天。 发酵培养过程中， 培养至5h时开始连续向培养基中加适量的葡萄糖溶液， 控制还原糖的含 量在0.6%， 得发酵液。 0014 实施例3 一种微生物发酵法生产 -胸苷的生产工艺， 包括以下步骤， （1） 菌种培养 a1.将细菌接种于盛有培养基的培养皿A中， 于37培养24h； 将生长成熟的菌种继续 接种于培养皿B中， 于37培养16h； b1.将培养皿B用生理盐水冲洗， 得菌液， 备用； （2） 种子培养 a2.向种子罐中加入适量的水， 依次加入酵母浸粉20g/L， 氯化钠8g/L， 磷酸二氢钾5 说明书 3/4 页 5 CN 105950689 A 5 g/L， 磷酸氢二钾5g/L， 硫。
18、酸铵5g/L， 甘油40g/L， 聚醚0.8g/L， 搅拌混匀； b2.用碱液将PH调至7.8， 高温高压灭菌； c2.将罐温降到37， 采用差压法将菌液接入种子罐， 罐温37， 罐压0.06Mpa， 培养 时间为24h， 得种子液； （3） 发酵培养 a3.培养基配方为： 六偏磷酸钠8g/L、 磷酸二氢钾8g/L、 磷酸氢二铵8g/L、 柠檬酸 0.6g/L、 甘氨酸4g/L、 酵母浸粉30g/L、 脱脂豆粉40g/L、 玉米浆80g/L、 胰蛋白胨6g/L、 氯化钙4g/L、 聚醚0.6g/L、 三氯化铁0.04g/L、 硫酸亚铁0.04g/L、 烟酸0.02g/L、 维生素 B10.02g/L， 将配好的培养基加入发酵罐中； b3.用氨水调pH至7.8， 高温高压灭菌； c3.将罐温降到37， 分别加入葡萄糖8g/L， 七水合硫酸镁4g/L， 碳酸钙8g/L， 混 匀； d3.采用差压法将种子液接种至发酵罐中， 罐温37， 罐压0.07Mpa， 培养时间为5天。 发酵培养过程中， 培养至8h时开始连续向培养基中加适量的葡萄糖溶液， 控制还原糖的含 量在0.8%， 得发酵液。 0015 本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制， 凡是根据本发明的技术方案做 出的技术变形， 均落入本发明的保护范围之内。 说明书 4/4 页 6 CN 105950689 A 6 。