技术领域
本发明涉及细胞工程和组织工程领域中一种细胞生长促进剂，特别涉及一种真 核细胞生长促进剂。
背景技术
近年来随着细胞生物学、分子生物学、生物材料以及移植免疫学、临床医学等 相关学科的发展，各种领域取得的成果和技术不断交叉、融合和相互渗透，逐渐形 成了一门新的学科——组织工程学(Fishman J.How to build a body part.Time， 1999，153(8)：54-55；Cowley G，Underwood A.Replacement parts.Newsweek， 1997，129(4)：66-69；Stix G.Growing a new field.Scientific American，1997， 277(4)：15-16)。
组织工程(Tissue Engineering)一词最早是由美国国家科学基金委员会正式提 出和确定的。其基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种具有 优良细胞相容性并可以被机体降解吸收的生物材料上面形成复合物，然后将细胞， 生物材料复合物植入人体组织、器官的病损部位，在作为细胞生长支架的生物材料 逐渐被机体降解吸收的同时，细胞不断增殖、分化，形成新的并且其形态、功能方 面与相应组织、器官一致的组织，从而达到修复创伤和重建功能的目的(Langer R， Vacanti J P.Artificial organs.Scientific American，1995，273(3)：130-133； Keith T，Cima L G，Yaremchuk，et al.Injectable cartilage.Plast Reconstr Surg，1995，96(6)：1390-1398；Schultz O，Keuszer G，Zacher J，et al. Arithritis Rheum，1997；40(8)：1420-1433.)。
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是很多细菌在特定条件下合成的一种细菌胞内高分子 聚酯(Chen GQ，Wu Q，Zhao K，Yu HP&Chan A.Chinese J of Polymer Science 18(2000)389-396)，是新发现的细菌的生物能量来源之一，具有非常优良的性 质，其生物可降解性、生物可相容性等特性已引起了学术界，特别是生物医学界的 浓厚兴趣(Deng Y，Zhao K，Zhang XF，Hu P，Chen GQ.Biomaterials 23(20)(2002) 4049-4056；Zheng Z，Deng Y，Lin XS，Zhang LX，Chen GQ.J Biomater Sci.Polymer Edn 14(2003)615-624)。其在药物缓释材料、可植入人体生物材料等高附加值 方面的应用开发正在全球范围内展开，在人工器官，整形外科，创伤.愈合上的应 用前景尤其广阔(Deng Y，Lin XS，Zheng Z，Deng JG，Chen JC，Ma H，Chen GQ. Biomaterials 24(2003)4273-4281；Wang YW，Chen GQ，Wu Q.Biomaterials 24 (2003)4621-4629)。
PHA在其生物降解过程中释放出寡聚PHA(OHA)和3-羟基脂肪酸(HA)单体， 如，3-羟基丁酸(HB)及其寡聚物(OHB)、3-羟基戊酸(HV)及其寡聚物(OHV)，3-羟基 己酸(HHx)及其寡聚物(OHHx)，3-羟基癸酸(HD)及其寡聚物(OHD)。研究表明，高等 动物的细胞器和胞浆里面也存在着OHA(寡聚PHA)，与钙离子通道和DNA转运等有 关。实验结果表明OHB在人工模拟的平面脂双层中形成非选择性离子通道，可以运 输钙离子通过囊泡的双层膜。在初步研究中，PHA、OHA与蛋白等的复合物被认为与 人类的两种主要疾病动脉硬化和糖尿病有关(Reusch RN，Sadoff HL.Proc Natl Acad Sci USA 1988；85(12)：4176-80)。
发明创造内容
本发明发明人的研究表明，寡聚3-羟基脂肪酸和/或其单体3-羟基脂肪酸具有 促进真核细胞生长的作用，可以用作真核细胞生长促进剂。
寡聚3-羟基脂肪酸及其单体的化学结构式如下：
其中，R为由一至十个碳组成的直链或侧链的烷基，n为1-1000的自然数。在 实际应用中，R优选为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基或庚基；n优选为1-200 的自然数。
所制备的真核细胞生长促进剂的活性成分也可以是寡聚3-羟基脂肪酸和/或其 单体3-羟基脂肪酸的盐类。
当R＝甲基时，寡聚3-羟基脂肪酸单体为3-羟基丁酸(3-hydroxybutyrate或 HB)；R＝乙基时，寡聚3-羟基脂肪酸单体为3-羟基戊酸(3-hydroxyvalerate或 HV)；R＝丙基时，寡聚3-羟基脂肪酸单体为3-羟基己酸(3-hydroxyhexanoate或 HHx)；R＝丁基时，寡聚3-羟基脂肪酸单体为3-羟基庚酸(3-hydroxyheptanoate 或HHp)；R＝戊基时，寡聚3-羟基脂肪酸单体为3-羟基辛酸(3-hydroxyoctanoate 或HO)；R＝己基时，寡聚3-羟基脂肪酸单体为3-羟基壬酸(3-hydroxynonanoate 或HN)；R＝庚基时，寡聚3-羟基脂肪酸单体为3-羟基癸酸(3-hydroxydecanoate 或HD)。
所述寡聚3-羟基脂肪酸的单体及3-羟基脂肪酸可以是单一立体结构的化合物， 如R型，或S型，甚至可以是R和S型的混合物，也可为外消旋结构的化合物。寡 聚3-羟基脂肪酸包括寡聚的3-羟基丁酸、3-羟基戊酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸、 3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸的单纯寡聚物或共聚寡聚物，也包括这些寡 聚物的混合物。所述3-羟基脂肪酸可为3-羟基丁酸、3-羟基戊酸、3-羟基己酸、 3-羟基庚酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸，也可为这些酸的混合物。所 述真核细胞为成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、皮肤细胞、血管上皮 细胞、造血干细胞、肝细胞、淋巴细胞、角膜上皮细胞、肾细胞等。
上述真核细胞生长促进剂可促进体外培养的组织器官，如成纤维组织、腺体、 肺、卵巢、神经、骨组织、脑组织、血管、肝、肾的生长。
上述寡聚3-羟基脂肪酸及其单体3-羟基脂肪酸可以通过水解或酶解以及基因 工程微生物发酵方法来获得(席建忠.微生物方法合成手性羟基脂肪酸.清华大学硕 士论文(2000)；Gao HJ，Wu Q，Chen GQ.FEMS Microbiol Lett 213(2002)59-65； Zhao K，Tian G，Zheng Z，Chen JC，Chen GQ.FEMS Microbiol Lett 218(2003) 59-64；Zheng Z，Zhang MJ，Zhang G and Chen GQ.Antonie van Leeuwenhoek(2004) in press)。可通过液相色谱检测寡聚3-羟基脂肪酸的纯度。
本发明的真核细胞生长促进剂的使用浓度为0.001-0.1g/L培养基。实验证明， 本发明的真核细胞生长促进剂在一定范围内随着浓度的升高，细胞的生长量也在提 高，但过高的浓度并不能使细胞的生长量持续增加，并且对细胞系和原代细胞表现 出了同样的促生长作用效果，而且具有成本低的优点，可广泛应用于细胞工程和组 织工程以及真核细胞和组织器官的体外培养。
附图说明
图1a为不同浓度3-羟基丁酸真核细胞生长促进剂对成纤维细胞L929生长的影 响柱状图。
图1b为不同浓度R型3-(R)-羟基丁酸作为真核细胞生长促进剂对成纤维细胞 L929生长的影响柱状图。
图2a为不同浓度3-羟基丁酸真核细胞生长促进剂对乳兔膝关节软骨细胞生长 的影响柱状图。
图2b为不同浓度3-(R)-羟基丁酸作为真核细胞生长促进剂对乳兔膝关节软骨 细胞生长的影响柱状图。
图3a为不同浓度3-羟基丁酸真核细胞生长促进剂对人血管内皮细胞生长的影 响柱状图。
图3b为不同浓度3-(R)-羟基丁酸真核细胞生长促进剂对人血管内皮细胞生长 的影响柱状图。
具体实施方式
下述实施例中的R表示旋光性，不是取代基。
实施例1、外消旋3-羟基丁酸(HB)真核细胞生长促进剂和光活性的3-(R)- 羟基丁酸(3-(R)-HB)真核细胞生长促进剂对成纤维细胞L929增殖的影响
细胞系：成纤维细胞L929(购于中国预防医学科学院病毒研究所)。
培养基：DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(GIBCO)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-天冬酰胺酸，4.766g/L Hepes(二羟乙基呱嗪乙烷磺酸)， 2g/L NaHCO3，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，10％胎牛血清(三利)。
无血清培养基：DMEM(GIBCO)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-天冬酰胺 酸，4.766g/L Hepes，2g/L NaHCO3，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素。
消化液：DMEM(GIBCO)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-天冬酰胺酸，4.766g/L Hepes，2g/L NaHCO3，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，0.2％胰蛋白酶。
冲洗液：PBS缓冲液(8.0g/L氯化钠、0.20g/L氯化钾、1.44g/L磷酸氢二钠、 0.24g/L磷酸二氢钾)，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素。
MTT(Thiazolyl blue)染液：5mg/ml(5mg MTT溶于1ml PBS)。
裂解液：DMSO(二甲基亚砜)
外消旋3-羟基丁酸HB真核细胞生长促进剂：由外消旋3-羟基丁酸钠(购自 Sigma公司)单一成分组成。
3-(R)-羟基丁酸((R)HB)真核细胞生长促进剂：由3-(R)-HB或3-(R)- 羟基丁酸钠(购自Sigma公司)单一成分组成。
上述两种真核细胞生长促进剂的添加浓度均分别为：0.005g/L，0.01g/L，0.02 g/L，0.05g/L，0.1g/L。
培养条件：37℃，5％CO2恒温培养箱，接种量为104个/孔(24孔板)
用MTT法测定细胞的生长量：
1)染色：细胞在24孔板中培养一定时间后，取出样品，吸去培养液，每孔加 入0.5ml无菌的PBS(PH＝7.4)荡洗3次。再加入0.1ml MTT染液和1ml不含血清 的培养基，置于培养箱中保存4小时。
2)吸去上清，加入1ml DMSO，室温下放置30分钟，使颜色颗粒充分溶解。
3)取0.2ml待测液加入到96孔酶标板中，酶标仪550nm下测定吸光度值。
结果如图1a和图1b所示，表明在添加了内消旋3-羟基丁酸(HB)3-羟基丁 酸真核细胞生长促进剂、或者3-(R)-羟基丁酸真核细胞生长促进剂的作用组中，均 产生一定的细胞生长促进作用，二者的最佳添加浓度分别为0.05g/L，0.01g/L， 对细胞的生长增加量分别达到了98.5±1.5％和50.3±2.6％。
实施例2、3-羟基丁酸(HB)真核细胞生长促进剂和3-(R)-羟基丁酸(3-(R) -HB)真核细胞生长促进剂对乳兔膝关节软骨细胞增殖的影响
传代细胞：乳兔膝关节软骨细胞
培养基：DMEM(GIBCO)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-天冬酰氨酸， 4.766g/L Hepes，2g/L NaHCO3，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，10％胎牛 血清(三利)
无血清培养基：DMEM(GIBCO)，216mg/L L-谷氨酰胺，36mg/L L-a天冬酰 氨酸，4.766g/L Hepes，2g/L NaHCO3，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素
消化液：DMEM(GIBCO)，0.125％胰蛋白酶，0.02％EDTA，100mg/L青霉 素，100mg/L链霉素
冲洗液：PBS，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素
MTT染液：5mg/ml(5mg MTT溶于1ml PBS)
裂解液：DMSO
3-羟基丁酸(HB)真核细胞生长促进剂：由3-羟基丁酸钠(购自Sigma公司) 单一成分组成。
3-(R)-羟基丁酸真核细胞生长促进剂：由3-(R)-HB或3-(R)-羟基丁酸钠 (购自Sigma公司)单一成分组成。
上述两种真核细胞生长促进剂的添加浓度均分别为：0.005g/L，0.01g/L，0.02 g/L，0.05g/L，0.1g/L。
培养条件与MTT法同实施例1。结果如图2a和图2b所示，表明在添加了3- 羟基丁酸真核细胞生长促进剂、或者3-(R)-羟基丁酸真核细胞生长促进剂的作用组 中，均产生一定的细胞生长促进作用，二者的最佳添加浓度分别为0.05g/L，0.005 g/L，对细胞的生长增加量分别达到了66.5±1.4％和28.4±1.6％。
实施例3、3-羟基丁酸(HB)真核细胞生长促进剂和3-(R)-羟基丁酸(3-(R) -HB)真核细胞生长促进剂对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响
传代细胞：人脐静脉血管内皮细胞
原代培养基：M199(GIBCO)，2.3g/L NaHCO3，15mmol/L HEPES，2mg/L ECGF， 5mg/L肝素，2mmol/L L-Gln，1mmol/L丙酮酸钠，100mg/L青霉素，100mg/L 链霉素，20％胎牛血清(三利)。
继代培养基：M199(GIBCO)，2.3g/LNaHCO3，15mmol/L HEPES，2mg/L ECGF， 5mg/L肝素，2mmol/L L-Gln，1mmol/L丙酮酸钠，100mg/L青霉素，100mg/L 链霉素，15％胎牛血清(三利)。
无血清培养基：M199(GIBCO)，2.3g/LNaHCO3，15mmol/L HEPES，2mg/L ECGF， 5mg/L肝素，2mmol/L L-Gln，1mmol/L丙酮酸钠，100mg/L青霉素，100mg/L 链霉素。
冲洗液：PBS，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素
消化液：PBS，0.125％胰蛋白酶，0.02％EDTA，100mg/L青霉素，100mg/L 链霉素
终止液：PBS，5％胎牛血清(三利)
MTT染液：5mg/ml(5mg MTT溶于1ml PBS)
裂解液：DMSO
3-羟基丁酸(HB)真核细胞生长促进剂：由3-羟基丁酸钠(购自Sigma公司) 单一成分组成。
3-(R)-羟基丁酸((R)HB)真核细胞生长促进剂：由3-(R)-HB或3-(R)- 羟基丁酸钠(购自Sigma公司)单一成分组成。
上述两种真核细胞生长促进剂的添加浓度均分别为：0.005g/L，0.01g/L，0.02 g/L，0.05g/L，0.1g/L。培养条件与MTT法同实施例1。结果如图3a和图3b所示， 表明在添加了3-羟基丁酸真核细胞生长促进剂、或者3-(R)-羟基丁酸真核细胞生 长促进剂的作用组中，均产生一定的细胞生长促进作用，二者的最佳添加浓度分别 为0.05g/L，0.01g/L，对细胞的生长增加量分别达到了57±1.6％和31.6±1.8％。
实施例4、3-羟基戊酸(HV)真核细胞生长促进剂、3-(R)-羟基戊酸((R)HV) 真核细胞生长促进剂及寡聚物OHV真核细胞生长促进剂对人脐静脉血管内皮细胞增 殖的影响
传代细胞：人脐静脉血管内皮细胞
3-羟基戊酸(HV)真核细胞生长促进剂：由3-羟基戊酸(HV)单一成分组成。
3-(R)-羟基戊酸((R)HV)真核细胞生长促进剂：由3-(R)-羟基戊酸((R)HV) 单一成分组成。
寡聚物OHV真核细胞生长促进剂：由寡聚物OHV单一成分组成。
其中，3-羟基戊酸(HV)、或者3-(R)-羟基戊酸((R)HV)、或者其寡聚物OHV 由嗜水假单胞菌Aeromonas hydrophila在十一酸中合成聚3-羟基戊酸PHV，在酸 性或碱性水解PHV得到。具体方法参照文献：D Seebach，M G Fritz.International Journal of Biological Macromolecules 25(1999)217-236。其中，嗜水假单胞菌 Aeromonas hydrophila购自中国科学院微生物菌种保藏中心。
上述三种真核细胞生长促进剂的添加浓度均分别为：0.005g/L，0.01g/L，0.02 g/L，0.05g/L，0.1g/L。
培养方法、条件与MTT法同实施例1。实验结果表明在添加了3-羟基戊酸(HV) 真核细胞生长促进剂、3-(R)-羟基戊酸(R)HV真核细胞生长促进剂、寡聚物OHV真 核细胞生长促进剂的作用组中，均产生一定的细胞生长促进作用，三者的最佳添加 浓度分别为0.05g/L，0.01g/L，0.04g/L，对细胞的生长增加量分别达到了48±1.5 ％、24±2.5％、45±2.1％。
实施例5、3-羟基己酸(HHx)真核细胞生长促进剂、3-(R)-羟基己酸((R)HHx) 真核细胞生长促进剂及寡聚物(OHHx)真核细胞生长促进剂对成纤维细胞L929增殖 的影响
细胞系：成纤维细胞L929(购于中国预防医学科学院病毒研究所)
培养方法同实施例1。
3-羟基己酸(HHx)真核细胞生长促进剂：由3-羟基己酸(HHx)(购自Sigma 公司)单一成分组成。
3-(R)-羟基己酸((R)HHx)真核细胞生长促进剂：由3-(R)-羟基己酸((R)HHx) (购自Sigma公司)单一成分组成。
寡聚3-(R)-羟基己酸(OHHx)真核细胞生长促进剂：由寡聚3-(R)-羟基己酸 (OHHx)单一成分组成。
其中，寡聚3-(R)-羟基己酸(OHHx)由嗜水假单胞菌Aeromonas hydrophila在 月桂酸中生长合成3-(R)-羟基丁酸HB和3-(R)-羟基己酸共聚物PHBHHx，在酸性或 碱性水解PHBHHx得到，具体方法参照文献：D Seebach，M G Fritz.International Journal of Biological Macromolecules 25(1999)217-236。其中，嗜水假单胞菌 Aeromonas hydrophila购自中国科学院微生物菌种保藏中心。
上述三种真核细胞生长促进剂的添加浓度均分别为：0.005g/L，0.01g/L，0.02 g/L，0.05g/L，0.1g/L。
培养条件与MTT法同实施例1。实验结果表明在添加了3-羟基己酸(HHx)真 核细胞生长促进剂、3-(R)-羟基己酸((R)HHx)真核细胞生长促进剂及寡聚物(OHHx) 真核细胞生长促进剂的作用组中，均产生一定的细胞生长促进作用，最佳添加浓度 分别为0.05g/L，0.01g/L，0.03g/L，对细胞的生长增加量分别达到了32±2.4 ％、29±2.6％、68±1.9％。
实施例6、3-羟基癸酸(HD)真核细胞生长促进剂、或者3-(R)-羟基癸酸((R)HD) 真核细胞生长促进剂及寡聚物OHD真核细胞生长促进剂对乳兔膝关节软骨细胞增殖 的影响
传代细胞：乳兔膝关节软骨细胞
3-羟基癸酸(HD)真核细胞生长促进剂：由3-羟基癸酸(HD)(购自Sigma 公司)单一成分组成。
3-(R)-羟基癸酸((R)HD)真核细胞生长促进剂：由3-(R)-羟基癸酸((R)HD)(购 自Sigma公司)单一成分组成。
寡聚物OHD真核细胞生长促进剂：由寡聚物OHD单一成分组成。
其中，寡聚物OHD由假单胞菌Pseudomonas stutzeri 1317在葡萄糖中生长合 成3-(R)-羟基辛酸HO和3-(R)-羟基癸酸共聚物PHOD，在酸性或碱性水解PHOD得 到。具体方法参照文献：D Seebach，M G Fritz.International Journal of Biological Macromolecules 25(1999)217-236。其中，假单胞菌Pseudomonas stutzeri 1317购自中国科学院微生物菌种保藏中心。
上述三种真核细胞生长促进剂的添加浓度均分别为：0.005g/L，0.01g/L，0.02 g/L，0.05g/L，0.1g/L。
培养方法同实施例2，培养条件与MTT法同实施例1。实验结果表明在添加了 3-羟基癸酸(HD)真核细胞生长促进剂、或者3-(R)-羟基癸酸((R)HD)真核细胞 生长促进剂及寡聚物OHD真核细胞生长促进剂的作用组中，均产生一定的细胞生长 促进作用，最佳添加浓度分别为0.02g/L，0.005g/L，0.02g/L，对细胞的生长增加 量分别达到了58±1.3％，26±1.7％，57±2.2％。
实施例7、3-(R)-羟基丁酸((R)HB)和3-(R)-羟基己酸((R)HHx)混合物真 核细胞生长促进剂及共聚寡聚物OHBHHx真核细胞生长促进剂对成纤维细胞L929增 殖的影响
细胞系：成纤维细胞L929(购于中国预防医学科学院病毒研究所)
培养方法同实施例1。
3-(R)-羟基丁酸((R)HB)和3-(R)-羟基己酸((R)HHx)混合物真核细胞生长 促进剂：由3-(R)-羟基丁酸((R)HB)和3-(R)-羟基己酸((R)HHx)(均购自Sigma 公司)混合而成(混合的质量比为50∶50)。
3-(R)-羟基丁酸((R)HB)和3-(R)-羟基己酸((R)HHx)共聚寡聚物OHBHHx 真核细胞生长促进剂：由3-(R)-羟基丁酸(R)HB和3-(R)-羟基己酸(R)HHx共聚寡 聚物OHBHHx单一成分组成。
其中，3-(R)-羟基丁酸((R)HB)和3-(R)-羟基己酸((R)HHx)共聚寡聚物 OHBHHx由嗜水假单胞菌Aeromonas hydrophila在月桂酸中生长合成3-(R)-羟基丁 酸HB和3-(R)-羟基己酸共聚物PHBHHx，在酸性或碱性水解PHBHHx得到。具体方法 参照文献：D Seebach，M G Fritz.International Journal of Biological Macromolecules 25(1999)217-236。其中，嗜水假单胞菌Aeromonas hydrophila 购自中国科学院微生物菌种保藏中心。
上述两种真核细胞生长促进剂的添加浓度均分别为：0.005g/L，0.01g/L，0.02 g/L，0.05g/L，0.1g/L。
培养条件与MTT法同实施例1。实验结果表明在添加了3-(R)-羟基丁酸((R)HB) 和3-(R)-羟基己酸((R)HHx)混合物真核细胞生长促进剂及寡聚物OHBHHx真核细 胞生长促进剂的作用组中，均产生一定的细胞生长促进作用，最佳添加浓度分别为 0.001g/L，0.01g/L，对细胞的生长增加量分别达到了30±2.2％、22±2.0％。