《一株链格孢菌及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一株链格孢菌及其应用.pdf（13页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510061555.1 (22)申请日 2015.02.05 CGMCC No.9852 2014.10.28 C12N 1/14(2006.01) A24B 3/12(2006.01) A24B 15/20(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 郝勋 地址 271600 山东省泰安市肥城市物资东区 9 号楼 3 单元 401 申请人 李国强 (72)发明人 郝勋 李国强 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 (54) 发明名称 一株链格孢菌及其应。
2、用 (57) 摘要 本发明公开了一株链格孢菌及其应用。本 发明所提供的链格孢 (Alternaria alternata) HaoJ003， 其在中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.9852。 采用本发明的链格孢 (Alternaria alternata) HaoJ003 CGMCC No.9852菌剂处理的烟叶， 检测到 28种烟叶致香相关成分， 其中14种致香化合物在 对照组中未检出， 其余 14 种致香成分的含量均比 对照组提高， 烟碱含量比对照组降低 10.26、 1 种苯类和 4 种酚类等有害成分的含量均比对照组 显著下降， 既增加了烟叶香。
3、气又降低了烟叶中有 害成分含量， 缩短了自然陈化时间， 改善了烟叶品 质。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书8页 序列表1页 附图1页 CN 105985912 A 2016.10.05 CN 105985912 A 1/2 页 2 1.链 格 孢 (Alternaria alternata)，其 特 征 在 于 ： 所 述 链 格 孢 (Alternaria alternata) 的菌株号为 HaoJ003， 其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的 登记入册编号为 CGMCC No.98。
4、52。 2.权利要求 1 所述的链格孢 (Alternaria alternata) 在生产分生孢子和 / 或菌丝体 中的应用。 3.一种菌剂， 它的活性成分是权利要求 1 所述的链格孢 (Alternaria alternata)。 4.根据权利要求 3 所述的菌剂， 其特征在于 ： 所述菌剂具有下述 1)-5) 中至少一种应 用 ： 1) 增加烟叶香气中的应用 ； 2) 增加烟叶中致香化合物中的应用 ； 所述致香化合物为下述 14 种化合物中的至少一 种 ： 2- 乙基 -1- 己醇、 1- 戊醇、 寸拜醇、 1-(1H- 吡咯 -2- 基 ) 乙酮、 1-(2- 呋喃基 ) 乙酮、 3,。
5、4- 二氢化吡咯并 1,2-a 吡嗪 -1(2H)- 酮、 茄酮、 3- 糠醛、 癸醛、 己醛、 十四醛、 邻苯二甲 酸二异丁酯、 邻苯二甲酯二异辛酯和十六酸乙酯 ； 3) 提高烟叶中致香成分的含量中的应用 ； 所述致香成分为下述 14 种致香成分中的至 少一种 ： 苯乙醇、 3,7- 二甲基 -1,6- 辛二烯 -3- 醇、 2,3,6- 三甲基 -1,4- 萘二酮、 2,3- 二氢 苯并呋喃酮、 3-羟基-BETA-二氢大马酮、 3-羟基茄酮、 香叶基丙酮、 2,6,6-三甲基-1-环己 烯 -1- 甲醛 ( 环柠檬醛 )、 2,6- 壬二烯醛、 3- 甲基 -2- 丁烯醛、 苯甲醛、 壬。
6、醛、 邻苯二甲酸二 丁酯和十六酸甲酯 ； 4) 降低烟叶中烟碱含量中的应用 ； 5) 降低烟叶中芳香族化合物的含量中的应用 ； 所述芳香族化合物为下述 5 种芳香族化 合物中的至少一种 ： 乙基苯、 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯酚、 4-壬基苯酚、 2-甲氧基-4-乙 烯基苯酚和壬烷基苯酚。 5.权利要求 1 所述链格孢 (Alternaria alternata)， 或， 权利要求 3 或 4 所述菌剂的 下述 1)-5) 中任一种应用 ： 1) 增加烟叶香气中的应用 ； 2) 增加烟叶中致香化合物中的应用 ； 所述致香化合物为下述 14 种化合物中的至少一 种 ： 2- 乙基 -1。
7、- 己醇、 1- 戊醇、 寸拜醇、 1-(1H- 吡咯 -2- 基 ) 乙酮、 1-(2- 呋喃基 ) 乙酮、 3,4- 二氢化吡咯并 1,2-a 吡嗪 -1(2H)- 酮、 茄酮、 3- 糠醛、 癸醛、 己醛、 十四醛、 邻苯二甲 酸二异丁酯、 邻苯二甲酯二异辛酯和十六酸乙酯 ； 3) 提高烟叶中致香成分的含量中的应用 ； 所述致香成分为下述 14 种致香成分中的至 少一种 ： 苯乙醇、 3,7- 二甲基 -1,6- 辛二烯 -3- 醇、 2,3,6- 三甲基 -1,4- 萘二酮、 2,3- 二氢 苯并呋喃酮、 3-羟基-BETA-二氢大马酮、 3-羟基茄酮、 香叶基丙酮、 2,6,6-三甲。
8、基-1-环己 烯 -1- 甲醛 ( 环柠檬醛 )、 2,6- 壬二烯醛、 3- 甲基 -2- 丁烯醛、 苯甲醛、 壬醛、 邻苯二甲酸二 丁酯和十六酸甲酯 ； 4) 降低烟叶中烟碱含量中的应用 ； 5) 降低烟叶中芳香族化合物的含量中的应用 ； 所述芳香族化合物为下述 5 种芳香族化 合物中的至少一种 ： 乙基苯、 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯酚、 4-壬基苯酚、 2-甲氧基-4-乙 烯基苯酚和壬烷基苯酚。 6.培养权利要求 1 所述链格孢 (Alternaria alternata) 的方法， 包括将所述链格孢 权 利 要 求 书 CN 105985912 A 2 2/2 页 3 (A。
9、lternaria alternata) 在用于培养链格孢菌的培养基中培养的步骤。 7.制备权利要求 3 或 4 所述菌剂的方法， 包括将所述链格孢 (Alternaria alternata) 作为活性成分， 得到所述菌剂的步骤。 8.改善烟叶品质的方法， 包括采用无菌水稀释权利要求 3 或 4 所述菌剂得到菌剂悬浮 液， 将所述菌剂悬浮液喷施于待处理烟叶表面， 进行陈化， 得到菌剂处理烟叶。 9.根据权利要求 8 所述的方法， 其特征在于 ： 所述菌剂悬浮液中权利要求 1 所述链格 孢 (Alternaria alternata) 的含量为 1106cfu/mL-8106cfu/mL。 1。
10、0.按照权利要求 8 或 9 所述方法得到的菌剂处理烟叶。 权 利 要 求 书 CN 105985912 A 3 1/8 页 4 一株链格孢菌及其应用 技术领域 0001 本发明涉及微生物技术领域中一株链格孢菌及其应用。 背景技术 0002 烟叶中的烟碱、 亚硝氨类等有害物质严重影响了烟叶品质， 特别是上部烟叶。 上部 烟叶中干物质充实度高， 叶片厚， 单叶重大， 醚类提取物的含量高， 香气较充足， 但是总糖和 还原性糖的含量较低， 烟碱和蛋白质的含量较高， 烟叶内各种化学成分之间比例不协调， 杂 气和刺激性较重， 制约烟叶内固有香气显露， 严重影响上部烟叶的实用性， 造成了巨大的经 济损失。。
11、 此外， 此类烟叶自然醇化速度慢、 贮存周期较长、 场地占用大、 资金占压多从而导致 生产成本增高， 且在长期贮存过程中容易发生虫害和霉变， 因此如何处理及应用此类烟叶 成了摆在卷烟企业面前亟待解决的难题。 0003 微生物菌群对加速烟叶醇化、 提高烟叶品质、 增加卷烟香气和降低卷烟有害物质 方面具有不可忽视的作用。发达国家率先开展了微生物降低烟叶有害物质、 增加烟草香 气的研究， 国内许多研究团队同样做过大量类似的研究。V.L.Geiss(Control and use of microbes in tobacco product manufacturingJ.Recent Advance 。
12、in Tobacco Science， 1989,15:182-209.) 报道了微球菌和纤维单胞菌 (Cellulomonas sp.) 可以降低发酵烟叶 中的硝酸盐， 并且纤维单胞菌还可以降低烟叶中烟碱的含量从而改善烟叶品质。朱大恒等 人 ( 朱大恒 , 韩锦峰 , 周御风等 . 利用产香微生物发酵生产烟用香料技术及其应用 J. 烟草科技 ,1997,1:30-31.) 从烟叶上分离并纯化了一株产香菌， 利用其发酵产物作为香料 (TMF) 来提升烟叶香气， 结果卷烟品质明显改善， 烟气醇和而饱满， 并能减轻卷烟杂气和刺 激性。韩锦峰等人 ( 韩锦峰 , 朱大恒 , 刘卫群 . 陈化发酵期间。
13、烤烟叶面微生物活性及其应 用研究J.中国烟草科学,1997,4:13-14.)从烟叶上分离到几株优势菌， 混合配制成生物 制剂 (TFA) 用于烟叶发酵， 结果表明 TFA 可加速烟叶发酵， 提高烟叶发酵质量， 同时具有抑 制烟叶发霉的作用。赵铭钦等人 ( 赵铭钦 , 齐伟城 , 邱立友 . 烟草发酵增制剂对烤烟发酵 质量的影响 . 河南农业科学 ,1998,12:13-14.) 利用优势增香菌和高生物活性的淀粉酶、 蛋白酶配制成烟草发酵增质剂应用到烟叶发酵中， 结果发现发酵增质剂具有促进烟叶内部 有机物质分解和转化， 使烟叶内糖氮碱等成分的含量及比例趋于平衡， 烟叶香气质改善， 香 气量增加。
14、， 固有的杂气和刺激性减轻， 并加速烟叶发酵进程， 缩短发酵周期。但是， 目前能 够用于烤烟快速增香和陈化的微生物菌株的报道还是比较少的， 同时还存在增香效果不明 显， 发酵时间长， 技术应用复杂， 微生物菌株难以培养等问题， 远不能满足卷烟工业发展的 实际需求， 因此寻求一种可显著改善烟叶品质， 并能实现快速陈化， 便于大规模生产和推广 应用， 对人类和环境均无害， 处理烟叶安全、 稳定， 不引发霉变的微生物菌株是本领域技术 人员所期望的。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是如何增加烟叶香气， 降低烟叶中的有害成分含量， 说 明 书 CN 105985912 A 4 2/8 页 。
15、5 缩短自然陈化时间， 改善烟叶品质。 0005 为解决上述技术问题， 本发明首先提供了一株链格孢菌。 0006 本发明所提供的链格孢菌是链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003， 其在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为 CGMCC No.9852。该菌种 已于 2014 年 10 月 28 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC)。 0007 本发明的链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 在 PDA 培养基 上菌落生长迅速， 初期为灰白色， 后逐渐呈现。
16、灰黑色同心轮状菌落， 菌落绒毡状， 平整。 菌丝 有分隔， 直径 3-6m ； 分生孢子梗顶端弯曲不规则， 褐色， 其上着生褐色的分生孢子， 链状 排列 ； 孢子倒棒锤形， 有 1-3 个纵隔， 3-7 个横隔， 有时弯曲， 孢子链末端的分生孢子较小， 椭 圆形， 有 1 个分隔。 0008 所述链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 在生产分生孢子和 / 或菌丝体中的应用也属于本发明的保护范围。 0009 为解决上述技术问题， 本发明还提供了一种菌剂。 0010 本发明所提供的菌剂， 它的活性成分是所述链格孢 (Alternaria al。
17、ternata) HaoJ003CGMCC No.9852。 0011 上述菌剂中， 所述链格孢(Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852可为分 生孢子和 / 或菌丝体。 0012 所述菌剂具有下述 1)-5) 中至少一种应用 ： 0013 1) 增加烟叶香气中的应用 ； 0014 2) 增加烟叶中致香化合物中的应用 ； 所述致香化合物为下述 14 种化合物中的至 少一种 ： 2- 乙基 -1- 己醇、 1- 戊醇、 寸拜醇、 1-(1H- 吡咯 -2- 基 ) 乙酮、 1-(2- 呋喃基 ) 乙 酮、 3,4- 二氢化吡咯并 1,2-a 吡嗪 -1(。
18、2H)- 酮、 茄酮、 3- 糠醛、 癸醛、 己醛、 十四醛、 邻苯二 甲酸二异丁酯、 邻苯二甲酯二异辛酯和十六酸乙酯 ； 0015 3) 提高烟叶中致香成分的含量中的应用 ； 所述致香成分为下述 14 种致香成分 中的至少一种 ： 苯乙醇、 3,7- 二甲基 -1,6- 辛二烯 -3- 醇、 2,3,6- 三甲基 -1,4- 萘二酮、 2,3- 二氢苯并呋喃酮、 3- 羟基 -BETA- 二氢大马酮、 3- 羟基茄酮、 香叶基丙酮、 2,6,6- 三甲 基 -1- 环己烯 -1- 甲醛 ( 环柠檬醛 )、 2,6- 壬二烯醛、 3- 甲基 -2- 丁烯醛、 苯甲醛、 壬醛、 邻 苯二甲酸二丁。
19、酯和十六酸甲酯 ； 0016 4) 降低烟叶中烟碱含量中的应用 ； 0017 5) 降低烟叶中芳香族化合物的含量中的应用 ； 所述芳香族化合物为下述 5 种芳 香族化合物中的至少一种 ： 乙基苯、 4-(1,1,3,3- 四甲基丁基 ) 苯酚、 4- 壬基苯酚、 2- 甲氧 基 -4- 乙烯基苯酚和壬烷基苯酚。 0018 所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可 为矿物材料、 植物材料或高分子化合物 ； 所述矿物材料可为粘土、 滑石、 高岭土、 蒙脱石、 白 碳、 沸石、 硅石和硅藻土中的至少一种 ； 所述植物材料可为玉米粉、 豆粉和淀粉中的至少一 种 ； 所述高。
20、分子化合物可为聚乙烯醇和 / 或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、 植物油、 矿物油或水 ； 所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。 所述菌剂中， 所述活性成分可以以被培 养的活细胞、 活细胞的发酵液、 细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。 所述 说 明 书 CN 105985912 A 5 3/8 页 6 菌剂的剂型可为多种剂型， 如液剂、 乳剂、 悬浮剂、 粉剂、 颗粒剂、 可湿性粉剂或水分散粒剂。 0019 根据需要， 所述菌剂中还可添加表面活性剂 ( 如吐温 20、 吐温 80 等 )、 粘合剂、 稳 定剂 ( 如抗氧化剂 )、 pH 调节剂等。 0020 所述链格孢 (Alt。
21、ernaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 或以所述链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852为活性成分的菌剂的下述1)-5)中任一种 应用也属于本发明的保护范围 ： 0021 1) 增加烟叶香气中的应用 ； 0022 2) 增加烟叶中致香化合物中的应用 ； 所述致香化合物为下述 14 种化合物中的至 少一种 ： 2- 乙基 -1- 己醇、 1- 戊醇、 寸拜醇、 1-(1H- 吡咯 -2- 基 ) 乙酮、 1-(2- 呋喃基 ) 乙 酮、 3,4- 二氢化吡咯并 1,2-a 吡嗪 -1(2H)- 酮、 茄酮、。
22、 3- 糠醛、 癸醛、 己醛、 十四醛、 邻苯二 甲酸二异丁酯、 邻苯二甲酯二异辛酯和十六酸乙酯 ； 0023 3) 提高烟叶中致香成分的含量中的应用 ； 所述致香成分为下述 14 种致香成分 中的至少一种 ： 苯乙醇、 3,7- 二甲基 -1,6- 辛二烯 -3- 醇、 2,3,6- 三甲基 -1,4- 萘二酮、 2,3- 二氢苯并呋喃酮、 3- 羟基 -BETA- 二氢大马酮、 3- 羟基茄酮、 香叶基丙酮、 2,6,6- 三甲 基 -1- 环己烯 -1- 甲醛 ( 环柠檬醛 )、 2,6- 壬二烯醛、 3- 甲基 -2- 丁烯醛、 苯甲醛、 壬醛、 邻 苯二甲酸二丁酯和十六酸甲酯 ； 0。
23、024 4) 降低烟叶中烟碱含量中的应用 ； 0025 5) 降低烟叶中芳香族化合物的含量中的应用 ； 所述芳香族化合物为下述 5 种芳 香族化合物中的至少一种 ： 乙基苯、 4-(1,1,3,3- 四甲基丁基 ) 苯酚、 4- 壬基苯酚、 2- 甲氧 基 -4- 乙烯基苯酚和壬烷基苯酚。 0026 为了解决上述技术问题， 本发明还提供了培养所述链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 的方法。 0027 本 发 明 所 提 供 的 培 养 所 述 链 格 孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.985。
24、2 的方法， 包括将所述链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 在用 于培养链格孢菌的培养基中培养的步骤。 0028 为解决上述技术问题， 本发明还提供了制备所述菌剂的方法。 0029 本发明所提供的制备上述菌剂的方法， 包括将所述链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 作为活性成分， 得到所述菌剂的步骤。 0030 所述制备菌剂的方法， 可包括在液体培养基中培养所述链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 的步骤 ； 所述液体培养基具。
25、体可为 PD 培养基。 0031 为解决上述技术问题， 本发明还提供了改善烟叶品质的方法。 0032 本发明所提供的改善烟叶品质的方法， 包括采用无菌水稀释所述菌剂得到菌剂悬 浮液， 将所述菌剂悬浮液喷施于待处理烟叶表面， 进行陈化， 得到菌剂处理烟叶。 0033 上述方法中， 所述菌剂处理烟叶与用无菌水处理烟叶相比， 具有下述 1)-5) 中至 少一种特性 ： 0034 1) 增加烟叶香气 ； 0035 2) 增加烟叶中致香化合物 ； 所述致香化合物为下述 14 种化合物中的至少一种 ： 2- 乙基 -1- 己醇、 1- 戊醇、 寸拜醇、 1-(1H- 吡咯 -2- 基 ) 乙酮、 1-(2。
26、- 呋喃基 ) 乙酮、 3,4- 二 氢化吡咯并1,2-a吡嗪-1(2H)-酮、 茄酮、 3-糠醛、 癸醛、 己醛、 十四醛、 邻苯二甲酸二异丁 说 明 书 CN 105985912 A 6 4/8 页 7 酯、 邻苯二甲酯二异辛酯和十六酸乙酯 ； 0036 3) 提高烟叶中致香成分的含量 ； 所述致香成分为下述 14 种致香成分中的至少一 种 ： 苯乙醇、 3,7- 二甲基 -1,6- 辛二烯 -3- 醇、 2,3,6- 三甲基 -1,4- 萘二酮、 2,3- 二氢苯 并呋喃酮、 3- 羟基 -BETA- 二氢大马酮、 3- 羟基茄酮、 香叶基丙酮、 2,6,6- 三甲基 -1- 环己 烯 。
27、-1- 甲醛 ( 环柠檬醛 )、 2,6- 壬二烯醛、 3- 甲基 -2- 丁烯醛、 苯甲醛、 壬醛、 邻苯二甲酸二 丁酯和十六酸甲酯 ； 0037 4) 降低烟叶中烟碱含量 ； 0038 5) 降低烟叶中芳香族化合物的含量 ； 所述芳香族化合物为下述 5 种芳香族化合物 中的至少一种 ： 乙基苯、 4-(1,1,3,3- 四甲基丁基 ) 苯酚、 4- 壬基苯酚、 2- 甲氧基 -4- 乙烯 基苯酚和壬烷基苯酚。 0039 其中， 所述无菌水处理烟叶的制备方法除将上述改善烟叶品质的方法中的所述菌 剂悬浮液替换为等质量的无菌水外， 其它均相同。 0040 上述改善烟叶品质的方法中， 所述菌剂悬浮。
28、液中所述链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 的含量可为 1106cfu/mL-8106cfu/mL， 具体可为 1106cfu/mL。 0041 上述改善烟叶品质的方法中， 所述陈化可在空气相对湿度为 202， 温度为 601的环境中进行。 0042 上述改善烟叶品质的方法中， 所述陈化可进行 90 天。 0043 按照上述改善烟叶品质的方法得到的菌剂处理烟叶也属于本发明的保护范围。 0044 本发明的链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852， 对人类和环境 均无害， 使用安全 ； 处。
29、理烟叶安全、 稳定， 不引发霉变。采用本发明的链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 菌剂处理库存积压上部、 下部烟叶， 可大大缩短烟叶的 发酵陈化时间， 降低大量烟叶库存压力。采用本发明的链格孢 (Alternaria alternata) HaoJ003CGMCC No.9852 菌剂处理的烟叶， 检测到 28 种烟叶致香相关成分， 其中 14 种致香 化合物在对照组中未检出， 其余 14 种致香成分含量均比对照组提高， 烟碱含量比对照组降 低 10.26、 1 种苯类和 4 种酚类等有害成分的含量均比对照组显著下降。本发明的链格孢 (。
30、Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 菌剂既增加了烟叶香气又降低了烟叶中 有害成分的含量， 缩短了自然陈化时间， 改善了烟叶品质。 0045 保藏说明 0046 菌种名称 ： 链格孢 0047 拉丁名 ： Alternaria alternata 0048 菌株编号 ： HaoJ003 0049 保藏机构 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 0050 保藏机构简称 ： CGMCC 0051 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号 0052 保藏日期 ： 2014 年 10 月 28 日 0053 保藏中心登记入册编号 ： CG。
31、MCC No.9852 附图说明 说 明 书 CN 105985912 A 7 5/8 页 8 0054 图 1 为链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 的菌落。 0055 图 2 为链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 的菌体形态。 具体实施方式 0056 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述， 给出的实施例仅为了阐 明本发明， 而不是为了限制本发明的范围。 0057 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 0058 下述实施例中所用的材料、 试剂等，。
32、 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0059 实施例 1、 链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 的分离及鉴定 0060 1、 链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 的分离 0061 采集仓库贮存 ( 陈化 ) 烟叶及大田期烟叶样本， 在 40 体视镜下， 直接观察烟 叶表面微生物， 在无菌环境下分离单孢培养， 25下培养一周， 根据菌落形态、 菌丝丰富程 度和产孢量等特征挑取有代表性的单菌落纯化， 作为待测菌株， 共分离到 1000 株微生物菌 株。将分离得到的 1000 株待。
33、测菌株配置成喷施菌液分别对烟叶进行喷施处理， 在相对湿度 为 20， 温度为 60条件下陈化 90 天后对处理后的烟叶内的化学成分 ( 可溶性糖、 烟碱、 总氮及类胡萝卜素等 ) 的含量及其变化进行测定， 结合专家评吸烟叶品质优劣的技术指 标， 筛选得到链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852。 0062 2、 链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 的鉴定 0063 (1) 形态学鉴定 0064 链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852。
34、 在 PDA 培养基上菌落生 长迅速， 初期为灰白色， 后逐渐呈现灰黑色同心轮状菌落， 菌落绒毡状， 平整。菌丝有分隔， 直径 3-6m ； 分生孢子梗顶端弯曲不规则， 褐色， 其上着生褐色的分生孢子， 链状排列 ； 孢 子倒棒锤形， 有 1-3 个纵隔， 3-7 个横隔， 有时弯曲， 孢子链末端的分生孢子较小， 椭圆形， 有 1 个分隔。 0065 (2) 分子鉴定 0066 将链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 培养后提取 DNA， 通过 真菌 rDNA-ITS 序列比对分析鉴定该菌株为链格孢 (Alternaria alterna。
35、ta)。 0067 链格孢(Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852的rDNA-ITS序列为序列 表中 SEQ ID No.1 所示的 rDNA 序列。 0068 链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 已于 2014 年 10 月 28 日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC)， 其在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为 CGMCC No.9852。 0069 实施例 2、 链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ00。
36、3CGMCC No.9852 菌剂用于改善 烟叶品质 0070 1、 链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 菌剂的制备 0071 将链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 采用 PD 液体培养基 进行培养， PD 培养基的制备方法如下 ： 将马铃薯洗净去皮 , 称取 200g， 切成小块， 加水煮沸 20-30min， 用纱布过滤， 加入20g葡萄糖， 搅拌均匀， 稍冷却后再补足水分至1000mL， 将pH值 调节至 5， 分装入三形瓶， 121高压灭菌 20min 左右， 冷却后贮存。
37、备用。 说 明 书 CN 105985912 A 8 6/8 页 9 0072 将链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 用 PDA 培养基 ( 在 PD 培养基中加入琼脂得到的固体培养基 ) 于 25活化培养， 活化后用直径 8mm 的打孔器于菌 落边缘打孔做成菌饼， 将菌饼移入含有 200mL PD 培养液的 500mL 三角瓶中， 每个三角瓶中 移入 4 块菌饼， 置于 25、 120rpm/min 的摇床中培养 10d。培养结束后利用超声波破碎仪 破碎菌丝体和孢子， 超声的功率为 800w， 每次超声时间为 3s， 间隔 3s, 共。
38、超声 45 次， 制备 成链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 菌剂。将链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 菌剂分装于 500mL 棕色玻璃瓶中， 4保存备用。 0073 2、 用链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 菌剂改善烟叶品质 0074 云烟 85 的烟叶成熟后进行采收， 取含水量为 11-13的顶叶随机分为两组， 实验 分为菌剂处理组和对照组。菌剂处理组的烟叶进行如下处理 ： 采用无菌水稀释步骤 1 的链 格孢(Al。
39、ternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852菌剂得到菌剂悬浮液， 该菌剂悬浮液 中的链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 的含量为 1106cfu/mL。将 该菌剂悬浮液喷施于待处理烟叶表面， 该菌剂悬浮液的喷施量为待处理烟叶质量的 1， 在 空气相对湿度为 20， 温度为 60的环境中陈化 90 天， 得到菌剂处理烟叶。 0075 对照组的烟叶处理方法中除将菌剂悬浮液替换为等质量的无菌水外， 其它均相 同， 得到对照处理烟叶。 0076 分别取等质量的菌剂处理烟叶和对照处理烟叶， 按照文献 ( 肖协忠 。
40、, 吴帼英 , 王 宝华等 . 烟草化学 M. 北京 : 中国农业出版社 ,1997:50,65,165194.) 所述方法测定烟 叶中的烟碱含量 ； 分别取等质量的菌剂处理烟叶和对照处理烟叶采用自动气相色谱 - 质谱 测定仪(GC/MS)， 使用Wiley和NIST谱库进行图谱检索与分析， 分别确定菌剂处理烟叶和对 照处理烟叶中含有的相关成分的种类和名称 ； 采用标准品根据标准曲线法 ( 外标法 ) 进行 定量分析分别测定菌剂处理烟叶和对照处理烟叶中含有的相关成分的含量。 每个样品重复 测定三次取平均值， 实验测定结果见表 1。 0077 表 1、 链格孢菌剂处理烟叶相关成分含量测定结果 0。
41、078 0079 说 明 书 CN 105985912 A 9 7/8 页 10 0080 注 ：“” 表示对照中无该物质，“-” 表示处理烟叶中该物质含量降低，“-” 表示该 数值无法计算。 0081 从表 1 中可以看出， 采用链格孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 菌剂处理后的烟叶中共检测出 34 种相关成分， 其中， 28 种是烟叶致香相关成分， 包括 5 种 醇类 (2- 乙基 -1- 己醇、 1- 戊醇、 寸拜醇、 苯乙醇、 3,7- 二甲基 -1,6- 辛二烯 -3- 醇 )， 9 种酮类 (1-(1H- 吡咯 -2- 基 )。
42、 乙酮、 1-(2- 呋喃基 ) 乙酮、 3,4- 二氢化吡咯并 1,2-a 吡 嗪-1(2H)-酮、 茄酮、 2,3,6-三甲基-1,4-萘二酮、 2,3-二氢苯并呋喃酮、 3-羟基-BETA-二 氢大马酮、 3- 羟基茄酮、 香叶基丙酮 )， 9 种醛类 (3- 糠醛、 癸醛、 己醛、 十四醛、 2,6,6- 三甲 基 -1- 环己烯 -1- 甲醛 ( 环柠檬醛 )、 2,6- 壬二烯醛、 3- 甲基 -2- 丁烯醛、 苯甲醛、 壬醛 ) 和 5 种酯类 ( 邻苯二甲酸二异丁酯、 邻苯二甲酯二异辛酯、 十六酸乙酯、 邻苯二甲酸二丁 酯、 十六酸甲酯 )。在 28 种致香成分中， 有 14 。
43、种致香化合物 (2- 乙基 -1- 己醇、 1- 戊醇、 寸拜醇、 1-(1H- 吡咯 -2- 基 ) 乙酮、 1-(2- 呋喃基 ) 乙酮、 3,4- 二氢化吡咯并 1,2-a 吡 嗪 -1(2H)- 酮、 茄酮、 3- 糠醛、 癸醛、 己醛、 十四醛、 邻苯二甲酸二异丁酯、 邻苯二甲酯二异辛 酯和十六酸乙酯 ) 在对照组中未检出 ； 其余 14 种致香成分 ( 苯乙醇、 3,7- 二甲基 -1,6- 辛 二烯 -3- 醇、 2,3,6- 三甲基 -1,4- 萘二酮、 2,3- 二氢苯并呋喃酮、 3- 羟基 -BETA- 二氢大 说 明 书 CN 105985912 A 10 8/8 页 1。
44、1 马酮、 3- 羟基茄酮、 香叶基丙酮、 2,6,6- 三甲基 -1- 环己烯 -1- 甲醛 ( 环柠檬醛 )、 2,6- 壬 二烯醛、 3- 甲基 -2- 丁烯醛、 苯甲醛、 壬醛、 邻苯二甲酸二丁酯和十六酸甲酯 ) 的含量均比 对照组提高 ； 菌剂处理组烟叶中的烟碱含量比对照组降低 10.26， 菌剂处理组烟叶中的 1 种苯类 ( 乙基苯 ) 和 4 种酚类 (4-(1,1,3,3- 四甲基丁基 ) 苯酚、 4- 壬基苯酚、 2- 甲氧 基 -4- 乙烯基苯酚和壬烷基苯酚 ) 等有害成分的含量均比对照组显著下降。本发明的链格 孢 (Alternaria alternata)HaoJ003CGMCC No.9852 菌剂既增加了烟叶香气又降低了烟叶 中有害成分的含量， 缩短了自然陈化时间， 改善了烟叶品质。 说 明 书 CN 105985912 A 11 1/1 页 12 0001 序 列 表 CN 105985912 A 12 1/1 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 105985912 A 13 。