技术领域
本发明涉及一种化合物及其制备方法，尤其是一种具有抗炎、抗肿瘤、降糖降脂、抗菌等作用的化合物及其制备方法。
背景技术
当今，随着现代药理学、分子生物学等理论及相关科学技术的发展，天然药物的开发途径和手段也在不断创新。目前，开发新药的途径大致有三条，即民间药途径、经验药途径和分子途径。其中随着分子生物学、遗传学及信息处理技术等的发展，分子途径已逐渐成为开发新药的主要途径。但是基于我国目前国情，且由于技术设备的局限性，目前民间药途径、经验药途径是我国开发新药的主要途径，而这两种途径又是以药用植物为主体。
以药用植物为主体发展起来的药物，在历史上对人类的防病治病、康复保健和生育繁衍起到了巨大的作用。天然药物来源途径甚多，大多来源于植物；据估计，全球约有40～50万种植物，但仅有极少部分进行过化学成分及其活性测试研究，我国也是植物资源最丰富的国家之一，因此充分挖掘和利用自然界结构多样性的化合物开发新的天然药物，促进我国医药科技高速前进，开拓新的市场，推动我国天然药物的发展，迎接医药经济全球化挑战具有重要的意义。药用植物是开发新药的重要来源，目前，全球批准的新药中，接近半数是天然药物，药物来自天然产物。现今，世界上还有近60％的人口还完全依靠植物药来防治疾病。
但随着疾病的衍变，病毒抗药性、机体耐药性等问题，单纯的依靠某种药用植物，或药用植物中所含成分为前体来研发的新药，已远不能满足人们对药物的需要。针对某种特定的疾病，人们往往是要将两种或两种以上的，甚至更多的药物同时服用才能起到一定的治疗作用。
中药黄连主要包括毛茛科黄连、三角叶黄连、云连的干燥根茎。黄连素学名小檗碱，是中药黄连中的主要生物碱。小檗碱属异喹啉类生物碱，近年来研究发现，小檗碱及其衍生物在治疗肿瘤、糖尿病、心血管疾病、高血脂、炎症、细菌和病毒感染、脑缺血性损伤、精神疾病、阿尔茨海默病(老年痴呆症)、骨质疏松等多方面具有药理作用。
二甲双胍是西药经典的降糖药,近年来研究发现,二甲双胍除了具有良好的降糖效果外，在抗炎、抗肿瘤、调节血脂、抗菌方面也有很好的疗效，研究发现小檗碱的溶解度随pH的增加而增大，pH13时，小檗碱的油水分配系数最大，而二甲双胍是强碱性脂肪胺，pH＝12.4，可增加小檗碱的溶解度，提高生物利用度。二甲双胍在体内的消除半衰期约为1.25-2.8小时，导致其给药次数增加，患者依从性差，小檗碱虽然在体内吸收差，但是吸收入血的药物分布广，半衰期长，弥补二甲双胍半衰期短的缺点，并且小檗碱可以改善肾损伤患者病理变化，促进二甲双胍排泄，减少乳酸性酸中毒。基于以上因素，将二者分子母核拼接在一起，能否增加小檗碱的生物利用度，降低肾病患者乳酸性酸中毒的风险，将二者采用化学合成的方法，有目的的拼接起来，看其某些药理作用能否增强，是否能达到1+1≥2，增效减毒的作用，能否突出二者抗抗炎、降糖降酯的药理作用等，这些都是未知不可预料的，也是现有技术中没有任何公开或报道的。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种新的化合物，所述化合物的毒性比小檗碱的毒性小，而且具有更好的抗炎、抗肿瘤抗癌、降糖降脂、抗菌等作用。同时，本发明还提供所述化合物的制备方法及用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种化合物，所述化合物的结构式为：
本发明所述化合物由小檗红碱和二甲双胍通过特定的反应合成，其能够显著降低小檗碱的毒性，而且能够达到1+1≥2，起到增效减毒的作用，在抗炎、抗肿瘤抗癌、降糖降脂和抗菌等方面具有更好的效果。
另外，本发明公开一种上述所述化合物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将式(1)所示化合物与溴代剂在溶剂A中进行溴代反应，得到式(2)所示化合物；
(2)将步骤(1)中得到的式(2)化合物在碱催化剂的作用下，与式(3)所示化合物在溶剂B中发生环合反应，即得到本发明所述式(4)化合物。
本发明所述化合物的制备方法，通过特定的方式将小檗红碱和二甲双胍的母核环合在一起，但是这种环合并不是盲目的，而是在中医药临床用药经验的指导下以及有机化学的基础上，有目的、有选择的将二者结合一起，发现二者结合后能够起到增效减毒的效果，而且本发明的方法操作简单，能够快速高效得到本发明所述化合物。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中溴代剂为溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丁酯、氯乙酸甲酯、氯乙酸乙酯、氯乙酸丁酯、碘乙酸甲酯中的至少一种。作为本发明所述化合物的制备方法的更优选实施方式，所述步骤(1)中溴代剂为溴乙酸甲酯。当所述溴代剂选择溴乙酸甲酯时，所述溴乙酸甲酯分子中的两个碳既可以克服分子间的阻力，保证亲核取代反应的发生，又保持了所合成化合物的稳定性，避免其在体内不稳定而分解。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中溶剂A为乙腈、DMF、甲醇、丙酮、乙醇、二甲基亚砜、四氢呋喃、二氯甲烷、二甲基亚砜、二氧六环中的至少一种。作为本发明所述化合物的制备方法的更优选实施方式，所述步骤(1)中的溶剂A为二氯甲烷。当所述步骤(1)中的溶剂A选择二氯甲烷时，二氯甲烷对步骤(1)反应的反应物溶解性较好，且黏度小，沸点低，极性适中，在既保证了产物收率的前提下，又易于后处理，回收溶剂。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中碱催化剂为甲醇钠、乙醇钠、金属钠中的至少一种。作为本发明所述化合物的制备方法的更优选实施方式，所述步骤(2)中的碱催化剂为甲醇钠。本申请发明人通过大量研究发现，当所述碱催化剂选择甲醇钠时，产物的收率明显高于其他碱催化剂。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中溶剂B为乙腈、DMF、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、吡啶、喹啉、二甲基亚砜、四氢呋喃、二氯甲烷、二甲基亚砜、二氧六环中的至少一种。作为本发明所述化合物的制备方法的更优选实施方式，所述步骤(2)中的溶剂B为甲醇。甲醇对步骤(2)反应的反应物溶解性较好，且黏度小，沸点低，极性适中，在既保证了产物收率的前提下，又易于后处理，回收溶剂。
作为本发明所述化合物的制备方法的最优选实施方式，所述步骤(1)中的溶剂A为二氯甲烷，溴代剂为溴乙酸甲酯；所述步骤(2)中的溶剂B为甲醇，碱催化剂为甲醇钠。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中溶剂A与式(1)化合物的摩尔比为5:1～20:1，溴代剂与式(1)化合物的摩尔比为0.8:1～3:1。
作为本发明所述化合物的制备法的优选实施方式，所述步骤(2)中碱催化剂与式(2)化合物的摩尔比为0.04:1～5:1，溶剂B与式(2)化合物的摩尔比为5:1～20:1，式(3)化合物与式(2)化合物的摩尔比为0.5:1～5:1。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中溴代反应温度为30～80℃，反应时间为3～12小时。作为本发明所述化合物的制备方法的更优选实施方式，所述步骤(1)中溴代反应温度为30～80℃，反应时间为8～10小时。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中环合反应的温度为40～100℃，反应时间为3～20小时。作为本发明所述化合物的制备方法的更优选实施方式，所述步骤(2)中环合反应的温度为60～70℃，反应时间为12-20小时。
本申请发明人经过研究发现，当所述步骤(1)中的溴代反应温度为40℃、反应时间为8h，步骤(2)中的环合反应的温度为65℃、反应时间为16小时时，既能保证产物收率，又具有较好的经济性。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)的具体方法为：将式(1)所示化合物加入干净的三口烧瓶中，加入溶剂A，缓慢加入溴代剂，待温度至40℃时，回流反应，HPLC监测反应，原料基本反应完全或产物不再增加时停止反应，待温度降至20-30℃，析晶，然后抽滤、洗涤、干燥，即得式(2)所示化合物。优选的，所述析晶反应时，采用加入适量95％乙醇进行析晶，析晶后搅拌析晶2h后，再进行抽滤、洗涤、干燥。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)的具体方法为：将式(3)所示化合物加入干净的三口烧瓶中，加入溶剂B和碱催化剂，搅拌30分钟，然后加入步骤(1)得到的式(2)所示化合物，在温度为60-70℃下反应3～20小时，反应结束后进行冷却，抽滤，洗涤，然后干燥，再进行析晶，有橙黄色晶体析出，然后抽滤、干燥，即得本发明所述化合物。优选的，反应结束后用热的甲醇萃取5次，热甲醇的温度为60℃，萃取结束后，沉淀加入盐酸-乙醇溶液，析晶，抽滤，干燥，得到本发明的化合物。
作为本发明所述化合物的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中式(1)化合物采用以下方法制备而成：将式(5)所示化合物在溶剂C中于120～170℃下反应，使其9位甲基脱去，得到式(1)所示化合物；其中所述溶剂C为DMF、DMAC、DMSO、HMPT、HEPT、NMP、二苯醚、吡啶、喹啉中的一种，所述溶剂C与式(5)所示化合物的摩尔比为5:1～20:1；
作为本发明所述化合物的制备方法的更优选实施方式，所述步骤(1)中式(1)所示化合物采用以下方法制备而成：将式(5)所示化合物置于干燥洁净的三口烧瓶中，加入溶剂C，于电加热套中加热回流反应，在温度为120-170℃下反应，反应过程用HPLC监测，原料基本反应完全或产物不再增加时停止反应，待温度降至120℃以下，边搅拌边加入纯的冰水，置于冰箱中静置析晶，温度为4℃左右，然后抽滤、洗涤，干燥即得式(1)所示化合物。
本发明所述步骤(1)中式(1)所示化合物可以直接购于市场，也可以采用上述所述方法由式(5)所示化合物制备而成。
另外，本发明还提供了以上所述化合物在制备用于治疗肿瘤、癌症、高血糖、高血脂、心脑血管疾病的药物中的用途。
本发明所述化合物是发明人在中医药临床用药经验以及有机化学的指导下，有目的、有选择的将小檗红碱和二甲双胍通过特定的合成方法结合在一起而得，所述化合物具有增效减毒的效果，在抗炎、抗肿瘤、抗癌、降糖降脂、抗菌、抗心脑血管疾病等方面具有更好的效果。
本发明的有益效果在于：本发明所述化合物由小檗红碱和二甲双胍通过特定的反应合成，其能够显著降低小檗碱的毒性，而且能够达到1+1≥2的药理作用，起到增效减毒的作用；本发明所述化合物的制备方法操作简单，能够快速高效的得到本发明所述化合物，并且所得化合物在制备用于治疗肿瘤、癌症、高血糖、高血脂、心脑血管疾病等的药物中具有重要用途，为制备治疗肿瘤、癌症、高血糖、高血脂、心脑血管疾病等的药物提供了新的药物选择。
附图说明
图1为本发明所述化合物的高分辨质谱图；
图2为本发明所述化合物的红外光谱图；
图3为本发明所述化合物的紫外光谱图；
图4为本发明所述化合物的核磁共振氢谱碳谱图；
图5为本发明所述化合物的核磁共振氢谱碳谱图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
以下实施例所用式(1)～(5)的化合物的结构式分别如下所示：
实施例1
本发明所述化合物的一种实施例，本实施例所述化合物采用以下方法制备而成：
(1)将式(5)化合物置于干燥洁净的三口烧瓶中，向三口烧瓶中加入DMAC，所述DMAC与式(5)化合物的摩尔比为5:1，然后于电加热套中加热回流反应，反应温度为120-170℃，采用HPLC监测反应，当原料基本反应完全或产物不再增加时，停止反应；待温度降至120℃以下，边搅拌边加入纯的冰水，置于冰箱中静置析晶，温度为4℃度左右，然后抽滤、洗涤，干燥即得式(1)的化合物；本步骤中，所得式(1)化合物的收率为75％，纯度为97％
(2)将式(1)的化合物加入干燥洁净的三口烧瓶中，加入二氯甲烷，所述二氯甲烷与式(1)化合物的摩尔比为20:1，缓慢加入溴乙酸甲酯，所加入的溴乙酸甲酯与式(1)化合物的摩尔比为0.8:1，温度升至40℃左右，回流反应8小时，HPLC监测反应，原料基本反应完全或产物不再增加时停止反应，待温度降至室温，加入适量95％乙醇进行析晶，析晶后搅拌析晶2h后，再进行抽滤、洗涤、干燥，即得式(2)的化合物；本步骤中，所得式(2)化合物的收率为85％，纯度为98％；
(3)将式(3)化合物加入干净的三口烧瓶中，加入甲醇和甲醇钠-甲醇溶液，所加入的甲醇与式(2)化合物的摩尔比为20:1，所加入的甲醇钠与式(2)化合物的摩尔比为0.04:1，搅拌30分钟，缓慢加入步骤(1)得到的式(2)的化合物，所加入的式(3)化合物与式(2)化合物的摩尔比为0.5:1，在温度为65℃下反应16小时，反应结束后冷却、抽滤、干燥，得到式(4)的化合物，即得本发明所述化合物；本步骤中所得式(4)的化合物，收率为33.5％，纯度为49％，经过热甲醇洗涤、盐酸-乙醇等方法精制纯化后纯度为95％以上，即得本发明的化合物。
实施例2
本发明所述化合物的一种实施例，本实施例所述化合物采用以下方法制备而成：
(1)将式(5)化合物置于干燥洁净的三口烧瓶中，向三口烧瓶中加入DMSO，所述DMSO与式(5)化合物的摩尔比为10:1，然后于电套中加热回流反应，反应温度为120-170℃，采用HPLC监测反应，当原料基本反应完全或产物不再增加时，停止反应；待温度降至120℃以下，边搅拌边加入纯的冰水，置于冰箱中静置析晶，温度为4℃左右，然后抽滤、洗涤，干燥即得式(1)的化合物；本步骤中，所得式(1)化合物的收率为72％，纯度为96％；
(2)将式(1)的化合物加入干燥洁净的三口烧瓶中，加入二氯甲烷，加热，所述二氯甲烷与式(1)化合物的摩尔比为20:1，缓慢加入氯乙酸甲酯，所加入的氯乙酸甲酯与式(1)化合物的摩尔比为1:1，温度升至40℃左右，回流反应8小时，HPLC监测反应，原料基本反应完全或产物不再增加时停止反应，待温度室温，加入适量95％乙醇进行析晶，析晶后搅拌析晶2h后，再进行抽滤、洗涤、干燥，即得式(2)的化合物；本步骤中，所得式(2)化合物的收率为80％，纯度为98％；
(3)将式(3)的化合物加入干净的三口烧瓶中，加入甲醇和乙醇钠-乙醇溶液，所加入的乙醇与式(2)化合物的摩尔比为20:1，所加入的乙醇钠与式(2)化合物的摩尔比为0.04:1，搅拌30分钟，缓慢加入步骤(1)得到的式(2)的化合物，所加入的式(3)化合物与式(2)化合物的摩尔比为3:1，在温度为65℃下反应16小时，反应结束后冷却、抽滤、干燥，得到式(4)的化合物，即得本发明所述化合物；经过热甲醇洗涤、盐酸-乙醇等方法精制纯化后，即得纯度为95％以上的本发明所述化合物；本步骤中所得式(4)的化合物，收率为30％，纯度为49％，经过热甲醇洗涤、盐酸-乙醇等方法精制纯化后纯度为95％以上。
实施例3
本发明所述化合物的一种实施例，本实施例所述化合物采用以下方法制备而成：
(1)将式(5)化合物置于干燥洁净的三口烧瓶中，向三口烧瓶中加入DMF，所述DMF与式(5)化合物的摩尔比为15:1，然后于电套中加热回流反应，反应温度为120-170℃，采用HPLC监测反应，当原料基本反应完全或产物不再增加时，停止反应；待温度降至120℃以下，边搅拌边加入纯的冰水，置于冰箱中静置析晶，温度为4℃左右，然后抽滤、洗涤，干燥即得式(1)的化合物；本步骤中，所得式(1)化合物的收率为71％，纯度为97％；
(2)将式(1)的化合物加入干燥洁净的三口烧瓶中，加入二氯甲烷，加热，所述二氯甲烷与式(1)化合物的摩尔比为20:1，缓慢加入氯乙酸甲酯，所加入的氯乙酸甲酯与式(1)化合物的摩尔比为3:1，温度升至40℃左右，回流反应8小时，HPLC监测反应，原料基本反应完全或产物不再增加时停止反应，待温度降至室温，加入适量95％乙醇进行析晶，析晶后搅拌析晶2h后，再进行抽滤、洗涤、干燥，即得式(2)的化合物；本步骤中，所得式(2)化合物的收率为80％，纯度为97％；
(3)将金属钠用锡纸包好，用针扎孔，投入甲醇溶液中，待金属钠全部溶解，将锡纸取出，溶液备用，将式(3)的化合物加入干净的三口烧瓶中，与金属钠反应后的甲醇溶液，所加入的甲醇溶液与式(2)化合物的摩尔比为20:1，所加入的金属钠与式(2)化合物的摩尔比为0.04:1，搅拌30分钟，缓慢加入步骤(1)得到的式(2)的化合物，所加入的式(3)化合物与式(2)化合物的摩尔比为5:1，在温度为65℃下反应16小时，反应结束后冷却、抽滤、干燥，得到式(4)的化合物，即得本发明化合物；经过热甲醇洗涤、盐酸-乙醇等方法精制纯化后，得到纯度为97％的本发明所述化合物；本步骤中所得式(4)的化合物，收率为28％，纯度为49％，经过热甲醇洗涤、盐酸-乙醇等方法精制纯化后纯度为97％，即得本发明的化合物。
实施例4
本发明所述化合物的一种实施例，本实施例所述化合物采用以下方法制备而成：
(1)将式(5)化合物置于干燥洁净的三口烧瓶中，向三口烧瓶中加入HMPT，所述HMPT与式(5)化合物的摩尔比为20:1，然后于电加热套套中加热回流反应，反应温度为120-170℃，采用HPLC监测反应，当原料基本反应完全或产物不再增加时，停止反应；待温度降至120℃以下，边搅拌边加入纯的冰水，置于冰箱中静置析晶，温度为零度左右，然后抽滤、洗涤，干燥即得式(1)的化合物；本步骤中，所得式(1)化合物的收率为66％，纯度为98％；
(2)将式(1)的化合物加入干燥洁净的三口烧瓶中，加入乙腈，加热，所述乙腈与式(1)化合物的摩尔比为5:1，缓慢加入溴乙酸乙酯，所加入的溴乙酸乙酯与式(1)化合物的摩尔比为0.8:1，温度升至70℃左右，回流反应6小时，HPLC监测反应，原料基本反应完全或产物不再增加时停止反应，待温度降至室温，加入适量95％乙醇进行析晶，析晶后搅拌析晶2h后，再进行抽滤、洗涤、干燥，所得式(2)化合物的收率为78％，纯度为92％；
(3)将式(3)的化合物加入干净的三口烧瓶中，加入甲醇乙醇混合溶液和甲醇钠-甲醇溶液，所加入的甲醇乙醇混合溶液与式(2)化合物的摩尔比为20:1，所加入的甲醇钠与式(2)化合物的摩尔比为0.05:1，搅拌30分钟，缓慢加入步骤(1)得到的式(2)的化合物，所加入的式(3)化合物与式(2)化合物的摩尔比为3:1，在温度为65℃下反应16小时，反应结束后冷却、抽滤、干燥，得到式(4)的化合物，即得本发明化合物；经过热甲醇洗涤、盐酸-乙醇等方法精制纯化后，得到纯度为97％的本发明所述化合物；本步骤中所得式(4)的化合物，收率为30％，纯度为49％，经过热甲醇洗涤、盐酸-乙醇等方法精制纯化后纯度为97％。
实施例5
本发明所述化合物的一种实施例，本实施例所述化合物采用以下方法制备而成：(1)将式(5)化合物置于干燥洁净的三口烧瓶中，向三口烧瓶中加入吡啶，所述吡啶与式(5)化合物的摩尔比为8:1，然后于电加热套中加热回流反应，反应温度为120-170℃，采用HPLC监测反应，当原料基本反应完全或产物不再增加时，停止反应；待温度降至120℃以下，边搅拌边加入纯的冰水，置于冰箱中静置析晶，温度为4℃左右，然后抽滤、洗涤，干燥即得式(1)的化合物；本步骤中，所得式(1)化合物的收率为72％，纯度为95％；
(2)将式(1)的化合物加入干燥洁净的三口烧瓶中，加入四氢呋喃，加热，所述四氢呋喃与式(1)化合物的摩尔比为20:1，缓慢加入溴乙酸乙酯，所加入的溴乙酸乙酯与式(1)化合物的摩尔比为0.8:1，温度升至70℃左右，回流反应6小时，HPLC监测反应，原料基本反应完全或产物不再增加时停止反应，待温度降至室温，加入适量95％乙醇进行析晶，析晶后搅拌析晶2h后，再进行抽滤、洗涤、干燥，所得式(2)化合物的收率为75％，纯度为92％；
(3)将式(3)的化合物加入干净的三口烧瓶中，加入四氢呋喃和甲醇钠-甲醇溶液，所加入的四氢呋喃与式(2)化合物的摩尔比为20:1，所加入的甲醇钠与式(2)化合物的摩尔比为0.1:1，搅拌30分钟，缓慢加入步骤(1)得到的式(2)的化合物，所加入的式(3)化合物与式(2)化合物的摩尔比为4:1，在温度为65℃下反应16小时，反应结束后冷却、抽滤、干燥，得到式(4)的化合物，即得本发明化合物；本步骤中所得式(4)的化合物，收率为31％，纯度为49％，经过热甲醇洗涤、盐酸-乙醇等方法精制纯化后纯度为95％。
实施例6
本发明所述化合物的一种实施例，本实施例所述化合物采用以下方法制备而成：
(1)将式(5)化合物置于干燥洁净的三口烧瓶中，向三口烧瓶中加入二苯醚，所述二苯醚与式(5)化合物的摩尔比为12:1，然后于电加热套中加热回流反应，反应温度为120-170℃，采用HPLC监测反应，当原料基本反应完全或产物不再增加时，停止反应；待温度降至120℃以下，边搅拌边加入纯的冰水，置于冰箱中静置析晶，温度为4℃左右，然后抽滤、洗涤，干燥即得式(1)的化合物；本步骤中，所得式(1)化合物的收率为68％，纯度为96％；
(2)将式(1)的化合物加入干燥洁净的三口烧瓶中，加入二氯甲烷和二氧六环的混合物，所述二氯甲烷和二氧六环的混合物中，所述二氯甲烷和二氧六环的质量比为2:1，加热，所述二氯甲烷和二氧六环的混合物与式(1)化合物的摩尔比为10:1，缓慢加入溴乙酸丁酯，所加入的溴乙酸丁酯与式(1)化合物的摩尔比为2:1，温度升至100℃左右，回流反应5小时，HPLC监测反应，原料基本反应完全或产物不再增加时停止反应，待温度降至室温，加入适量95％乙醇进行析晶，析晶后搅拌析晶2h后，再进行抽滤、洗涤、干燥，即得式(2)的化合物；本步骤中，所得式(2)化合物的收率为70％，纯度为95％；
(3)将式(3)的化合物加入干净的三口烧瓶中，加入四氢呋喃和甲醇钠-甲醇溶液，所加入的四氢呋喃与式(2)化合物的摩尔比为5:1，所加入的甲醇钠与式(2)化合物的摩尔比为0.1:1，搅拌30分钟，缓慢加入步骤(1)得到的式(2)的化合物，所加入的式(3)化合物与式(2)化合物的摩尔比为5:1，在温度为65℃下反应16小时，反应结束后冷却、抽滤、干燥，得到式(4)的化合物；本步骤中所得式(4)的化合物，收率为25％，纯度为49％，经过热甲醇洗涤、盐酸-乙醇等方法精制纯化后纯度为98％。。
实施例7
本发明所述化合物的一种实施例，本实施例所述化合物采用以下方法制备而成：
(1)从市场直接购买式(1)的化合物，其纯度为99％；
(2)将式(1)的化合物加入干燥洁净的三口烧瓶中，加入乙腈和甲醇的混合物，所述乙腈和甲醇的混合物中，所述乙腈和甲醇的质量比为1:4，加热，所述乙腈和甲醇的混合物与式(1)化合物的摩尔比为8:1，缓慢加入溴乙酸乙酯，所加入的溴乙酸乙酯与式(1)化合物的摩尔比为2:1，在温度为67℃下回流反应12小时，HPLC监测反应，原料基本反应完全或产物不再增加时停止反应，加入适量95％乙醇进行析晶，析晶后搅拌析晶2h后，再进行抽滤、洗涤、干燥，即得式(2)的化合物；本步骤中，所得式(2)化合物的收率为80％，纯度为95％；
(3)将式(3)的化合物加入干净的三口烧瓶中，加入乙腈和DMF的混合物、和N,N-二异丙基乙胺，所加入的乙腈和DMF的混合物中，乙腈与DMF的质量比为1:1，所述乙腈和DMF的混合物与式(2)化合物的摩尔比为6:1；所述N,N-二异丙基乙胺与式(2)化合物的摩尔比为2:1，加入甲醇钠，搅拌30分钟，缓慢加入步骤(1)得到的式(2)的化合物，所加入的式(3)化合物与式(2)化合物的摩尔比为0.5:1，在温度为65℃下反应16小时，反应结束后冷却、抽滤、干燥，得到式(4)的化合物，即得本发明化合物；本步骤中所得式(4)的化合物，收率为29％，纯度为49％，经过热甲醇洗涤、盐酸-乙醇等方法精制纯化后纯度为95％。
实施例8本发明所述化合物图谱
由附图2～5可看出，本发明的化合物，m.p.210.5～214.9℃,ESI-MS m/z:471.1666[M]+；
IR(KBr)νmax:1674.87,1600.63,1533.38,1491.67,1405.85,1237.11,1038.48,935.306,772.351(cm-1)；
1HNMR(500MHz,DCOOD),δ(ppm)7.173(s,2H,O-CH3-O),6.952(s,1H,C12-H),6.745(s,1H,C8-H,),6.417(d,2H,C1-H,C4-H),5.843(s,1H,C13-H),5.486(s,2H,CH2-O),5.026(d,2H,C6-H,),3.107(s,3H,OCH3),2.219(s,3H,N-CH3),2.174(d,5H,C5-H,N-CH3)；
13CNMR(MHz,DCOOD),δ(ppm):166.56(OCH2O),161.46(C2),159.79(C5a),156.49(N-C-N),156.03(N-C-N)151.41C1a),148.97(N-C＝N),147.80(C1),143.05(C7a),142.21(C10),132.76(C12),131.08(C9a),130.94(C12a),123.97(C9),121.23(C2),120.55(C11),108.95(C13),106.45(C8),103.02(O-CH2),102.50(C4),58.36(OCH3),53.72(C6),38.16(N-CH3),37.94(N-CH3),27.15(C5)。
实施例9本发明所述化合物的抗炎效果试验
1、实验材料、试剂与仪器
实验材料：RAW264.7巨噬细胞(购自中国科学院细胞库)，胎牛血清(FBS,Gibco)；高糖培养基(DMEM,Gibco)，0.25％胰蛋白酶(Gibco)；青霉素-链霉素双抗(Gibco)；磷酸盐缓冲液(PBS，Hyclone)；MTT粉末(Sigma)；DMSO(Sigma)；布洛芬(Sigma)；LPS(Sigma)，氨基胍(中国食品药品检定研究所)
主要仪器：HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司)；KDC-220HR高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司)，TDL80-2B低速离心机(上海安亭科学仪器厂)；BP210D分析天平(Sartorius)；HF90CO2培养箱(上海力申科学仪器有限公司)；显微镜；SW-CJ-1FD超净台(苏净安泰)；WH-2微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器厂)；BX51荧光显微镜(OLYMOUS)。
2、溶液的配制
细胞培养基的配置：DMEM：FBS：双抗＝98：10：1，细胞冻存液的配置：FBS：DMSO＝9：1，MTT溶液的配制方法:称取MTT 500mg，溶于100ml的PBS中，配置的MTT浓度为5mg/ml，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放-20℃避光保存即可。
3、细胞培养
细胞复苏：①从液氮罐或者-86℃超低温冰箱中取出冻存的细胞株，迅速置入37℃恒温水浴锅中，不断振摇冻存管至完全融化，在1-2min内完成操作；②75％酒精擦拭消毒外管，迅速转置超净台，将细胞悬液转至无菌离心管，加入10倍含有10％FBS的DMEM培养基，吹打均匀；③1000rpm/min,离心5-8min，弃去上清液，加入适量的已配置培养基，接种于60mm培养皿中，置于37℃、5％CO2以及饱和湿度的培养箱中培养；④每两天更换培养基。
细胞传代：①弃去旧的培养基；②PBS清洗2次，吸弃，加入适量的胰蛋白酶消化1min，在显微镜下观察发现细胞质回缩、细胞间隙增大，细胞外形变圆后，吸弃胰蛋白酶，立即加入已配培养基；③反复吹打皿底，使贴壁细胞完全吹落，吹打均匀，轻柔操作避免出现泡沫；④以1:3的比例进行传代。
细胞的冻存：①-③步骤同细胞传代；④将吹落的细胞混悬液转至无菌离心管中，1000rpm/min，离心5-8min，弃去上清液，加入适量的已配冻存液；⑤每个冻存管液1-1.5ml，细胞终浓度为(5-10)×106/ml；⑥冻存管用封口膜封口，做好标记，按照以下程序冻存：4℃，15-20min→-20℃，30-40min，细胞悬液呈结冻后，即可放入-86℃超低温冰箱保存，长期保存可放入液氮罐中。
(一)MTT法测定本发明化合物对RAW264.7细胞增殖活性影响
1、实验原理
MTT化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于细胞毒性试验，它的特点是灵敏度高、经济。
2、实验方法
将RAW264.7细胞悬液以5000个/100μL接种于96孔板，培养过夜。化合物浓度采用二倍稀释法，6个浓度梯度,每个浓度3个复孔，每孔加入用培养基稀释的药物100μL培养48小时后，每孔中加入10％MTT，继续于37℃下培养4h，弃去上清液，加入DMSO150μL，用酶标仪读取570nm处的吸收值,以空白对照为100％，计算化合物各剂量对细胞活力的影响，用spss软件计算各个化合物的IC50值。
布洛芬 本发明化合物 黄连素 二甲双胍 IC50(μmol/L) 55.67±4.13 82.36±2.45 65.13±5.62 60.25±8.33
实验结果显示本发明化合物比合成前各单体化合物和阳性对照药布洛芬的IC50值大，表明其细胞毒毒性减小了。
(二)本发明化合物对LPS诱导RAW264.7NO释放抑制作用
Griess法原理：细胞生成的NO容易被氧化成为NO2-、NO3-，首先将NO3-还原成为NO2-，利用重氮化反应以及偶氮化反应生成颜色化合物，在540nm波长处有最大吸收。吸光值与NO2-浓度呈正相关，从而间接得到NO释放量。
考察化合物干预后细胞上清液中亚硝酸盐含量的变化：RAW264.7细胞悬液以每孔1×105个/100μL接种于96孔板。设置空白对照组(只有RAW264.7细胞)，模型组(RAW264.7细胞和LPS)，和药物处理组(RAW264.7细胞,LPS,药物)，先用化合物采用不同药物浓度处理(100μM-3μM)处理2小时后，再加LPS，刺激维持24h后，吸取96孔板中的培养液100μL，加入等体积的Griess反应试剂，室温反应10min，酶标仪540nm处读取光吸收值。计算化合物各剂量在不同处理时间对细胞上清液中亚硝酸盐抑制率。抑制率(％)＝(模型组吸光度值-各剂量药物处理组吸光度值)/(模型组吸光度值-空白对照组吸光度)×100％。并用spss软件计算各个化合物对NO抑制的IC50值。注:所有的化合物用DMSO溶解，并用培养基稀释到所需要的浓度，DMSO的最终浓度为0.1％，在空白对照组和模型组中加入0.1％的DMSO，结果显示对细胞没有毒性作用。氨基胍作为阳性对照药,平行实验三次。实验结果用GraphPad Prism软件分析。P<0.05，P<0.01表示结果具有显著性差异。IC50计算用SPSS13.0软件中Probit程序。
布洛芬 本发明化合物 黄连素 二甲双胍 IC50(μmol/L) 27.25±4.57 36.42±1.13 41.93±5.12 58.64±2.78
实验结果显示本发明化合物IC50值小于合成前单体化合物，即抑制NO释放作用增强，但仍然弱于阳性对照药。
实施例10本发明所述化合物的抗菌效果试验
(一)实验材料、实验仪器、试剂
1、实验材料
菌株(临床分离耐药白色念珠球菌103、100、953和J28由长海医院菌种保存中心赠送)，所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)划板活化，于30℃培养2周后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培养后于4℃保存以备用。
(1)培养液
RPMI 1640液体培养液的配制：RPMI 1640(Gibco BRL)10g，NaHCO3 2.0g，吗啡啉丙磺酸(MOPS)(Sigma)34.5g(0.165M)，加三蒸水900ml溶解，1N NaOH调pH至7.0(25℃)，三蒸水定容至000ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。
(2)沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(SDA)
蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml溶解，调整PH至7.0，以三蒸水定容至1000ml，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。
(3)YEPD培养液
酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，三蒸水定容至1000ml，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。
2、实验试剂
氟康唑(Fluconazole，FCZ)注射液由大连辉瑞药业有限公司提供，盐酸小檗碱(Berberine Chloride，BBR)由上海长海医院提供，二甲基亚砜(Dimethyl Sulphoxide，DMSO)中国医药集团上海化学试剂公司出品。
3、实验仪器
Multiskan MK3型酶标检测仪(芬兰Labsystems产品)，隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，MJX型智能霉菌培养箱(宁波江南仪器厂)THZ－82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；SW-CT-IF型超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；倒置显微镜(amersham Pharmacia产品)；微量加样器(芬兰Finnpette产品)；96孔细胞培养板(丹麦Nunclon公司产品)
(二)实验方法
1、真菌悬液的配制
实验前，用接种圈从4℃保存的SDA培养基上挑取各种白念珠菌少量，接种至1ml YEPD培养液，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1ml YEPD培养液中，用上述方法再次活化16h后，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养液调整菌液浓度至1×103-5×103CFU/ml。
2、药敏反应板的制备
取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μl作空白对照；3-12号孔各加新鲜配制的菌液100μl；2号孔分别加菌液160μl和受试化合物溶液40μl；12号孔不含药物，只加菌液100μl作阳性生长对照。2-11号孔进行倍比稀释，使各孔的最终药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1％。每次配制药敏板的同时均制备一质控菌药敏板，各药敏板于30℃恒温箱培养。
3、最低抑菌浓度(MIC)的判定
在30℃恒温箱中，念珠菌培养24h后用酶标分析仪于620nm测各孔OD值。阳性对照孔的OD值控制在0.2左右，与阳性对照孔比，以OD值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC80(真菌生长80％被抑制时的药物浓度)。当药物的MIC80值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC80值高于最高浓度64μg/ml时，计为“>64μg/ml”；MIC80值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.125μg/ml”。上述实验均平行操作2到3次，当MIC80值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC80值；当MIC80值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。
青霉素 本发明化合物 黄连素 二甲双胍 MIC80(μg/ml) 1.06±0.61 5.28±0.83 3.82±0.32 10.54±1.38
从MIC80值可以看出，本发明化合物对该菌的抗菌效果不及单用的黄连素，但远好于单用的二甲双胍姜黄素。
实施例11本发明所述化合物的抗肿瘤抗癌效果试验
以肝癌细胞株HepG 2和白血病细胞株K 562为例，通过探讨本发明化合物对肝癌细胞株HepG 2和白血病细胞株K 562增殖的抑制作用中，来研究该化合物对的抗肿瘤抗癌作用。
本实验采用Sulforhodamine B(SRB)染色、台盼蓝排染法、彗星电泳技术和AO/EB双染法检测本发明化合物对肝癌细胞株HepG2和白血病细胞株K562的毒性、抑制癌细胞增殖作用、对K562细胞DNA的损伤和诱导K562细胞的凋亡作用。
(一)材料、仪器与试剂
1、材料与试剂
本发明化合物(DMSO配制原液，临用前稀释，保证DMSO浓度在反应体系中至少稀释为1×10-2)，人肝癌细胞株He pG2和人白血病细胞株K562引自兰州大学生命科学学院，培养基RPM I1640(美国Gibcobr l)，黄酰罗丹明B(Sulforhodam ineB，SRB，美国Sigma)，台盼蓝(Sigma公司)，小牛血清(杭州四季青)，其它化学试剂均为分析纯。
2、实验仪器
美国Precision Scientific CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、光学显微镜、酶标仪(BIO-RADModel 550和BIO-RAD Model 680)、荧光显微镜、水平电泳槽、高速低温离心机、Costar细胞培养板。
(二)实验方法
细胞培养：HepG 2和K562细胞分别接种于含10％小牛血清RPM I1640培养基中，置37℃，5％CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。
1、SRB法检测本发明化合物对HepG2细胞的毒性作用
原理：SulforhodamineB(SRB)是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。SRB可以与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其在511nm的OD读数与细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。
方法：对数生长期的HepG2细胞以10×104ml-1的浓度接种于96孔培养板中,培养24h后，向相应孔中分别加入不同稀释浓度的本发明化合物新鲜培养液100μl，继续培养24、48h后，弃去培养液，加入10％的三氯乙酸(TCA)100μl，静置5min后，将孔板移置4℃固定1h，倒掉固定液，用去离子水洗5遍，晾干。之后每孔加入100μl0.4％的SRB染色10min，用1％的醋酸洗5次，自然晾干。然后每孔加入150μl 10mmol·L-1的非缓冲Tris碱液(unbuffered Tris-base solution，pH10.5)溶解与蛋白质结合的SRB，用振荡器震荡5min使其充分溶解后，用酶标仪在515nm处测定每孔的OD值。求其细胞增值率(％)＝(T-T0)/(C-T0)×100。其中C表示对照组的细胞OD值；T表示加药组的细胞OD值；T0表示对照平板测定加药时的细胞OD值。在加药前即刻将平板中接种的细胞用TCA固定。如果加药组最终的OD值大于T0；说明细胞在加药后仍然生长。如果加药组最终的OD值小于T0，说明加药后细胞被杀死。利用回归方程求出50％增值抑制率的药物浓度(50％inhibition concentration,IC50)。从实验结果看，加药组最终的细胞数小于T0，继而说明药物对细胞生长有抑制作用，加药后细胞被杀死。以本发明化合物组和对照组处理HepG 2细胞24h后的IC50值为例来比较各化合物对该细胞的毒性作用，IC50值如下表所示：
顺铂 本发明化合物 黄连素 二甲双胍 IC50(μmol/L) 9.54±0.62 20.53±1.85 22.35±1.42 55.38±3.85
实验结果显示本发明化合物IC50值小于合成前单体化合物，即对HepG 2细胞抑制作用增强，但仍然弱于阳性对照药。
2、台盼蓝排染法检测本发明化合物对K562细胞的毒性作用
原理：活细胞具有排斥台盼蓝的能力，细胞死亡后由于膜完全性的破坏，细胞即被着色。将含有台盼蓝的细胞悬液滴入白细胞计数板小室中，在光学显微镜下观察计数活细胞(未被染成蓝色的细胞)。
实验方法：浓度为10×104·ml-1的处于对数生长期的K562细胞悬液，以0.5ml·孔-1接种于24孔培养板中。置于37℃、％CO2饱和湿度培养箱中预培养24h后加药。继续培养24、48h后，取0.4％台盼蓝溶液0.15ml加入0.6ml细胞悬液中，充分混匀，染色5min后吸取少量混合液，注入血细胞计数板小室，光学显微镜下数活细胞，重复3次，取其平均数。求其细胞增值率(％)＝(T-T0)/(C-T0)×100。其中C表示对照组的细胞数；T表示加药组的细胞数；T0表示对照平板测定加药时的细胞数。如果加药组最终的细胞数大于T0，说明细胞在加药后仍然生长。如果加药组最终的细胞数小于T0，说明加药后细胞被杀死。利用回归方程求出IC50。从实验结果看，加药组最终的细胞数小于T0，继而说明药物对细胞生长有抑制作用，加药后细胞被杀死。IC50值如下表所示：
顺铂 本发明化合物 黄连素 二甲双胍 IC50(μmol/L) 20.54±2.63 50.28±3.91 53.25±8.44 61.47±4.76
实验结果显示本发明化合物IC50值小于合成前单体化合物，即对HepG 2细胞抑制作用增强，但仍然弱于阳性对照药。
3、本发明所述化合物对K562细胞DNA的损伤
DNA损伤程度在一定程度上决定细胞生死，其检测方法用SCSE技术。本实验采用此技术(具体方法同一般检测细胞DNA损伤方法，此处不作详细说明)，检测黄连素对K562细胞DNA的损伤作用。将对数生长期的K562细胞以10×104·ml-1的浓度接种于24孔培养板中，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中预培养24h后加药.继续培养48h后，收集细胞(1000r·min-1离心5min，去上清)。用冷的PBS洗两次，加PBS混匀制成细胞悬液。
4、本发明所述化合物诱导K562细胞凋亡
原理：吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA使之发射明亮的绿光。溴乙锭(EB)仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(V)核染色质发绿色荧光，形态结构正常；早期凋亡细胞(EA)核染色质发黄绿色荧光，呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡细胞(LA)核染色质为橘红色或橙色，结构为固缩状或圆珠状；坏死细胞(N)核染色质发橘红色荧光，结构正常。
方法：取对数生长期的K562细胞，以5×104·ml-1接种于6孔板，每孔3mL，置于37℃、5.0％CO2的饱和湿度培养箱中培养24h后加药。K562细胞的受试药物浓度分别为40、80、160μm·L-1，对照组加入等体积的完全培养基。继续培养24、48h后，1000r·min-1收集细胞，PBS洗一次后取100L细胞悬液与4μLAO/EB染液(1：1100μg·mL-1)混匀，立即涂片，激发光波长为570nm荧光观察并计数至少300个细胞。计算细胞凋亡率(％)＝(EA+LA)/(V+N+EA+LA)×100％。以上实验重复3次以上。以不同浓度的本发明化合物组与对照组对K562作用24h后的细胞凋亡率为例来比较各化合物对K562细胞DNA的损伤作用。
实验结果显示，随着化合物浓度的增大，K562细胞凋亡率增加，说明凋亡率与样品浓度呈剂量依赖关系。
实施例12本发明所述化合物的降糖作用效果试验
以阿卡波糖为阳性对照药，先通过体外酶抑制试验，测定本发明化合物对葡萄糖苷酶的抑制作用，计算其IC50值，若该值较小，则可以考虑进行动物体内降糖试验。(此处体外酶抑制试验方案与上述抗炎方案相似，此处不作详细说明)，体内降糖试验方法，以高血糖大鼠为受试对象，来考察本发明化合物的体内降糖作用。
高血糖大鼠建模与分组：选取清洁级SD大鼠(200±209)70只，雌雄各半，平衡饲养3d，建模前用血糖仪检测全血血糖,无血糖异常情况。随机将大鼠分为对照组10，只建模组60只，分笼饲养,实验期间给予基础饲料和灭菌自来水。建模前12h禁食不禁水，于尾部静脉注射四氧嘧啶(6omg.kg-1体重)，对照组注射同剂量的生理盐水。连续观察5天后侧血糖，选择空腹血糖在13～20mmol·L-1之间实验用。
选取建模成功糖尿病大鼠40只，随机分为4组，每组10只，分别设立高血糖模型组、小檗碱组、本发明化合物组与阳性对照(二甲双胍)组，分别用0.5％苦味酸溶液标记，按组别分笼饲养，雌雄分开。
给药：2％吐温-80溶液配制给药用小檗碱、本发明化合物及二甲双胍溶液,浓度为10mg.ml-1。给药组大鼠按100mg.kg-1体重剂量灌胃对应药液10mL.kg-1,体重，对照组与模型组大鼠灌胃2％吐温-80溶液10mL.kg-1体重,每天灌胃给药1次，连续灌胃15天。动物实验在标准动物实验室进行，室温23±2℃，湿度50～60％，室内照明和黑暗交替12h/d，每天换水1次，两天换垫料1次，各组自由摄取饮水。
实验大鼠血糖测定及降血糖功能评价：于各给药组灌胃给药当天及给药后第5、10、15天尾静脉空腹取血，用血糖仪测定各组大鼠空腹血糖值，比较各组大鼠空腹血糖值及血糖下降百分率。血糖下降百分率＝(实验前血糖值-实验后血糖值)/实验前血糖值×100％。
统计学处理:采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学处理，所有计量数据以“均数+标准偏差(x±s)”表示，标准偏差按“n-1”方法计算,多组样本均数的比较，采用单因素方差分析，P<0.05判断差别具有统计学意义，P<0.01判断差别具有显著的统计学意义。
通过计算分析，本发明化合物与黄连素及二甲双胍相比，P<0.05，有统计学意义，有差异，说明本发明化合物的降糖效果优于单用黄连素及二甲双胍。
实施例13本发明所述化合物的降脂作用效果试验
以高脂饲料诱导的肥胖金黄地鼠为受试对象，给予本发明化合物后，检测体重，肝重，脂体比和血脂等指标，通过观察其减肥效果，进而探讨其降脂作用。
(一)材料
仪器：高速离心机，标准大鼠试验笼，电子秤；
药品与试剂：本发明化合物，奥里司他，甘油三酯试剂盒，HDL-C试剂盒，LDL-C试剂盒。
动物：雄性金黄地鼠60只，
(二)实验方法
动物造模与分组：60只雄性金黄地鼠给予基础饲料适应喂养3天后，随机选取10只作为正常对照组，剩余的让其自由采食高脂饲料(组成：10％猪油，10％蛋黄粉，1％胆固醇，79％基础饲料)。喂养四周后，空腹禁食不禁水12h，眼眶后取静脉血，测定其体重，TC，TG，LDL-C和HDL-C。将造模成功的金黄地鼠随机分为5组(n＝10)：模型组，奥利司他组，本发明化合物低、中、高剂量组，药物干预4周，正常对照组和模型组每天灌胃等体积生理盐水，奥里斯他组每天给药42mg/kg，本发明化合物低、中、高剂量分别按每天23.35、46.70、70.05mg/kg给药，金黄地鼠自由摄食，饮水；光照节律12L，12D(7:00-19:00)，室温(24±2)℃，湿度：(55±10)％。
(三)指标测定
1、体重、体长和剩食量测定：在试验期间，各组动物均采取单笼饲养并自由摄食，饮水。每3天测定一次体重(灌胃给药前称重)和剩食量，并记录结果。处死前麻醉状态下测定其体长(鼻至肛门的长度)、腰围，按公式[Lee，s＝(体重)-(1/3)×103/体长(cm)]计算Lee，s指数。
2、血清TC、TG、LDL-C、HDL-C测定：取血前，空腹禁食不禁水12h,用玻璃毛细管于眼眶后静脉取血，禁食2h后，5000r/min离心10min，取上清液，-20℃保存，采用生化试剂盒测定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C。
3、肝重、睾丸及肾周脂肪测定：剖取肝脏、肾周围脂肪和睾丸周围的全部脂肪并称重，计算脂肪/体重的比值(脂体比)。
(四)数据处理
以SPSS17.0软件对所得数据进行统计分析，计算数据以“均数+标准偏差”表示，进行单因素方差分析，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。以用药四周后本发明化合物组及阳性对照物使高脂血组小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C下降的百分率为例来初步探究该药物的降脂作用。
本发明化合物与黄连素及姜黄素相比(P<0.05)，有统计学差异，而三者与阳性对照药奥里司他相比(P<0.01)，有显著的统计学差异，即本发明化合物的降脂作用优于单用的黄连素或二甲双胍，但不及阳性对照药奥利司他。
实施例14本发明所述化合物对心脑血管疾病的作用效果试验
通过探讨本发明化合物对APOE(-/-)小鼠早期动脉粥样硬化的作用(主要通过观察对该鼠右颈总动脉外膜炎症、硬化血管胶原及弹力板的影响)，来研究本发明化合物在心脑血管疾病方面的作用。
(一)材料与方法
1、仪器与器材
(1)TISSUE-TEKII旋转式自动脱水机:日本樱花公司
(2)TISSUE-TEK,TECS组织包埋机:日本樱花公司
(3)冰冻切片机:德国Leica公司
(4)超低温冰箱:日本三洋公司
(5)普通光学显微镜:日本Nikon公司
(6)偏振光显微镜:日本Olympus公司
(7)荧光显微镜:日本Nikon公司
(8)ImagePro-Plus6.0图像分析软件:美国MacroMedia公司
(9)数据采集及分析系统SPSS17.0:美国PowerLab公司
(10)7600自动分析仪:日本日立公司
2、药物与试剂
(1)本发明化合物(自制)；
(2)阿托伐他汀：杭州默沙东制药有限公司；
(3)生理盐水注射液：北京双鹤药业有限公司；
(4)异戊巴比妥钠：国药集团化学试剂有限公司；
(5)苏木素-伊红生物染色剂：北京化工厂；
(6)磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS，0.01M，pH7.4)：称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCI调节溶液pH值至7.4，最后加蒸馏水定溶至IL；
(7)4％多聚甲醛液:称取409多聚甲醛，置于烧瓶中，加入800ml 0.l mol/L磷酸缓冲液，加热至60℃，磁力搅拌使粉末完全溶解，最后补足0.lmol/L的PB至1000ml，充分混匀；
(8)苦味酸天狼猩红染色液：0.1g天狼猩红，溶解于100ml苦味酸饱和液中。
(9)维多利亚蓝染色液：维多利亚蓝2g、糊精0.50g、间苯二酚4g，蒸馏水200mL，将上述混合煮沸5min,再将已煮沸的30％三氯化铁液加入上液中，继续煮沸2min，此时不断搅拌呈胶体状,去火冷却过滤后，把纸上的残渣放在60℃恒温箱中烤干，最后把干残渣溶于500ml的75％酒精中,再加入浓盐酸5ml和苯酚5g，置室温备用；
(10)罗丹明标记的羊抗兔IgG:北京中杉金桥生物技术公司；
(11)荧光防淬灭剂:北京中杉金桥生物技术公司。
(二)实验动物及分组
以C57BL/6为遗传背景的6周龄雄性APoE(-/-)小鼠20只，购于北京大学医学部。饲养于符合二级动物饲养标准的中日友好医院临床医学研究所动物室。室内净化空气流动换气，保持室温22℃～25℃，湿度50％左右，明暗周期12小时(7am-7Pm)。小鼠饲养于标准鼠笼中，鼠笼、饮水瓶、垫料均经高压消毒。小鼠自由饮水，适应性喂养6天后，饲以含猪油21％、胆固醇1.25％和普通混合饲料粉77.75％的高脂饲料(60钻灭菌照射处理)。实验动物操作过程严格遵照北京协和医学院及中日友好医院伦理委员会的规程进行，对动物的处理符合动物保护伦理道德。将小鼠随机分为4组，空白对照组、二甲双胍大、中、小剂量组，每组各5只，观察给药后不同剂量组对ApoE(-/-)小鼠早期动脉粥样硬化的影响。
给药方法：根据《药理实验方法学》(徐叔云主编，2002年第三版，人民卫生出版社)中的人与小鼠用药剂量换算公式，按体重对实验药物剂量进行换算。根据成人每日用药临床推荐的常用剂量，按成人与小鼠的体重折算系数9.01折算成小鼠用量，阿托伐他汀组给予阿托伐他汀3mg/kg/d，空白本发明化合物组给予生理盐水0.2ml/kg/d，本发明化合物组给予本发明化合物大剂量组240mg/kg/d、中剂量组160mg/kg/d、小剂量组80mg/kg/d以灌胃的方式给药，持续4周。
1、本发明化合物对Ap0E(-/-)小鼠早期动脉粥样硬化右颈总动脉外膜炎症的影响
取材与切片
(1)取材：实验小鼠禁食12h后，以1％异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，将其仰卧，头部及四肢固定于手术台上，酒精消毒后，纵形切开腹胸及颈部皮肤，逐层分离，剪开横隔，暴露心脏，下腔静脉取血后，以0.9％的生理盐水由左心室进行灌注，待血液冲洗干净后，暴露右颈总动脉鞘，游离出右颈总动脉，长约1cm，用冰生理盐水将其冲洗,滤纸吸干后，放在一涂有OCT冰冻切片包埋剂的直径为3cm的小圆形硬纸板上，并将OC丁涂在整个标本上，放在已有液氮预冷约1min的盛有异戊烷的小烧杯内冷冻成固态，后置于-80℃冰箱中保存备用。
(2)切片:从右颈总动脉近端下方开始以6μm的厚度连续横切，每50μm留取1张切片，将其置于载玻片上，每只小鼠取8张切片。
病理学检验及分析:冰冻切片行苏木素-伊红(HE)染色，在高倍镜下观察血管周围炎性细胞的浸润情况。观察范围为小鼠右颈总动脉及周围的间质组织,由于所染色的切面、显露的血管长度不同，观察到的面积也各不相同，加之样本炎细胞分布疏密程度有很大差别，为统一标准，我们都选取每一支被观察血管炎细胞分布密集的区域，每张切片在LEICA全自动图像分析系统上随机计算8个400倍物镜视野中阳性细胞总数作为该样本的统计数值。
冰冻切片HE染色步骤：
①冰冻切片，室温下恢复20min；
②切片入HarriS苏木素15min；
③流水冲洗5min；
④0.5％盐酸酒精分化30s；
⑤流水冲洗5min；
⑥伊红染色10min；
⑦流水冲洗5min；
⑧梯度酒精脱水；
⑨二甲苯透明15min×2次，中胜封片。
统计学处理：使用SPSSl7.0软件，剂量资料采用均数±标准差(x±S)表示,多组比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用LSD，P<0.05为差异有统计学意义。以大剂量组时，本发明化合物组及阳性对照药对小鼠右颈总动脉外膜炎症细胞个数的影响，来比较该药物对Ap0E(-/-)小鼠早期动脉粥样硬化右颈总动脉外膜炎症的影响，进而探讨其在心脑血管疾病方面的作用。
组别 阿托伐他汀 本发明化合物 黄连素 二甲双胍 炎症细胞数(个) 5±2 25±3 29±3 35±2
结果表明：本发明化合物与黄连素及二甲双胍相比(P<0.05)，有统计学差异，表明本发明化合物对小鼠右颈总动脉外膜炎症的抑制作用优于黄连素或二甲双胍。
2、本发明化合物对Ap0E(-/-)小鼠早期动脉粥样硬化血管胶原及弹力板的影响
实验动物，喂养分组，取材与切片同对Ap0E(-/-)小鼠早期动脉粥样硬化右颈总动脉外膜炎症实验相同。
病理学检验及分析：冰冻切片天狠猩红套染维多利亚蓝染色，冰冻切片天狼猩红染色选取切片以0.1％苦味酸天狼猩红染液染色，以评估I型和111型胶原。每只小鼠留取8张切片，这8张切片的胶原含量平均值代表每只小鼠的右颈总动脉胶原含量值。
苦味酸天狼猩红染色步骤：
(1)冰冻切片室温下恢复20min；
(2)移入二甲苯和纯酒精(1:1)混合液中5min左右；
(3)入100％、95％、85％、70％酒精，各级为5min；
(4)蒸馏水洗3次；
(5)以苦味酸天狼猩红染液染60min；
(6)无水酒精直接分化与脱水；
(7)二甲苯透明，中性树胶封片。
冰冻切片维多利亚蓝染色：选取切片以维多利亚蓝染液染色，以评估弹力纤维分级及内中膜厚度。每只小鼠留取8张切片，这8张切片的弹力纤维分级及其中膜厚度平均值代表每只小鼠的右颈总动脉弹力纤维分级及内中膜厚度的值。
维多利亚蓝染色步骤：
(l)冰冻切片室温下恢复20min；
(2)切片入75％酒精中洗1min；
(3)在维多利亚蓝染色液中30min左右；
(4)直接用95％酒精分色数秒钟；
(5)用蒸馏水洗三次，
(6)二甲苯透明，中性树胶封固。
统计学处理：使用SPSSl7.0软件，剂量资料采用均数±标准差(x±S)表示，多组比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用LSD，P<0.05为差异有统计学意义。以大剂量组时，本发明化合物组及阳性对照组对小鼠Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量(％)及弹力纤维Ⅰ级病率(％)的影响来考察该药物对Ap0E(-/-)小鼠早期动脉粥样硬化血管胶原及弹力板的影响。
组别 阿托伐他汀 本发明化合物 黄连素 二甲双胍 Ⅰ型胶原含量(％) 21.52±1.63 49.24±2.16 59.42±3.17 65.43±1.70 Ⅲ型胶原含量(％) 4.53±2.31 39.51±2.82 42.35±1.53 49.35±2.72 弹力纤维Ⅰ级病(％) 60.48±1.52 26.36±2.18 14.30±1.85 12.65±2.34
结果表明：以Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量(％)及弹力纤维Ⅰ级病率(％)为对照参数，本发明化合物与黄连素及二甲双胍比较(P<0.05)，有统计学差异，而三者与阳性对照组比较(P<0.01)，有显著的统计学差异，进而表明本发明化合物对Ap0E(-/-)小鼠早期动脉粥样硬化血管胶原及弹力板的影响优于单用黄连素或姜黄素，但不及阳性对照药。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。