采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固定化脂肪酶的方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101514338 B (45)授权公告日 2011.11.16 CN 101514338 B *CN101514338B* (21)申请号 200810162594.0 (22)申请日 2008.12.04 C12N 11/04(2006.01) (73)专利权人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市浙大路 38 号 (72)发明人 杨立荣 杨光 徐刚 吴坚平 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 张法高 CN 101235368 A,2008.08.06, 全文 . CN 101058820 A,2007.10.24, 全文。

2、 . 刘秀伟等 . 酶固定化研究进展 .化工技术 经济 .2003, 第 21 卷 ( 第 4 期 ), 全文 . Lou WY et al.Efficient kinetic resolution of (R,S)-1-trimethylsilylethanol via lipase-mediated enantioselective acylation in ionic liquids.Chirality .2006, 第 18 卷 ( 第 10 期 ), 全文 . Lou WY et al.Efficient enantioselective hydrolysis of D,L-phen。

3、ylglycine methyl ester catalyzed by immobilized Candida antarctica lipase B in ionic liquid containing systems.J Biotechnol .2006, 第 125 卷 ( 第 1 期 ), 全文 . 蒲小聪等 . 溶胶 - 凝胶法固定脂肪酶的方法 研究 .应用化工 .2008,( 第 10 期 ), 全文 . (54) 发明名称 采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固定化脂肪 酶的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种采用甲基丙烯酰氧丙基 凝胶制备固定化脂肪酶的方法。包括如下步骤 ： 1) 加。

4、入 - 甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷、 - 甲基丙烯酰氧丙基三乙氧基硅烷或 - 甲基 丙烯酰氧丙基甲基二甲氧基硅烷与正硅酸甲酯或 正硅酸乙酯， 搅拌混合， 加入去离子水和酸或碱催 化剂， 搅拌， 得到均匀的溶胶 ； 2) 向溶胶中加入缓 冲液， 缓冲液含有 0.005-0.04g/ml 溶胶的脂肪 酶， 缓冲液的用量为 0.5 1ml， 搅拌 ； 3) 静置老 化， 真空干燥， 研磨， 得到固定化脂肪酶。本发明 操作过程简便易行， 所制备的多种固定化脂肪酶 其酶活力较游离酶均有明显提高， 其中， 固定化的 Arthrobacter sp.脂肪酶的水解活力为游离酶的 11 倍。 (51)Int.。

5、Cl. (56)对比文件 审查员 易方方 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 CN 101514338 B1/1 页 2 1. 一种采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固定化脂肪酶的方法， 其特征在于它的步骤如 下 ： 1) 加入摩尔比为 3 1 1 3， 总摩尔数为 4mmol 的 - 甲基丙烯酰氧丙基三甲 氧基硅烷、 - 甲基丙烯酰氧丙基三乙氧基硅烷或 - 甲基丙烯酰氧丙基甲基二甲氧基硅 烷与正硅酸甲酯或正硅酸乙酯， 在 200 300rpm 下搅拌混合， 加入 0.5ml 的去离子水和 30-50l 的 0.1M 的酸或碱催化。

6、剂， 0-25下继续搅拌 30 60min， 得到均匀的溶胶 ； 2) 向溶胶中加入 pH 为 7.0 9.0， 浓度为 0.03 0.06M 的缓冲液， 缓冲液含有 0.005-0.04g/ml 溶胶的脂肪酶， 缓冲液的用量为 0.5 1ml， 继续搅拌 10 30min 后， 在 100 150rpm 搅拌 1 2h ； 3) 在 4 10下静置老化 12 24h， 于 30 35真空干燥 3-7 天， 研磨， 得到固定化 脂肪酶。 2. 根据权利要求 1 所述的一种采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固定化脂肪酶的方法， 其特征在于所述的脂肪酶为 Candida rugosa、 Candida 。

7、antarctica、 Arthrobacter sp.、 Mucor miehei 或 Candida lipolytica 脂肪酶。 3. 根据权利要求 1 所述的一种采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固定化脂肪酶的方法， 其特征在于所述的酸催化剂为盐酸、 硫酸或硝酸。 4. 根据权利要求 1 所述的一种采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固定化脂肪酶的方法， 其特征在于所述的碱催化剂为氢氧化钠或氨水。 权 利 要 求 书 CN 101514338 B1/5 页 3 采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固定化脂肪酶的方法 技术领域 0001 本发明涉及酶的固定化方法， 尤其涉及一种采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固。

8、定 化脂肪酶的方法。 背景技术 0002 脂肪酶 (E.C.3.1.1.3) 是一种水解酶， 它能够特异性地在油水界面上发挥催化 活性， 并且反应条件温和， 催化稳定性高、 区域和立体选择性强， 因此被广泛应用于有机合 成及光学化合物的手性拆分中。然而， 酶在实际应用过程中往往难于回收利用， 并且重复 利用性较差， 这样不仅降低了酶的使用效率， 提高了生产成本， 且难以实现连续化工业操 作。将酶进行固定化通常是解决上述问题的一种有效途径。酶进行固定化后， 不仅有望 提高其活性， 而且便于酶的回收利用及产物的分离纯化， 使得连续化工业生产成为可能。 目前常用的酶固定化方法均可用于脂肪酶的固定化，。

9、 例如 ： 吸附法、 共价结合法以及包埋 法。吸附法所制备的固定化酶通常酶活损失少， 但重复利用性较差 ； 共价结合法是提高 酶稳定性的一种较好途径， 然而该法制备过程不够温和， 因此酶活损失较大。自九十年代 初开始， 不断有学者证明， 溶胶凝胶包埋法能够被广泛应用于包埋生物活性物质， 例如碱 性磷酸酶、 壳多糖酶、 天冬氨酸酶、 - 葡萄糖酰化酶以及细胞色素 c 和肌红蛋白， 并能较 大程度上保存其原有的活性 (Braun S.et al.Materlett(1990)10:1-8 ； Ellerby L.M.et al.Science， (1992)255 ： 1113-1115)。该法一。

10、般是用含高化学活性组分的化合物作前驱 体 ( 如 TEOS 等 )， 在液相下将这些原料均匀混合， 并进行水解、 缩合化学反应， 在溶液中形 成稳定的透明溶胶体系， 溶胶经陈化、 聚合后， 形成三维空间网络结构的凝胶。采用这种 方法包埋生物分子， 具有适用范围广、 生物活性物质活性和稳定性高， 以及材料性质 ( 如 孔径等 ) 可控等优点。然而， 奇怪的是， 当采用上述方法对脂肪酶进行固定化时， 其活力 回收往往很低 (5 )。直到 1995 年， Manfred T.Reetz 等人发现， 只有采用疏水性的 硅烷前驱体包埋脂肪酶时， 才能获得高活力的固定化酶 (ManfrenT.R.et a。

11、l.Biotechnol Bioeng(1996)49 ： 527-534)， 其原因是由于脂肪酶是一种界面催化酶， 在疏水界面上有利 于其活性构象的获得和保持。采用带有疏水烷基链的硅烷试剂包埋脂肪酶时， 其比活力 往往可以提高几倍以上。自此， 多种疏水性的凝胶材料被广泛应用于包埋脂肪酶， 例如甲 基三甲氧基硅烷、 丙基三甲氧基硅烷、 丁基三甲氧基硅烷、 辛基三甲氧基硅烷等 (Jyp-Ping Chen ； Wei-Shin Lin.Enzyme MicrobTechnol(2003)32 ： 801-811 ； Pedro Vidinha et al.J Biotechnol121(2006。

12、)23-33)。然而， 到目前为止， 已报道的凝胶前驱体多为直链的烷烃 类有机硅烷试剂， 即 CnH2n-1Si(OCH3)3或 CnH2n-1Si(OC2H5)3， n 1-12。同时， 有文献报道， 包埋酶的活力随着烷基链的增加而增加， 然而， 当烷基链的碳原子数大于 8 时， 所得到 的凝胶酶往往会出现孔塌陷现象， 影响酶的性质 (Pedro Vidinhaet al.J Biotechnol 121(2006)23-33)。由于硅烷化试剂中的有机官能团的性质直接影响和改变凝胶材料的性 质以及酶蛋白分子的构象， 因此， 尝试新型的有机硅烷化试剂有望进一步提高固定化脂肪 酶的性能。 说 明。

13、 书 CN 101514338 B2/5 页 4 发明内容 0003 本发明的目的是克服现有技术的不足， 提供一种采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备 固定化脂肪酶的方法。 0004 采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固定化脂肪酶的方法包括如下步骤 ： 0005 1) 加入摩尔比为 3 1 1 3， 总摩尔数为 4mmol 的 - 甲基丙烯酰氧丙基三 甲氧基硅烷、 - 甲基丙烯酰氧丙基三乙氧基硅烷或 - 甲基丙烯酰氧丙基甲基二甲氧基 硅烷与正硅酸甲酯或正硅酸乙酯， 在 200 300rpm 下搅拌混合， 加入 0.5ml 的去离子水和 30-50l 的 0.1mol/l 的酸或碱催化剂， 0-25下继续搅拌。

14、 30 60min， 得到均匀的溶胶 ； 0006 2) 向溶胶中加入 pH 为 7.0 9.0， 浓度为 0.03 0.06M 的缓冲液， 缓冲液含有 0.005-0.04g/ml 溶胶的脂肪酶， 缓冲液的用量为 0.5 1ml， 继续搅拌 10 30min 后， 在 100 150rpm 搅拌 1 2h ； 0007 3) 在 4 10下静置老化 12 24h， 于 30 35真空干燥 3-7 天， 研磨， 得到固 定化脂肪酶。 0008 所述的脂肪酶为Candida rugosa、 Candida antarctica、 Arthrobacter sp.、 Mucor miehei 或 。

15、Candida lipolytica 脂肪酶。酸催化剂为盐酸、 硫酸或硝酸。碱催化剂为氢氧化 钠或氨水 0009 本发明操作过程简便易行， 所制备的多种固定化脂肪酶其酶活力较游离酶均有明 显提高， 其中， 固定化的 Arthrobacter sp. 脂肪酶的水解活力为游离酶的 11 倍。 0010 图 1 是溶胶凝胶过程原理示意图。 0011 具体实施方式 0012 本发明所制备的固定化脂肪酶及游离脂肪酶的酶活力测定采用标准的 p-NPP( 对 硝基苯酚棕榈酸酯 ) 为底物的酯水解反应为模型反应。具体测定方法为 ： 将 75l p-NPP 的异丙醇溶液 (3mg/ml) 加入 1.35ml 的。

16、磷酸缓冲液 (pH7.5， 50mM) 中， 混合均匀后， 向其中 加入0.2mg游离酶粉或者2mg上述固定化酶起始反应。 采用分光光度法， 在410nm的波长条 件下分别于不同时刻测定上述反应液的吸光变化， 根据吸光值计算酶的水解活力。以 35 下每分钟催化产生 1mol p-NP( 对硝基苯酚 ) 所需的酶量 ( 或固定化酶量 ) 为一个酶活 力单位 (U， molmin-1g-1)。 0013 本发明的反应方程式为 0014 说 明 书 CN 101514338 B3/5 页 5 0015 实施例 1 0016 1) 加入摩尔比为 3 1， 总摩尔数为 4mmol 的 - 甲基丙烯酰氧丙。

17、基三甲氧基硅 烷与正硅酸甲酯， 在 200rpm 下搅拌混合， 加入 0.5ml 的去离子水和 30l 的 0.1mol/l 的盐 酸催化剂， 0下继续搅拌 30min， 得到均匀的溶胶 ； 0017 2) 向溶胶中加入 pH 为 7.0， 浓度为 0.03M 的缓冲液， 缓冲液含有 0.005g/ml 溶胶 的脂肪酶 (Arthrobacter sp.)， 缓冲液的用量为 0.5ml， 继续搅拌 10min 后， 在 100rpm 搅拌 1h ； 0018 3) 在 4下静置老化 12h， 于 30真空干燥 3 天， 研磨， 得到固定化脂肪酶 1#。 0019 以 - 甲基丙烯酰氧丙基三甲氧。

18、基硅烷与正硅酸甲酯的混合物为前驱体， 采用溶 胶凝胶技术制备固定化的脂肪酶。其原理示意图如图 1 所示。 0020 实施例 2 0021 1) 加入摩尔比为 1 3， 总摩尔数为 4mmol 的 - 甲基丙烯酰氧丙基三乙氧基硅 烷与正硅酸乙酯， 在 300rpm 下搅拌混合， 加入 0.5ml 的去离子水和 50l 的 0.1mol/l 的氢 氧化钠催化剂， 25下继续搅拌 60min， 得到均匀的溶胶 ； 0022 2)向溶胶中加入pH为9.0， 浓度为0.06M的缓冲液， 缓冲液含有0.04g/ml 溶胶的 脂肪酶 (Arthrobacter sp.)， 缓冲液的用量为 1ml， 继续搅拌。

19、 30min 后， 在 150rpm 搅拌 2h ； 0023 3) 在 10下静置老化 24h， 于 35真空干燥 7 天， 研磨， 得到固定化脂肪酶 2#。 0024 实施例 3 0025 将 - 甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的混合物 (4mmol， 摩尔比为 1/1)， 0.5ml的去离子水， 50l/ml溶胶的0.1mol/l的盐酸溶液混合， 并在250rpm， 0条件 搅拌30min， 形成均匀的溶胶。 然后向溶胶中加入含有0.01g/ml溶胶的酶粉(Arthrobacter sp.) 的缓冲液 (0.03M， pH8.0)， 缓冲液的用量为 1ml。该混合液搅拌 10m。

20、in 后， 在 100rpm 条 件下继续搅拌 1h。然后该混合物在 4条件下静置老化过夜。最后， 于 35条件下真空干 燥 7 天， 研磨后得包埋固定化脂肪酶 3#。固定化酶的比活力为游离酶的 11 倍。 0026 实施例 4 0027 将 - 甲基丙烯酰氧丙基三乙氧基硅烷与正硅酸乙酯的混合物 (4mmol， 摩尔比 为 3/1)， 0.5ml 的去离子水， 30l/ml 溶胶的 0.1mol/l 的硫酸溶液混合， 并在 250rpm， 0条件搅拌 30min， 形成均匀的溶胶。然后向溶胶中加入含有 0.005g/ml 溶胶的酶粉 说 明 书 CN 101514338 B4/5 页 6 (A。

21、rthrobacter sp.) 的缓冲液 (0.03M， pH8.0)， 缓冲液的用量为 1ml。该混合液搅拌 10min 后， 在100rpm条件下继续搅拌1h。 然后该混合物在4条件下静置老化过夜。 最后， 于35 条件下真空干燥7天， 研磨后得包埋固定化脂肪酶4#。 固定化酶的比活力为游离酶的9倍。 0028 实施例 5 0029 将 - 甲基丙烯酰氧丙基甲基三甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的混合物 (4mmol， 摩尔 比为 1/1)， 0.5ml 的去离子水， 50l/ml 溶胶的 0.1mol/l 的硝酸溶液混合， 并在 250rpm， 0条件搅拌 30min， 形成均匀的溶胶。然后向溶。

22、胶中加入含有 0.04g/ml 溶胶的酶粉 (Arthrobacter sp.) 的缓冲液 (0.03M， pH7.0)， 缓冲液的用量为 1ml。该混合液搅拌 10min 后， 在100rpm条件下继续搅拌1h。 然后该混合物在4条件下静置老化过夜。 最后， 于35 条件下真空干燥7天， 研磨后得包埋固定化脂肪酶5#。 固定化酶的比活力为游离酶的8倍。 0030 实施例 6 0031 将 - 甲基丙烯酰氧丙基甲基二甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的混合物 (4mmol， 摩尔 比为 1/1)， 0.5ml 的去离子水， 50l/ml 溶胶的 0.1mol/l 的盐酸溶液混合， 并在 250rpm， 0。

23、条件搅拌 30min， 形成均匀的溶胶。然后向溶胶中加入含有 0.02g/ml 溶胶的酶粉 (Arthrobacter sp.) 的缓冲液 (0.03M， pH8.0)， 缓冲液的用量为 1ml。该混合液搅拌 10min 后， 在100rpm条件下继续搅拌1h。 然后该混合物在4条件下静置老化过夜。 最后， 于35 条件下真空干燥 7 天， 研磨后得包埋固定化脂肪酶 6#。固定化酶的比活力为游离酶的 7.5 倍。 0032 实施例 7 0033 将 - 甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的混合物 (4mmol， 摩尔比为 1/3)， 0.5ml的去离子水， 50l/ml溶胶的0.1mol。

24、/l的氨水溶液混合， 并在250rpm， 0条件 搅拌30min， 形成均匀的溶胶。 然后向溶胶中加入含有0.03g/ml溶胶的酶粉(Arthrobacter sp.) 的缓冲液 (0.03M， pH8.0)， 缓冲液的用量为 1ml。该混合液搅拌 10min 后， 在 100rpm 条 件下继续搅拌 1h。然后该混合物在 4条件下静置老化过夜。最后， 于 35条件下真空干 燥 5 天， 研磨后得包埋固定化脂肪酶 7#。固定化酶的比活力为游离酶的 6 倍。 0034 实施例 8 0035 将 - 甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与正硅酸乙酯的混合物 (4mmol， 摩尔比为 1/1)， 0.5ml。

25、 的去离子水， 50l/ml 溶胶的 0.1mol/l 的氢氧化钠溶液混合， 并在 250rpm， 0条件搅拌 30min， 形成均匀的溶胶。然后向溶胶中加入含有 0.03g/ml 溶胶的酶粉 (Arthrobacter sp.) 的缓冲液 (0.03M， pH9.0)， 缓冲液的用量为 1ml。该混合液搅拌 10min 后， 在100rpm条件下继续搅拌1h。 然后该混合物在4条件下静置老化过夜。 最后， 于35 条件下真空干燥7天， 研磨后得包埋固定化脂肪酶8#。 固定化酶的比活力为游离酶的6倍。 0036 实施例 9 0037 将 - 甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的混合物 (。

26、4mmol， 摩尔比为 1/1)， 0.5ml 的去离子水， 50l/ml 溶胶的 0.1mol/l 的盐酸溶液混合， 并在 250rpm， 0条 件搅拌 30min， 形成均匀的溶胶。然后向溶胶中加入含有 0.01g/ml 溶胶的酶粉 (Candida rugosa)的缓冲液(0.03M， pH7.5)， 缓冲液的用量为1ml。 该混合液搅拌10min后， 在100rpm 条件下继续搅拌 1h。然后该混合物在 4条件下静置老化过夜。最后， 于 35条件下真空 干燥 7 天， 研磨后得包埋固定化脂肪酶 9#。固定化酶的比活力为游离酶的 10 倍。 说 明 书 CN 101514338 B5/5。

27、 页 7 0038 实施例 10 0039 将 - 甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的混合物 (4mmol， 摩尔比为 1/1)， 0.5ml 的去离子水， 50l/ml 溶胶的 0.1mol/l 的盐酸溶液混合， 并在 250rpm， 0条 件搅拌 30min， 形成均匀的溶胶。然后向溶胶中加入含有 0.01g/ml 溶胶的酶粉 (Candida antarctica) 的缓冲液 (0.03M， pH7.5)， 缓冲液的用量为 1ml。该混合液搅拌 10min 后， 在 100rpm 条件下继续搅拌 1h。然后该混合物在 4条件下静置老化过夜。最后， 于 35条件 下真空干燥 7 天。

28、， 研磨后得包埋固定化脂肪酶 10#。固定化酶的比活力为游离酶的 6 倍。 0040 实施例 11 0041 将 - 甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的混合物 (4mmol， 摩尔比 为 1/1)， 0.5ml 的去离子水， 50l/ml 溶胶的 0.1mol/l 的盐酸溶液混合， 并在 250rpm， 0 条件搅拌 30min， 形成均匀的溶胶。然后向溶胶中加入含有 0.01g/ml 溶胶的酶粉 (Mucor miehei)的缓冲液(0.03M， pH7.0)， 缓冲液的用量为1ml。 该混合液搅拌10min后， 在100rpm 条件下继续搅拌 1h。然后该混合物在 4条件下静置老化。

29、过夜。最后， 于 35条件下真空 干燥 7 天， 研磨后得包埋固定化脂肪酶 11#。固定化酶的比活力为游离酶的 10 倍。 0042 实施例 12 0043 将 - 甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的混合物 (4mmol， 摩尔比为 1/1)， 0.5ml 的去离子水， 50l/ml 溶胶的 0.1mol/l 的盐酸溶液混合， 并在 250rpm， 0条 件搅拌 30min， 形成均匀的溶胶。然后向溶胶中加入含有 0.01g/ml 溶胶的酶粉 (Candida lipolytica) 的缓冲液 (0.03M， pH7.5)， 缓冲液的用量为 1ml。该混合液搅拌 10min 后， 在 100rpm 条件下继续搅拌 1h。然后该混合物在 4条件下静置老化过夜。最后， 于 35条件 下真空干燥 7 天， 研磨后得包埋固定化脂肪酶 12#。固定化酶的比活力为游离酶的 8 倍。 0044 表 1 溶胶凝胶法包埋多种脂肪酶的活力及比活力 0045 说 明 书 CN 101514338 B1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 。