技术领域
本发明涉及一种高效扩增植物组织中内生真菌ITS基因的技术方法，属于生物技术领域。
背景技术
植物内生真菌（Endophytic fungi）是一种特殊的真菌共生体，可定植在根、茎、叶、花、 种子等各种组织器官，但并不引起宿主明显的病症。大量研究已经证实植物组织中蕴含着丰 富的内生真菌类群，是全球真菌多样性的重要组成部分。有专家预测，全球植物内生真菌物 种数量至少有100-130万（Dreyfuss and Chapela,1994;Ganley et al.,2004）。内生真菌同样具有 高度的功能多样性，在维持植物群落结构稳定性、促进凋落物分解、协同植物生长和抗逆等 方面发挥了不可忽视的作用。同时，内生真菌还是活性产物的天然资源宝库。
微生物生态学的重要命题之一是研究特定样品中微生物类群的物种多样性及其环境响 应机制。微生物分离、培养和鉴定是研究微生物多样性的传统方法，也一直沿用至今。然而， 可培养微生物占总微生物的比例可能还不足1%，因此很难反应环境样品中微生物群落结构的 全貌。随着分子生物学和DNA测序技术的快速发展，利用高灵敏的分子手段检测微生物多样 性（环境PCR方法）已经成为微生物生态学研究领域中的一个强有力的工具。如PCR-DGGE （变性梯度凝胶电泳）、Clone library（克隆库构建）和高通量测序（pyrosequencing，如罗氏 454GS FLX和Illumina MiSeq平台等）等技术方法正逐步应用于森林和农田土壤、深海底泥、 人体和动物的肠道、粪便和水体等环境样品进行微生物多样性分析。
植物各种组织器官也是微生物生长繁衍的理想栖息地，然而目前对植物内生菌生物多样 性的广度和深度的认识仍十分有限。主要原因在于上述的分子检测手段都依赖于对特定研究 样品总基因组DNA的提取，制备的DNA样品中含有大量的植物来源的DNA。而在土壤、 底泥和肠道排泄物等样品的总基因DNA中，非微生物源基因组占较少的比例。即，当提取 植物组织总基因组DNA时，其中含有的内生真菌DNA只占极少的比例，而在土壤、底泥和 肠道排泄物等样品的总基因DNA样品中,真菌和其他微生物DNA占的比例就相对高。因此 在使用真菌通用引物从总基因组DNA中扩增真菌源基因产物（通常是用于系统发育分析的 保守基因SSU\LSU\ITS等）的成功率很低，反而能扩增出植物（宿主）源的基因片段，即产 生了非特异性扩增。这将显著影响后期基因序列的质量和分析结果。目前公认真菌的转录间 隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）能有效在种的水平上区分真菌类群，因此是研究真菌 多样性的理想条形码。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能扩增植物组织中内生真菌ITS基因的方法及所用 引物；本发明属于一种利用两组特异性引物高效扩增植物组织中真菌ITS两个片段的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种能扩增植物组织中内生真菌ITS基因的引物，
所述引物包括巢式PCR第一轮扩增引物对和巢式PCR第二轮扩增引物对；
所述巢式PCR第一轮扩增引物对为：
正向引物NSA3：5′-AAACTCTGTCGTGCTGGGGATA-3′，
反向引物NLC2：5′-GAGCTGCATTCCCAAACAACTC-3′；
所述巢式PCR第二轮扩增引物对为以下任一引物对：
①、
正向引物ITS1-F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，
反向引物ITS2：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′；
②、
正向引物ITS1-F_KYO2：5′-TAGAGGAAGTAAAAGTCGTAA-3′，
反向引物ITS2_KYO2：5′-TTYRCTRCGTTCTTCATC-3′；
③、
正向引物fITS7：5′-GTGARTCATCGAATCTTTG-3′，
反向引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；
④、
正向引物ITS3_KYO2：5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′，
反向引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。
本发明还同时提供了利用上述引物进行的扩增植物组织中内生真菌ITS基因的方法，包 括植物组织基因组的提取，将提取所得的模板DNA依次进行以下步骤：
PCR扩增：
包括巢式PCR第一轮扩增和巢式PCR第二轮扩增；
1）、所述巢式PCR第一轮扩增的反应体系为：
所述正向引物为NSA3，所述反向引物为NLC2；
PCR扩增反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火40s，72℃延伸50s， 30次循环；最后72℃延伸10min；
2）、所述巢式PCR第二轮扩增的反应体系为：
所述正向引物为ITS1-F、ITS1-F_KYO2、fITS7、ITS3_KYO2中的任意一个，所述对应 的反向引物为ITS2、ITS2_KYO2、ITS4、ITS4；其余同巢式PCR第一轮扩增的反应体系；
PCR扩增反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸50s， 30次循环；最后72℃延伸10min。
即，上述2个PCR扩增反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，53℃退火（其中 NSA3-NLC2引物的退火温度为58℃）40s，72℃延伸50s，30次循环；最后72℃延伸10min。
本发明针对现有技术的瓶颈，从现有的真菌ITS保守区通用引物种筛选获得了能高效扩 增植物组织中两个ITS基因片段（ITS1和ITS2）的引物组合，并给出了相应的试验参数和 PCR反应条件。
本发明最大的用途和创新在于：利用两轮巢式PCR可以特异性扩增植物组织中真菌的 ITS基因，从而对真菌种类进行鉴定并分析物种多样性；如果只用一轮PCR，则扩增出的片 段绝大多数都是植物来源的ITS序列，原因在于基因组DNA样品中植物源的DNA干扰了真 菌ITS基因的扩增效率。
本发明优点在于：本发明以两组真菌特异性ITS转录间隔区引物进行两轮巢式PCR扩增， 最终高效扩增出植物根系和叶片组织中内生真菌的ITS1和ITS2片段，解决了目前植物内生 真菌（环境样品）高通量测序中遇到的显著的非特异性扩增（植物源ITS）这一技术瓶颈和 难题，是利用高通量测序技术研究环境样品真菌多样性研究中的一个重要创新。采用该方法 可以高质量获得植物组织中真菌的ITS基因片段，为准确解析植物内生真菌生物多样性打下 基础。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为扩增真菌核糖体转录间隔区（ITS）常用引物及位点；为根据Ihrmark et al.,2012; Toju et al.,2012修改而得。
图2是利用ITS1-F-ITS2和fITS7-ITS4两组引物直接扩增根系（R）、叶片（L）、根际土壤 （RS）和非根际土壤DNA样品（BS）所得结果图。M：DNA Marker（核酸分子标记）。
图3是利用NSA3-NLC2引物进行巢式PCR的第一轮扩增所得结果图。M:DNA Marker （核酸分子标记）。
图4是以第一轮扩增的PCR产物为模板，利用ITS1-F-ITS2、ITS1-F_KYO2-ITS2_KYO2、 ITS3_KYO2-ITS4和fITS7-ITS4等四组引物进行巢式PCR的第二轮扩增所得结果图。
L3-2代表叶片基因组DNA的第二次重复扩增；
L3-1代表叶片基因组DNA样品的第一次扩增；
R3-2代表根系基因组DNA的第二次重复扩增；
R3-1代表根系基因组DNA样品的第一次扩增；
M:DNA Marker（核酸分子标记）。
备注说明：
右侧代表ITS1片段，左侧代表ITS2片段。由于ITS1-F-ITS2；ITS1-F_KYO2-ITS2_KYO2 两组引物的结合位点（位置）非常接近，因此扩增出的片段大小也差不多；而fITS7的引物结 合位点与ITS3_KYO2位置相差50个bp左右，因此片段长度略有差异。
图5是利用ITS1-F-ITS2和fITS7-ITS4两组引物直接扩增根系、叶片DNA的PCR产物克隆 序列的BLAST结果。
图6是经过两轮巢式PCR后，扩增产物克隆序列的BLAST结果。
具体实施方式
为实现本发明目的，采取以下技术方案：
实施例1、
一、植物组织基因组的提取的方法：
使用QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit试剂盒并做一些微调。具体步骤如下：
1、将盐生植物-盐地碱蓬（Suaeda salsa）的叶片（样品编号：L3）20mg或根系（样品编 号：R3）20mg放入研钵中进行液氮冷却研磨至粉末状。分别进行如下操作：
2、加入400μl BufferAP1和4μl RNaseA。混合均匀后放入65℃水浴40分钟，期间轻微 颠倒混匀3次。（在用之前不要将BufferAP1和RNaseA混合）。
3、加入130μl BufferP3，混匀后冰上放置5分钟；得裂解液。
4、将裂解液在20000g（14000rpm）下离心5分钟。
5、吸取上清液至QIAshredder离心柱，置入新的2ml离心管中，20000g离心2分钟后过 滤。
6、将滤液转移至新的离心管中，加入1.5倍的Buffer AW1，立即吹打混匀。
7、吸取650μl混合液至DNeasy微离心柱，置入新的2ml离心管中，≥6000g（≥8000 rpm）离心1分钟，弃滤液。
8、把DNeasy微离心柱放到一个新的2ml离心管中，加500ul Buffer AW2，≥6000g离 心1分钟，弃滤液。
9、再加500μl BufferAW2，20000g离心2分钟。
10、小心从离心管中取出离心吸附柱（不要让离心吸附柱底端接触到下面的滤液）转移至 一个新的1.5ml或者2ml的离心管中。
11、加100ulBufferAE，室温（15-25℃）下放置5分钟，≥6000g离心1分钟。
12、将得到的溶液（即步骤11离心所得的滤液）重新加入DNeasy微离心柱中，室温放 置2分钟，≥6000g离心1分钟。
13、DNA样品（即，步骤12离心所得的滤液）浓度测定：使用Quawell Q5000超微量核 酸蛋白测定仪。测得的浓度为：R3=10.5ng/μl；L3=12.6ng/μl。
14、DNA样品保存在-20℃备用。
备注说明：
以下实验中，以根际土壤DNA（RS，浓度为30.2ng/μl）和非根际土壤DNA（SS，浓 度为7.8ng/μl）为阳性对照。
二、PCR体系及反应条件：
按下列组份配制PCR反应液（50μl体系）；
备注说明：上述体系中，除了正向引物、反向引物、模板DNA外，其余均可购自宝生 物工程（大连）有限公司。
巢式PCR以第一轮PCR扩增产物为模板，即，第二轮以第一轮的扩增产物为模板。
PCR扩增反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，53℃退火（其中NSA3-NLC2 引物的退火温度为58℃）40s，72℃延伸50s，30次循环；最后72℃延伸10min。在MyCycler PCR扩增仪（Bio-Rad公司）上进行。
备注说明：除了NSA3-NLC2引物外，其余无论是以下所述的方法一（一轮PCR直接扩 增）、还是方法二（两轮巢式PCR扩增）中，均为53℃。
本发明中涉及到的引物名称及序列如下（具体位点信息见图1）：
ITS1-F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）
ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）
NSA3（5′-AAACTCTGTCGTGCTGGGGATA-3′）
NLC2（5′-GAGCTGCATTCCCAAACAACTC-3′）
fITS7（5′-GTGARTCATCGAATCTTTG-3′）
ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）
NSI1（5′-GATTGAATGGCTTAGTGAGG-3′）
NLB4（5′-GGATTCTCACCCTCTATGAC-3′）
ITS1-F_KYO2（5′-TAGAGGAAGTAAAAGTCGTAA-3′）
ITS2_KYO2（5′-TTYRCTRCGTTCTTCATC-3′）
ITS3_KYO2（5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′）
具体如下：
其中NSA3-NLC2和NSI1-NLB4扩增产物包括了18S小亚基（SSU部分片段） -ITS1-5.8S-ITS2-28S大亚基（LSU部分片段）；ITS1F-ITS2和ITS1-F_KYO2-ITS2_KYO2扩 增产物为ITS1区域；fITS7-ITS4和ITS3_KYO2-ITS4扩增产物为ITS2区域（详见图1）。
试验设计按照以下两个方法进行：
（一）、一轮PCR直接扩增
ITS1片段扩增引物组合（共2组）：ITS1-F-ITS2；ITS1-F_KYO2-ITS2_KYO2。ITS2片 段扩增引物组合（共2组）：fITS7-ITS4；ITS3_KYO2-ITS4。
（二）、两轮巢式PCR扩增
第一轮巢式PCR引物组合（共2组）：NSA3-NLC2；NSI1-NLB4。第二轮巢式PCR引物组 合同上；即：
ITS1片段扩增引物组合（共2组）：ITS1-F-ITS2；ITS1-F_KYO2-ITS2_KYO2。ITS2片段扩 增引物组合（共2组）：fITS7-ITS4；ITS3_KYO2-ITS4。
三、PCR产物的纯化（用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化）：
1、在紫灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算 凝胶重量（提前记录1.5ml离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100mg=100ul体积）。
2、加入3个（本发明中使用300μl）凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75℃加热， 间断混合（每2-3min），直至凝胶块完全熔化（约6-3min）。
注：BufferDE-A为红色液体。在熔化凝胶过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。
3、加0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B（即，加入150μl的BufferDE-B），混合均匀。 当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。注：加BufferDE-B后 混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。
备注说明：根据引物设计位点，NSA3-NLC2扩增产物片段大小为950bp，NSI1-NLB4 的扩增产物片段约800bp，其他的引物的扩增产物大小为200-250bp。
4、吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（原始状态时，该DNA制备管被置于 2ml（试剂盒内提供）离心管）中，12000g离心1min。弃滤液。
5、将制备管置回2ml离心管，加500μl的Buffer W1，12000g离心30s，弃滤液。
6、将制备管置回2ml离心管，加700μl的Buffer W2，12000g离心30s，弃滤液。以同 样的方法再加700μl的Buffer W2洗涤一次，12000g离心1min。
注：（1）确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
（2）两次使用Buffer W2冲洗能确保盐分被完全清除，消除对后续实验的影响。
7、将制备管置回2ml离心管中，12000g离心1min。
8、将DNA制备管置于洁净的1.5ml离心管（试剂盒内提供）中，在DNA制备管的过滤 膜中央加25-30ul的Eluent或去离子水，室温静置1min。12000g离心1min（收集过滤液， 滤液中含的就是PCR的扩增产物）。洗脱DNA。
将纯化好的PCR产物连接到pGEM-T Easy载体（Promega公司），然后将连接产物转化 到感受态细胞Escherichia coli JM109（Promega公司），具体步骤根据操作手册进行。将感受 态细胞涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的（ampicillin）LB平板上（预先滴加40μl3%X-gal 和7μl20%IPTG）进行蓝白斑筛选获得阳性克隆。菌落呈现白色的即为阳性克隆。
上述含有50μg/ml氨苄青霉素的（ampicillin）LB平板上（预先滴加40μl3%X-gal和 7μl20%IPTG）的制备方法为：
LB固体培养基经121℃高压灭菌15分钟，待其冷却至60℃左右时，加入氨苄青霉素，直 至氨苄青霉素的终浓度为50μg/ml，制备LB平板。随后在平板上加入40μl质量浓度为3%的 X-gal溶液和7μl质量浓度为20%的IPTG溶液。
X-gal，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷；IPTG，异丙基硫代半乳糖苷。
阳性克隆再经“菌液PCR”进行鉴定（colony PCR）：挑取白色克隆，LB液体培养过夜 （培养温度为37℃，培养时间为12h），吸取1μl菌液作为DNA模板进行验证，PCR体系为 25μl（具体如下），反应条件同上，设置25个循环。最后每个样品挑取6-16个阳性克隆（菌 液）送上海生工测序，测序引物为M13F（M13F：TGT AAA ACG ACG GCC AGT）。LB液 体培养基配方（1L）：胰蛋白胨10g+酵母粉5g+NaCl10g。
PCR体系
正向引物为：ITS1-F、ITS1-F_KYO2、fITS7、ITS3_KYO2；反向引物为：ITS2、ITS2_KYO2、 ITS4。
PCR扩增反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸50s， 30次循环；最后72℃延伸10min。在MyCycler PCR扩增仪（Bio-Rad公司）上进行。
备注说明：此PCR反应是为了验证感受态细胞Escherichia coli JM109中的pGEM-T Easy 载体上是否已经连接有纯化好的PCR产物。因为有的时候菌落呈现白色也可能是假阳性。
原始序列用VecScreen（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html）程序 去除克隆序列中的部分T载体序列，利用BLASTN2.2.28+程序 （http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）观察分析与每个克隆序列匹配的记录。
四、结果分析
相对于方法一而言：以四组真菌ITS基因引物ITS1-F-ITS2、ITS1-F_KYO2-ITS2_KYO2、 fITS7-ITS4、ITS3_KYO2-ITS4直接扩增R3、L3、BS和SS等环境样品基因组DNA时， ITS1-F-ITS2和fITS7-ITS4两组引物能扩增出较亮条带（图2），而ITS1-F_KYO2-ITS2_KYO2 和ITS3_KYO2-ITS4两组引物不能有效扩增出目的条带。因此，只将ITS1-F-ITS2和fITS7-ITS4 扩增的产物进行割胶纯化和回收，将产物连接pGEM-T Easy载体后，转化感受态细胞，每个 扩增产物选择6-16个经PCR验证的阳性克隆送公司测序，对序列进行验证。对所有序列进 行BLAST搜索，发现ITS1-F-ITS2和fITS7-ITS4的扩增产物均为植物来源的ITS基因（图5）， 如碱蓬Suaeda iranshahrii等，没有任何序列的匹配记录为真菌ITS序列。
结果表明用以上两组引物直接扩增植物基因组DNA发生了明显的非特异性扩增，也说 明了植物源基因组DNA对PCR反应产生了严重影响。
因此，为解决上述问题（即，为了解决植物内生真菌ITS基因分子检测中直接PCR带来 的非特异性扩增问题），本发明利用NSA3-NLC2和NSI1-NLB4两组引物进行巢式PCR的 第一轮扩增，基因片段能覆盖整个真菌ITS转录间隔区；随后以该基因片段为模板进行第二 轮PCR扩增，引物仍然使用ITS1-F-ITS2、ITS1-F_KYO2-ITS2_KYO2、fITS7-ITS4、 ITS3_KYO2-ITS4。结果显示，NSA3-NLC2能有效扩增出目的产物（片段长度约950bp）， 而NSI1-NLB4引物扩增的效果较差，无明显条带（见图3）。将NSA3-NLC2扩增所得条带 割胶后纯化，作为第二轮PCR的模板DNA。结果表明使用ITS1-F-ITS2、ITS1-F_KYO2- ITS2_KYO2、fITS7-ITS4、ITS3_KYO2-ITS4等4组引物组合都能扩增出单一的亮条带（图4）。 同上，对目的产物进行验证。BALST搜索的结果显示随机挑取的共28个克隆序列（每种扩 增产物至少6个克隆）在GenBank数据库中匹配的记录全部是真菌ITS1或ITS2片段（图6）， 如管释单孢囊菌（Monosporascus cannonballus）和未培养根系真菌克隆（Uncultured root associated fungus clone）等。
以上结果可以看出，经过两轮巢式PCR，能特异性地高效扩增真菌ITS基因；NSA3-NLC2 引物组合能有效区分真菌源和植物源的ITS基因，说明该引物具有极高的真菌特异性。本发 明中的研究结果充分说明利用巢式PCR技术及以上的引物组合，可以特异性地高效扩增植物 组织中真菌ITS基因，为今后高通量测序技术成功应用于植物内生真菌生物多样性及生态学 研究奠定基础。
实施例2、将实施例1中的待测组织由“盐生植物-盐地碱蓬（Suaeda salsa）的叶片（样 品编号：L3）和根系（样品编号：R3）”更改成油桐（Vernicia fordii）的种仁组织，并仅仅 选用实施例1中所述的两轮巢式PCR扩增，其余等同于实施例1。
最终所得的结果为：NSA3-NLC2引物能扩增出大小为950bp左右的产物；经第二轮巢 式PCR（ITS1-F-ITS2、ITS1-F_KYO2-ITS2_KYO2、fITS7-ITS4、ITS3_KYO2-ITS4等4组引 物），获得的目的产物大小为200-250bp，随后进行克隆测序。结果表明挑取的共12个克隆序 列在GenBank数据库中匹配的记录全部是真菌ITS1或ITS2片段。如镰刀菌（Fusarium sp.） 和短梗霉（Aureobasidium sp.）等。
实施例3、
将实施例1中的待测组织由“盐生植物-盐地碱蓬（Suaeda salsa）的叶片（样品编号： L3）和根系（样品编号：R3）”更改成马尾松（Pinus massoniana）针叶组织，并仅仅选用实 施例1中所述的两轮巢式PCR扩增，其余等同于实施例1。
最终所得的结果为：NSA3-NLC2引物能扩增出大小为950bp左右的产物；经第二轮巢 式PCR（ITS1-F-ITS2、ITS1-F_KYO2-ITS2_KYO2、fITS7-ITS4、ITS3_KYO2-ITS4等4组引 物），获得的目的产物大小为200-250bp，随后进行克隆测序。结果表明挑取的共8个克隆序 列在GenBank数据库中匹配的记录全部是真菌ITS1或ITS2片段。如散斑壳菌（Lophodermiumn conigenum）等。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。如对于任何植物组织中（根、茎、叶、花、果实等） 真菌种类的检测都可以使用本发明中的方法。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
<110> 中国林业科学研究院亚热带林业研究所
<120> 扩增植物组织中内生真菌ITS基因的方法及所用引物
<160> 10
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物NSA3
<400> 1
aaactctgtc gtgctgggga ta 22
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 反向引物NLC2
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gagctgcatt cccaaacaac tc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物ITS1-F
<400> 3
cttggtcatt tagaggaagt aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物ITS2
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gctgcgttct tcatcgatgc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 正向引物ITS1-F_KYO2
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tagaggaagt aaaagtcgta a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 反向引物ITS2_KYO2
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ttyrctrcgt tcttcatc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 正向引物fITS7
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gtgartcatc gaatctttg 19
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 反向引物ITS4
<400> 8
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<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 正向引物ITS3_KYO2
<400> 9
gatgaagaac gyagyraa 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 反向引物ITS4
<400> 10
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