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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410105675.2 (22)申请日 2014.03.20 201310091096.2 2013.03.21 CN C12N 9/16(2006.01) A23K 20/189(2016.01) A23K 50/75(2016.01) (73)专利权人 成都国锦生物科技有限公司 地址 610041 四川省成都市高新技术开发区 石羊工业园成都国锦生物科技有限公 司 (72)发明人 彭应基 王军 (74)专利代理机构 成都希盛知识产权代理有限 公司 51226 代理人 柯海军 武森涛 (54) 发明名称 耐高温植酸酶及其用途 (57。
2、) 摘要 本发明涉及耐高温植酸酶及其用途， 属于生 物技术领域。本发明所要解决的技术问题是提供 一种耐高温植酸酶。本发明耐高温植酸酶的氨基 酸序列如 seq ID NO1 所示。本发明耐高温植酸 酶酶活力达到5062FTU/g， 90保温30min酶活力 仍然具有 4708FTU/g， 酶高温耐受性良好， 同时水 分含量仅为 1.62%， 重金属铝和砷分别为 0.63mg/ kg 和 0.47mg/kg， 以上指标均达到或超过目前国 际先进产品标准。本发明耐高温植酸酶经养鸡场 试用， 效果稳定， 良好。本发明为饲料领域提供了 一种新的有机饲料添加剂， 具有广阔的应用前景。 (66)本国优先权数。
3、据 (51)Int.Cl. 审查员 李艳丽 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书12页 序列表5页 附图7页 CN 103849607 B 2016.04.20 CN 103849607 B 1/1 页 2 1.耐高温植酸酶， 其特征在于 ： 所述耐高温植酸酶的氨基酸序列如 SEQ ID NO1 所示。 2.权利要求 1 所述的耐高温植酸酶用作饲料添加剂的用途。 3.含有权利要求 1 所述的植酸酶的饲料。 权 利 要 求 书 CN 103849607 B 2 1/12 页 3 耐高温植酸酶及其用途 技术领域 0001 本发明涉及耐高温植酸酶及其用途， 。
4、属于生物技术领域。 背景技术 0002 磷是动物必需的一种常量矿物元素， 磷的添加对配合饲料生产成本及产品质量有 重要影响。作为猪、 禽饲料主要来源的玉米、 豆饼粕、 谷糠、 棉籽饼粕等， 它们所含的磷约 40-70% 以植酸磷的形式存在。而猪、 禽等单胃动物， 由于消化道内缺乏能分解消化植酸磷 的微生物， 仅能利用玉米种磷的 10-20%、 豆饼中磷的 25-35%， 典型猪日粮中磷的利用率只 有 15%， 其余 85% 左右的磷从粪便中排出。因此， 一方面为满足猪禽生长对磷的需要， 必须 在饲料中添加足够的无机磷酸盐， 这样就增加了饲料成本 ； 另一方面， 粪便中排出的大量的 磷又造成了对。
5、土壤和水源的污染。 磷存在于土壤便面， 不仅能在土壤中渗透和扩散， 还会与 铜、 铝、 钙等元素形成不溶性复合物而保留在土壤中。如果土壤中磷大量积聚并溢出， 将随 着土壤的侵蚀流动， 造成自然界水体的污染。一些国家从环保的角度对集约化畜牧场已提 出了限制排磷的要求。荷兰于 1998 年通过了 MINAS （一种新的矿物元素结账系统） 的立法， 其中严格限制了动物粪便中磷酸盐的排放量。此外， 植酸盐通过螯合作用还可降低动物对 锌、 锰、 铁、 钙、 钾等主要微量元素的利用率， 通过与蛋白质结合成植酸复合体而降低动物对 蛋白质的消化吸收率， 从而使整个饲料的利用率降低。 0003 随着人们对绿色食。
6、品消费需求的增加和对畜牧业生产与过程中生态环境保护 的重视， 饲用酶制剂以其高效、 安全、 低成本等特点， 已成为世界新型饲料添加剂研究和 应用的热点。植酸酶 （Phytase）即肌醇六磷酸水解酶 （Myo-inositol hexaphosphate phosphohydrotase） , 是催化植酸 （即肌醇六磷酸） 及植酸盐水解成肌醇与磷酸 （或磷酸盐） 的一类酶的总称。大量研究表明， 在猪、 禽日粮中添加植酸酶， 可使饲料中磷的利用率提高 40-60%， 粪便中磷的排出量减少 30-50% 左右。目前全世界已公认， 要提高饲料中植酸磷的 利用率， 减少猪、 禽粪便中植酸磷对环境的污染，。
7、 降低植酸磷对其它微量元素及蛋白质利用 率的影响， 应用植酸酶是一种有效的方法。其中来源于无花果酶 （A.ficuum） 的植酸酶 PhyA 因其具备良好特性被认为是目前最有效的饲料用植酸酶。 0004 作为用于饲料工业的酶制剂， 由于饲料制粒工艺和动物生理生化的要求， 真正得 到推广利用的植酸酶必须是具有良好热稳定性， 同时又必须在动物正常体温下具有较高的 酶活性。如何解决使其耐短暂制粒高温、 又能在动物正常体温下具有高酶活性这一对矛盾 是目前包括植酸酶在内的所有饲用酶制剂均需解决的问题。此外， 植酸酶催化的反应 pH 也 必须与动物消化道相适应。不同的动物消化道的 pH 值不同， 即使是一。
8、种动物在消化道的不 同部位 pH 值也不同， 一般的 pH 值胃为 1.5-3.5， 小肠为 5-7、 大肠为 7 左右， 因此要求饲用 酶对 pH 值有较大的适应范围。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种耐高温植酸酶。 说 明 书 CN 103849607 B 3 2/12 页 4 0006 本发明耐高温植酸酶的氨基酸序列如 seq ID NO1 所示。 0007 其中， 本发明还提供了所述的耐高温植酸酶用作饲料添加剂的用途。 0008 另外， 本发明还提供了含有上述植酸酶的饲料。 0009 本发明植酸酶通过下述方法制备得到 ： 0010 1、 采用 3D 构建结合软件 。
9、（Biosist 和哥伦比亚大学自编的软件结合 http:/www. sbg.bio.ic.ac.uk/servers/3dpssm/） 预测， 选择定点突变的氨基酸。采用软件预测技术， 预测非保守区选择氨基酸的突变造成酶本身 Tm 值的变化， 选择 Tm 值增大的氨基酸变化进 行定点突变。通过对无花果曲霉 （Aspergillus ficuum） 植酸酶 （EC3.1.3.26） 非保守活性 位点 （1-33 ； 361-441） 进行系列定点突变， 通过软件重建 （Biosist 和哥伦比亚大学的软件） 发现 27 位氨基酸发生突变对 Tm 值影响最大， 但对活性中心空间结构改变不明显。利。
10、用软 件进行 3D 重建植酸酶解折叠温度， 结果表明 27 位氨基酸由 Gln 突变为 Gly 后， 其 Tm 值由 72.5增加到 83.3， 且相对酶活力基本不变。 0011 2、 设计一对含预定突变的完全互补的寡核苷酸引物， 突变碱基位于引物中央， 两 侧为 10 15 个正确的碱基 ； 引物长度 25 45 个碱基， GC 含量大于 40%， 3 末端应为碱 基 G 或 C， Tm 值不低于 78。Stratagene 公司给予上述原则开发出了在线的突变引物设计 软件， 与 QuikChangeTMSite Directed Mutagenesis Kit 配合使用。 0012 突变选。
11、择正确的突变质粒， 电击转化进行重组酵母的平板筛选。电击培养在 MD 平板上的转化子 ,3d 后可观察到直径约为 2mm 的乳白色菌落。培养到第 5d 后， 将所有的 单菌落分别点种到 MM 平板和 MD 平板， 并设阳性对照 GS115Albumin(His+Muts) 和阴性对照 GS115-gal(His+Mut+),30培养2d或更长时间， 筛选出在MD上生长正常， 在MM上生长缓 慢或不生长的菌落， 为阳性菌落。通过平板筛选的阳性转化子用 YPD 液体培养基摇瓶培养 16-20h， 取 200l 细胞悬液， 收集细胞， 用灭菌蒸馏水等体积洗涤 2 次后， 重悬与 200l 去 离子水。
12、， 取 1l 细胞悬液于总体积为 50l 的 PCR 反应体系中， 并以相应表达片段的 PCR 产物作对照。PCR 呈阳性结果的转化子进行表达研究。 0013 将经平板筛选和 PCR 检测后的重组酵母接种于 10ml 的 BMGY 中， 36培养 16h(OD600=10 20)， 按 5% 的接种量接种于 200ml 的 BMGY 中。培养 20h 后， 室温静置 4h， 倾去培养液， 加入 200ml 的 BMMY （2% 甲醇诱导） 。胞内表达重组酵母 30继续诱导培养 4d， 收获细胞。分泌表达的重组酵母 30继续诱导培养 48h， 收获培养液上清。通过酶活测定， 酶活最高为 243F。
13、TU/ml， 选取最高酶活的重组酵母进行培养， 收集、 分离， 得到植酸酶粗酶。 0014 3、 植酸酶粗酶纯化， 纯化采用浓缩、 喷雾干燥， 喷雾条件为 ： 进风温度为 90， 出 风温度为 60， 吹风压力为 0.2Mpa， 收集得到植酸酶粉。 0015 植酸酶粉测定酶活后， 按照 5100FTU/g 的配比加入制粒保护剂， 进入流化床造粒， 最终得到植酸酶颗粒。 0016 本发明耐高温植酸酶在温度 50以下时， 植酸酶活性比较稳定 ； 本发明植酸酶样 品在造粒加工前后的酶活损失率 5%。加工后的酶稳定性增加， 90， 30 分钟后， 酶活回收 率还可达到 95% 以上。加工后的酶样在常温。
14、下保存， 其活性损失比未加工样品低 90% 以上。 颗粒剂保存期在室温下可达到 1 年。同时该酶 pH 稳定性范围变宽 （1.5-7.0） 。 0017 本发明耐高温植酸酶经四川省农科院分析测试中心检测， 酶活力达到 5062FTU/g， 90保温30min酶活力仍然具有4708FTU/g， 酶高温耐受性良好， 同时水分含量仅为1.62%， 说 明 书 CN 103849607 B 4 3/12 页 5 重金属铝和砷分别为 0.63mg/kg 和 0.47mg/kg， 以上指标均达到或超过目前国际先进产品 标准。本发明耐高温植酸酶经养鸡场试用， 效果稳定， 良好。本发明为饲料领域提供了一种 新。
15、的有机饲料添加剂， 具有广阔的应用前景。 附图说明 0018 图 1 ： 纯化与后加工工艺流程图 ； 0019 图 2 ： 植酸酶 SDS-PAGE 电泳图 ； 0020 图 3 ： 温度 - 酶活曲线图 ； 0021 图 4 ： 温度 - 相对酶活曲线图 ； 0022 图 5 ： pH酶活性曲线图 ； 0023 图 6 ： 酸碱稳定性曲线图 ； 0024 图 7 ： pH 值对菌体生长和酶活的影响曲线图 ； 0025 图 8 ： 温度对菌体生长和酶活的影响曲线图 ； 0026 图 9 ： 通气条件对菌体生物量和酶活的影响曲线图 ； 0027 图 10 ： 接种量对产酶的影响曲线图 ； 002。
16、8 图 11 ： 产酶曲线图 ； 0029 图 12 ： 混合均匀度实验曲线图。 具体实施方式 0030 本发明耐高温植酸酶的氨基酸序列如 seq ID NO1 所示。 0031 其中， 本发明还提供了所述的耐高温植酸酶用作饲料添加剂的用途。 0032 另外， 本发明还提供了含有上述植酸酶的饲料。 0033 本发明植酸酶通过下述方法制备得到 ： 0034 1、 采用 3D 构建结合软件 （Biosist 和哥伦比亚大学自编的软件结合 http:/www. sbg.bio.ic.ac.uk/servers/3dpssm/） 预测， 选择定点突变的氨基酸。采用软件预测技术， 预测非保守区选择氨基酸。
17、的突变造成酶本身 Tm 值的变化， 选择 Tm 值增大的氨基酸变化进 行定点突变。通过对无花果曲霉 （Aspergillus ficuum） 植酸酶 （EC3.1.3.26） 非保守活性 位点 （1-33 ； 361-441） 进行系列定点突变， 通过软件重建 （Biosist 和哥伦比亚大学的软件） 发现 27 位氨基酸发生突变对 Tm 值影响最大， 但对活性中心空间结构改变不明显。利用软 件进行 3D 重建植酸酶解折叠温度， 结果表明 27 位氨基酸由 Gln 突变为 Gly 后， 其 Tm 值由 72.5增加到 83.3， 且相对酶活力基本不变。 0035 2、 设计一对含预定突变的完全。
18、互补的寡核苷酸引物， 突变碱基位于引物中央， 两 侧为 10 15 个正确的碱基 ； 引物长度 25 45 个碱基， GC 含量大于 40%， 3 末端应为碱 基 G 或 C， Tm 值不低于 78。Stratagene 公司给予上述原则开发出了在线的突变引物设计 软件， 与 QuikChangeTMSite Directed Mutagenesis Kit 配合使用。 0036 突变选择正确的突变质粒， 电击转化进行重组酵母的平板筛选。电击培养在 MD 平板上的转化子 ,3d 后可观察到直径约为 2mm 的乳白色菌落。培养到第 5d 后， 将所有的 单菌落分别点种到 MM 平板和 MD 平板。
19、， 并设阳性对照 GS115Albumin(His+Muts) 和阴性对照 GS115-gal(His+Mut+),30培养2d或更长时间， 筛选出在MD上生长正常， 在MM上生长缓 说 明 书 CN 103849607 B 5 4/12 页 6 慢或不生长的菌落， 为阳性菌落。通过平板筛选的阳性转化子用 YPD 液体培养基摇瓶培养 16-20h， 取 200l 细胞悬液， 收集细胞， 用灭菌蒸馏水等体积洗涤 2 次后， 重悬与 200l 去 离子水， 取 1l 细胞悬液于总体积为 50l 的 PCR 反应体系中， 并以相应表达片段的 PCR 产物作对照。PCR 呈阳性结果的转化子进行表达研究。
20、。 0037 将经平板筛选和 PCR 检测后的重组酵母接种于 10ml 的 BMGY 中， 36培养 16h(OD600=10 20)， 按 5% 的接种量接种于 200ml 的 BMGY 中。培养 20h 后， 室温静置 4h， 倾去培养液， 加入 200ml 的 BMMY （2% 甲醇诱导） 。胞内表达重组酵母 30继续诱导培养 4d， 收获细胞。分泌表达的重组酵母 30继续诱导培养 48h， 收获培养液上清。通过酶活测定， 酶活最高为 243FTU/ml， 选取最高酶活的重组酵母进行培养， 收集、 分离， 得到植酸酶粗酶。 0038 3、 植酸酶粗酶纯化， 纯化采用浓缩、 喷雾干燥， 喷。
21、雾条件为 ： 进风温度为 90， 出 风温度为 60， 吹风压力为 0.2Mpa， 收集得到植酸酶粉。 0039 植酸酶粉测定酶活后， 按照 5100FTU/g 的配比加入制粒保护剂， 进入流化床造粒， 最终得到植酸酶颗粒。 0040 本发明耐高温植酸酶在温度 50以下时， 植酸酶活性比较稳定 ； 本发明植酸酶样 品在造粒加工前后的酶活损失率 5%。加工后的酶稳定性增加， 90， 30 分钟后， 酶活回收 率还可达到 95% 以上。加工后的酶样在常温下保存， 其活性损失比未加工样品低 90% 以上。 颗粒剂保存期在室温下可达到 1 年。同时该酶 pH 稳定性范围变宽 （1.5-7.0） 。 0。
22、041 下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述， 并不因此将本发明限 制在所述的实施例范围之中。 0042 实施例 1 0043 1、 材料与方法 0044 1.1 所用质粒和菌株如表 1 所示。 0045 表 1 0046 0047 1.2 主要试剂 ： 0048 The quickchangeTM kit(Invitrogen) ； 限制性内切酶 （EcoRV、 EcoRI、 BamH I、 SnaB I、 Not I、 Bgl II） /T4DNA 连接酶 /dNTP 购自宝生物工程 （大连） 有限公司， Taq plus DNA 聚合酶购自上海生物工程有限公司， DNA 纯。
23、化试剂盒购自华舜生物公司， 氨苄青霉素 / 卡拉霉素为进口分装 ； IPTG/X-gal 购自北京赛百生物工程有限公司 ； 植酸钠购自美国 Sigma 公司 ； DEAE-Sepharose FF、 Sephacrayl S-200 为 GE 产品 ； 其余试剂为国产分析纯。 0049 1.3 培养基 ： 说 明 书 CN 103849607 B 6 5/12 页 7 0050 LB 培养基 ： 胰蛋白胨 1%， 酵母提取物 0.5%， NaCl1%,pH7.0。 0051 YPD 培养基 ： 1% 酵母提取物， 2% 蛋白胨， 2% 葡萄糖。 0052 MD 平板 ： 1.34%YNB， 4。
24、10-5% 生物素， 2% 葡萄糖， 1.5% 琼脂粉。 0053 MM 培养基 ： 1.34%YNB， 410-5% 生物素， 0.5% 甲醇， 1.5% 琼脂粉。 0054 BMGY ： 1% 酵母提取物， 2% 蛋白胨， 1.34%YNB， 410-5% 生物素， 1% 甘油。 0055 BMMY ： 用 2% 甲醇代替 BMGY 中的甘油。 0056 麦芽汁半合成培养基 ： 麦芽浸提取液加蛋白胨及缓冲液等。 0057 1.4 植酸酶活性的测定方法 0058 按照 Mikio Shimizu（1992） 的方法测定植酸酶活性。试验组 250l 酶液加 1ml 底物溶液， 37水浴 30m。
25、in 后， 加 1.25ml 终止液终止酶反应 ； 对照组 250l 酶液加 1.25ml 终止液终止酶反应， 37水浴 30min 后， 加 1ml 底物溶液。试验组和对照组均加入 2.5ml 显 色液， 生成的磷钼酸盐在 700nm 下测定 OD 值。以不同浓度磷酸盐溶液显色后， 制作标准曲 线。 一个植酸酶活力单位为 ： 在此测定条件下， 每分钟从植酸钠溶液中释放1nmol无机磷所 需要的酶量。 0059 1.5 植酸酶活性测定溶液 0060 底物溶液 ： 2mmol/L 植酸钠， 100mmol/L Tris-HCl pH7.0,2mmol/L CaCl2 0061 终止液 ： 5% 。
26、三氯乙酸 （TCA） 0062 显色液 ： 1.5% 钼酸氨 /5.5% 硫酸和 2.7% 硫酸亚铁按 4:1 比例混合 0063 磷酸盐标准溶液 ： 将 0.6214gKH2PO4溶于重蒸水， 定容于 500ml 容量瓶中， 为 9mmol/l 的磷酸盐母液。制作标准曲线时， 用重蒸水将母液逐管稀释为浓度为 22.5nmol/l， 45nmol/l， 90nmol/l， 180nmol/l 的磷酸盐溶液。 0064 2、 选择突变的氨基酸 0065 通过对无花果曲霉 （Aspergillus ficuum）植酸酶 （EC3.1.3.26） （Aspergillus ficuum 氨基酸序列如。
27、 seq ID NO2 所示） 非保守活性位点 （1-33 ； 361-441） 进行系列定点突 变， 通过软件重建 （Biosist 和哥伦比亚大学的软件） 发现 27 位氨基酸发生突变对 Tm 值影 响最大， 但对活性中心空间结构改变不明显。 0066 3、 软件进行定点突变筛选 0067 利用软件进行 3D 重建植酸酶解折叠温度， 变化如表 2 所示 ： 0068 表 2 0069 突变位点突变前 Tm 突变后 Tm 相对酶活力 Gln-27-Gly72.583.3基本不变 Gln-27-Thr72.565.5基本不变 Gln-27-Leu72.573.5基本不变 Gln-27-Ile7。
28、2.574基本不变 说 明 书 CN 103849607 B 7 6/12 页 8 Gln-27-Phe72.574.5基本不变 Gln-27-Asn72.568.5基本不变 Gln-27-Val72.575.5基本不变 Gln-27-Ala72.576.5基本不变 Gln-27-Asp72.570.5基本不变 Gln-27-Glu72.566.5基本不变 Gln-27-Arg72.556.5基本不变 0070 因此选取 Gln-27-Gly 进行构建载体表达验证。 0071 4、 构建载体表达验证 Gln-27-Gly 突变。 0072 设计一对含预定突变的完全互补的寡核苷酸引物， 突变碱基。
29、位于引物中央， 两侧 为 10 15 个正确的碱基 ； 引物长度 25 45 个碱基， GC 含量大于 40%， 3 末端应为碱基 G 或 C， Tm 值不低于 78。Stratagene 公司给予上述原则开发出了在线的突变引物设计软 件， 与 QuikChangeTMSite Directed Mutagenesis Kit 配合使用。 0073 突变选择正确的突变质粒， 电击转化进行重组酵母的平板筛选。电击培养在 MD 平板上的转化子 ,3d 后可观察到直径约为 2mm 的乳白色菌落。培养到第 5d 后， 将所有的 单菌落分别点种到 MM 平板和 MD 平板， 并设阳性对照 GS115Al。
30、bumin(His+Muts) 和阴性对照 GS115-gal(His+Mut+),30培养2d或更长时间， 筛选出在MD上生长正常， 在MM上生长缓 慢或不生长的菌落， 为阳性菌落。通过平板筛选的阳性转化子用 YPD 液体培养基摇瓶培养 16-20h， 取 200l 细胞悬液， 收集细胞， 用灭菌蒸馏水等体积洗涤 2 次后， 重悬与 200l 去 离子水， 取 1l 细胞悬液于总体积为 50l 的 PCR 反应体系中， 并以相应表达片段的 PCR 产物作对照。PCR 呈阳性结果的转化子进行表达研究。 0074 将经平板筛选和 PCR 检测后的重组酵母接种于 10ml 的 BMGY 中， 36。
31、培养 16h(OD600=10 20)， 按 5% 的接种量接种于 200ml 的 BMGY 中。培养 20h 后， 室温静置 4h， 倾去培养液， 加入 200ml 的 BMMY （2% 甲醇诱导） 。胞内表达重组酵母 30继续诱导培养 4d， 收获细胞。分泌表达的重组酵母 30继续诱导培养 48h， 收获培养液上清。通过酶活测定， 选取最高酶活的重组酵母作进一步研究。 0075 最终表明 ： 分泌想表达酶活力为 243FTU/ml。 0076 5、 Gln-27-Gly 表达蛋白进行纯化性质研究及剂型加工 0077 纯化与后加工工艺流程如图 1 所示 ： 0078 6、 系列指标验证与考察。
32、 0079 1） 蛋白质分子量检测 0080 经纯化后 （硫酸铵沉淀、 离子交换、 分子筛纯化） 的植酸酶电泳检测后发现。 0081 （分泌表达的植酸酶 SDS-PAGE 电泳结果如图 2 所示） 蛋白带为一条分子量约为 41.5KD 的蛋白带， 与出发菌株所产天然植酸酶的表现分子量 42.04KD 相当。 0082 2） 酶活力测定 说 明 书 CN 103849607 B 8 7/12 页 9 0083 将突变表达后的发酵液与未突变菌株同等条件下测植酸酶活力 （平行测三次取平 均值） ， 进行比较 ： 0084 结果 ： 突变后酶活力 ： 246U/ml， 未突变酶活力 232U/ml。 。
33、0085 将纯化后的植酸酶测定酶活力表明酶活力为 10650U/g， 与文献报道相比略高。 0086 结果说明 ： 酶的非保守区进行定点突变后酶活力变化不明显， 与酶学基础原理一 致。 0087 3） 最适温度及热稳定性 0088 最适温度 ： 在不同温度下的植酸酶按照酶活测定条件测定活力， 做温度 - 酶活曲 线。根据此曲线， 可知温度对酶活力的影响。本酶最适温度为 45。如图 3 所示。 0089 热稳定性 ： 将一定的植酸酶反应液分别放在不同温度的水浴中 （30 -90） 保温 30min， 然后按酶活测定方法测定酶活， 结果表明， 酶在此温度范围内稳定。如图 4 所示 0090 结果表。
34、明 ： 本发明植酸酶相比现有的植酸酶的热稳定性大大提高， 90 度情况下仍 然保持大部分酶活力， 对饲料造粒过程中的高温因素影响可以忽略。 0091 4） 最适 pH 值及 pH 值稳定性 0092 最适 pH 值 ： 在不同 pH 值下 （pH1.5-8.5） 按酶活测定条件测定酶活力， 作 pH酶 活性曲线 （如图 5 所示） 根据酶活随 pH 的变化情况， 可知该植酸酶活力的最适 pH 为 2.5 和 7.0。 0093 酸碱稳定性 ： 将一定的酶液分别放在不同pH值缓冲液中 （pH1.5-8.0） ,37保温1 小时， 然后按酶活测定方法测定酶活。结果表明， 酶在 1.5-7.5 的 。
35、pH 值范围内稳定。如图 6 所示 0094 结果表明 ： 经过改造后的酶酶活 pH 稳定性增强。并且出现了两个最适 pH， 为动物 消化道 （胃和肠道的 pH） 。 0095 7、 发酵工艺试验 0096 7.1 碳源的选择 0097 在基础发酵培养基中分别加入 2% 的 9 种不同种类碳源， 进行碳源试验， 接入种子 菌液后， 在适当条件下进行发酵培养， 然后取发酵产物的上清液测定酶活力以及菌体生长 量。结果见表 3。 0098 表 3 碳源对菌体生长及植酸酶活性的影响 说 明 书 CN 103849607 B 9 8/12 页 10 0099 0100 从表 3 可以看出， 不同的碳源对。
36、酶活性影响很大， 以麦芽汁最佳， 蔗糖次之， 从生 产考虑， 采用麦芽汁为碳源来发酵。 0101 7.2 氮源的选择 0102 采用 9 种氮源取代基础发酵培养基中的氮源， 分别加入 2%， 然后取发酵产物的上 清液测定酶活力以及菌体生长量。结果见表 4。 0103 表 4 氮源对菌体生长的酶活影响 0104 0105 从表 4 可以看出该菌株在无机氮源中生长差， 有机氮源的发酵产酶活性水平明显 高于无机氮源， 其中大豆蛋白胨为氮源酶活力最高， 从生产成本考虑， 选择豆粉。 0106 7.3 最适起始 pH 的选择 0107 将发酵培养基用 NaOH 和 HCl 溶液调成不同 pH 值， 研究。
37、 pH 值对菌体生长和酶活的 影响， 结果见图 7。菌体在试验中的 pH 值范围内均可生长， pH 值对生物量影响不大， 最适菌 体生长 pH 值为 7.5。 说 明 书 CN 103849607 B 10 9/12 页 11 0108 7.4 最适温度的选择 0109 将发酵培养基接种后分别置于 20、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 65下培 养， 观察不同温度对菌体生长和酶活的影响， 结果见图 8。40是植酸酶的最适发酵温度。 0110 7.5 装液量的选择 0111 分别在 250ml 的三角瓶中把发酵培养基装成 5、 10、 20、 30、 40、 50、 60ml 。
38、不同装量， 按 5% 接种量接种， 研究通气条件对菌体生物量和酶活的影响， 结果 （图 9） 表明， 通气量对生 物量影响较大， 通气量越大， 菌体生长越好。综合考虑， 选择 20ml 的瓶装量。 0112 7.6 接种量的选择 0113 接种量对产酶的影响如图 10 所示。以 5% 的接种量最好。 0114 7.7 正交试验设计 0115 选用 L9（34） 表将培养基成分豆粉， 麦芽汁， NaCl 三个因素设计正交试验。根据正 交试验表结果， 第 9 个组合产酶最好， 酶活达到 243U/ml, 该菌株的最佳发酵培养基确定为 豆粉 2%， 麦芽汁 2%， NaCl0.5%。 0116 表 。
39、5 正交试验结果 0117 试验号 豆粉 麦芽汁 NaCl酶活 /U/ml 110.50.395 211.50.5125 3120.7148 41.50.50.598 51.51.50.7127 61.520.3168 720.50.7185 821.50.3212 9220.5243 0118 7.8 发酵时间 0119 发酵结果表明 ： 在麦芽汁半合成培养基中进行植酸酶的诱导表达研究， 其产酶曲 线见图11所示。 由图可知， 甲醇诱导培养60h内， 酶活升高很快， 植酸酶活性达到215U/ml。 之后呈缓慢上升态势， 102h 达到最高峰， 在 60h 即可收获植酸酶， 缩短酶收获时间， 。
40、对降低 生产成本有重要意义。综合考虑， 发酵时间采用 60h。 0120 最终确定发酵培养基配方与条件 ： 豆粉 2%， 麦芽汁 2%， NaCl0.5%， 诱导剂添加量为 0.4%， pH 值为 7.5， 发酵时间 60 小时。 0121 8、 纯化工艺与造粒工艺研究 说 明 书 CN 103849607 B 11 10/12 页 12 0122 纯化采用弄算后喷雾干燥， 喷雾条件为 ： 进风温度为 90， 出风温度为 60， 吹风 压力为 0.2Mpa， 收集得到植酸酶粉。 0123 植酸酶粉测定酶活后， 按照 5100FTU/g 的配比加入制粒保护剂， 进入流化床造粒， 最终得到植酸酶颗。
41、粒。 0124 检验合格后包装。 0125 9、 酶学稳定性实验 0126 通过研究表明， 温度在 50以下时， 植酸酶活性比较稳定 ； 未加工酶样室温下 长时间放置， 酶活损失率较大 ； 按我们的工艺， 植酸酶样品在造粒加工前后的酶活损失率 5%。加工后的酶稳定性增加， 90， 30 分钟后， 酶活回收率还可达到 95% 以上。加工后的 酶样在常温下保存， 其活性损失比未加工样品低 90% 以上。颗粒剂保存期在室温下可达到 1 年。 0127 10、 混合均匀度实验 0128 添加必须保证添加剂的流动性良好， 才能保证混合均匀， 保证最终产品的均一性。 造粒后的产品进行混合均匀度试验， 验证。
42、流动性。 0129 设定饲料中植酸酶添加后的标准含量 （理论含量） ， 在不同的样品中添加相同量的 植酸酶， 考察各样品中相对标准量的相对含量， 作图后计算。如图 12 所示 0130 最终变异系数为 8%， 与外国产品该参数相当 （8%-10%） 。 0131 总结 ： 本发明耐高温植酸酶通过华氏酵母表达后经过后加工为颗粒型植酸酶， 具 有良好的可加工性。 0132 11、 本发明耐高温植酸酶总体性能指标与国内外同类技术的比较如下表所示。 0133 表 6 本发明植酸酶与国内外主要产品比较 0134 说 明 书 CN 103849607 B 12 11/12 页 13 0135 因此， 从酶。
43、活释放速度和热稳定性、 pH 稳定性、 混合均匀度等方面比较， 本发明产 品全面超过国内外产品， 产品总体质量居国际先进水平。 0136 12、 本发明植酸酶的价格优势 0137 由于养殖产品市场疲软， 饲料产品售价下降幅度较大， 而饲料原料价格则一直稳 定在较高价位， 使饲料生产企业效益很低， 最低生产每吨饲料仅 30 元利润 ( 蛋鸡浓缩饲 料 )， 最高也仅 200 元利润 （猪用浓缩饲料） ， 按以前市场上植酸酶的售价， 添加植酸酶提高 饲料的生产成本， 为降低生产成本， 我国饲料生产企业大都不使用植酸酶， 而采用添加非植 酸磷的方法。 0138 目前饲料添加剂随着植酸酶价格的降低， 。
44、饲料添加植酸酶增加的成本已经不太显 著 （表 7） 。 0139 表 7 在蛋鸡饲料中使用植酸酶与磷酸氢钙的成本投入对比 说 明 书 CN 103849607 B 13 12/12 页 14 0140 0141 与常规微生物发酵或其它基因工程生产的饲用植酸酶制剂相比较， 本发明植酸酶 价格低， 性能高 （耐高温） ， 具有良好的性价比。同时由于该植酸酶耐高温等原因， 不仅适应 饲料工业制粒时的高温， 且可使其在饲料用的添加当量降低， 约为一般微生物产植酸酶的 60-80%。达到了饲料工业对饲用植酸酶制剂的要求。 0142 试验例 1 0143 选择 5 日龄肉仔鸡 400 只， 随机分成 4 。
45、个处理， 每个处理 4 个重复， 研究饲料中添 加本发明耐高温植酸酶对鸡生长性能的影响。 0144 试验处理如下 ： 0145 对照组 ： 基础日粮 ； 0146 试验组 ： 基础日粮 +0.01% 植酸酶 ； 0147 试验组 ： 基础日粮 +0.02% 纤维素酶制剂 ；（纤维素酶制剂购自上海丹尼悦生物 科技有限公司） 0148 试验组 ： 基础日粮 +0.02% 植酸酶。 0149 结果表明， 日增重和饲料效率试验组最好， 其次是试验组， 试验组第 3， 对 照组最低 (p 0.05) ； 鸡粪尿中氮含量试验、 、 组相较对照组分别下降了 11.08%、 5.01%、 14.07%， 磷含。
46、量试验、 、 组较对照组分别下降了 1.04%、 30.01% 和 35.60% ； 舍内 氨含量试验、 、 组较对照组分别下降了 20.01%、 10.07% 和 29.08%。 0150 试验例 2 0151 选择 30 日龄的杂交仔猪 96 头， 随机分成 4 个处理组， 每个处理 4 个重复， 对其进 行二个氮平衡试验 , 研究饲粮中添加 400IU/kg 的本发明耐高温植酸酶对仔猪生长性能和 蛋白质氨基酸利用率的影响。 0152 试验处理如下 ： 0153 对照组 ： 基础日粮 ； 0154 试验组 ： 基础日粮 +400IU/kg 植酸酶 ； 0155 试验组 ： 基础日粮 -5%。
47、 赖氨酸 ； 0156 试验组 ： 基础日粮 -5% 赖氨酸 +400IU/kg 植酸酶。 0157 结果表明， 降低日粮蛋白质水平 （赖氨酸） 后， 相比对照组， 试验组日增重、 采食 量和饲料利用率分别下降 16.0%、 7.2% 和 11.0%(P0.01) ； 与不加酶的两组比较， 添加植酸 酶的平均效果为 ： 日增重、 采食量和饲料利用率分别提高 12.0%、 7.0% 和 3.8%(P0.05)， 粪 便中氨含量下降 36.0%。 说 明 书 CN 103849607 B 14 1/5 页 15 0001 0002 序 列 表 CN 103849607 B 15 2/5 页 16 。
48、0003 序 列 表 CN 103849607 B 16 3/5 页 17 0004 序 列 表 CN 103849607 B 17 4/5 页 18 0005 序 列 表 CN 103849607 B 18 5/5 页 19 序 列 表 CN 103849607 B 19 1/7 页 20 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103849607 B 20 2/7 页 21 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103849607 B 21 3/7 页 22 图 5 说 明 书 附 图 CN 103849607 B 22 4/7 页 23 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103849607 B 23 5/7 页 24 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 103849607 B 24 6/7 页 25 图 10 图 11 说 明 书 附 图 CN 103849607 B 25 7/7 页 26 图 12 说 明 书 附 图 CN 103849607 B 26 。