胶原蛋白人造产品、胶原蛋白溶液制备方法及从动物组织中分离胶原蛋白的方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101213308 B (45)授权公告日 2011.12.21 CN 101213308 B *CN101213308B* (21)申请号 200680006404.5 (22)申请日 2006.03.09 10-2005-0020367 2005.03.11 KR C12P 21/00(2006.01) (73)专利权人 世源世龙股份有限公司 地址 韩国首尔特别市 (72)发明人 柳志喆 张在德 张晶皓 李玺邦 吕世根 高畅权 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11369 代理人 史霞 US 5814328 A,1998.0。

2、9.29, 全文 . Holger Notbohm et al.Comparative Study on the Thermostability of Collagen I of Skin and Bone: Influence of Posttranslational Hydroxylation of Prolyl and Lysyl Residues.Journal of Protein Chemistry .1992, 第 11 卷 ( 第 6 期 ),635-643. Boris BATGE et al.A critical crosslink region in human-bone。

3、-derived collagen type I Specific cleavage site at residue Leu95. Eur. J. Biochem. .1990, 第 192 卷 153-159. (54) 发明名称 胶原蛋白人造产品、 胶原蛋白溶液制备方法 及从动物组织中分离胶原蛋白的方法 (57) 摘要 本发明公开了不同动物组织中分离胶原蛋白 的方法， 制备胶原蛋白溶液的方法及胶原蛋白的 人造产品。为了这个目的， 本发明提供了一种从 动物组织制备胶原蛋白溶液的方法， 包括胶原蛋 白的最终处理 ： 在中性、 低温条件下处理就有预 定浓度的胶原蛋白溶液， 然后在 30 至 35。

4、过夜 处理 ； 离心收集胶原蛋白 ； 将收集到的胶原蛋白 溶解于弱酸溶剂或者磷酸缓冲盐溶液 (PBS)， 从 而制备浓度为 1 至 5mg/mL 的胶原蛋白溶液。本 发明由上述组成， 可以实现从动物骨和软骨组织、 皮肤组织和腱 / 韧带组织有效分离胶原蛋白的方 法， 从上述分离组织制备胶原蛋白溶液的方法， 利 用上述胶原蛋白制备基质和高度浓缩胶原蛋白溶 液。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2007.09.04 (86)PCT申请的申请数据 PCT/KR2006/000849 2006.03.09 (87)PCT申请的公布数据 WO2006/096027 EN 2006.。

5、09.14 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张小勇 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 4 页 说明书 6 页 附图 2 页 CN 101213308 B1/4 页 2 1. 一种从动物组织中分离胶原蛋白的方法， 从而获得重量为原始组织重量 5-10的 胶原蛋白， 包括 ： 1) 分离的猪骨组织经蒸馏水、 乙醇和丙酮充分洗涤 ； 2) 骨组织切成圆环形状， -20保存 ； 3) 为了从骨组织中分离胶原蛋白， 骨组织制成粒径 1-500m 的粉末 ； 4) 用乙醇和蒸馏水洗涤骨组织粉末 ； 5) 洗涤过的骨粉末用 0.5N HCl 过夜处理， 1。

6、0-100rpm 振荡 ； 6) 骨粉末用胃蛋白酶处理， 组织和胃蛋白酶的比例是 10-50 1， 胃蛋白酶用前溶在 0.1N HCl 中 ； 7) 胃蛋白酶反复处理 2 至 5 次， 共计 3 至 7 天 ； 8)蛋白酶处理过的骨粉末溶液， 4， 12,000g离心30分钟， 分离并保存上清， 沉淀重复 步骤 7) ； 9) 用终浓度为 0.5 至 0.8M 的 NaCl 溶液处理上述分离并保存的上清， 4， 4 小时至 1 天 ； 10)12,000g， 4离心 30 分钟， 弃沉淀， 收集上清 ； 11) 上清在中性条件下滴定至 NaCl 终浓度为 1.6M ； 12) 上述溶液 4处理。

7、 4 小时至 1 天， 离心， 弃沉淀， 收集上清 ； 13) 向收集到的上清中加入 NaCl， 至 NaCl 终浓度为 2.6M， 4静置 4 小时至 1 天 ； 14) 离心， 弃上清， 所得沉淀用 95乙醇洗涤一至两次， 蒸馏水重悬 ； 15) 在重悬溶液中加入 1N HCl， 每 100mL 悬浮液加 1mL 1N HCl， 4中性条件下滴定 ； 16) 上述滴定溶液 30-37静置 4 小时至 1 天， 离心 ； 17) 沉淀下来的胶原蛋白用弱酸溶剂或 PBS 重悬， 浓度为 1-30mg/mL， 4保藏。 2. 如权利要求 1 所述的从动物组织制备胶原蛋白溶液的方法， 对胶原蛋白做。

8、最后处 理， 其特征在于， 在上述步骤 17) 之后， 包括 18) 中性、 低温条件下， 将胶原蛋白溶液处理成预定浓度， 接下来 30-35过夜处理 ； 离心收集胶原蛋白 ； 将收集到的胶原蛋白溶解于冷弱酸溶剂或者磷酸缓冲盐溶液， 制备胶原蛋白浓度为 1-5mg/mL 的溶液。 3.如权利要求1或2所述的制备胶原蛋白基质的方法， 其特征在于， 在上述步骤17)或 18) 之后包括 ： 向适合浓度和 pH 值的胶原蛋白溶液中注入经过滤的纯空气， 形成预定的气孔 ； 冻干形成气孔的溶液制成基质 ； 所述基质是由浓度为 3-5mg/mL 的胶原蛋白溶液制成的， 将过滤的纯空气注入到 pH 值 为 。

9、5.0-6.0 的胶原蛋白溶液中， 形成预定的气孔， 冻干已形成气孔的胶原蛋白溶液， 包装， 冻干产品热处理， 然后环氧乙烷气体或者 射线照射灭菌， 由此制备胶原蛋白基质。 4. 一种从动物组织中分离胶原蛋白的方法， 从而获得重量为原始组织重量 5-10的 胶原蛋白， 包括 ： 1) 分离的猪骨组织经蒸馏水、 乙醇和丙酮充分洗涤 ； 2) 为了从软骨组织中分离胶原蛋白， 软骨组织制成粒径为 1-500m 的粉末 ； 权 利 要 求 书 CN 101213308 B2/4 页 3 3) 软骨组织粉末用乙醇和蒸馏水洗涤 ； 4) 上述洗涤过的软骨组织用盐酸胍溶液过夜处理， 盐酸胍溶液为 4M 盐酸。

10、胍， 0.05M Tris-HCl， pH7.5 ； 5) 过夜处理的软骨粉末用 0.1N HCl 洗涤一至两次 ； 6) 洗过的软骨粉末用 0.5N HCl 过夜处理， 10 至 100rpm 振荡 ； 7)软骨粉末用胃蛋白酶处理， 组织和胃蛋白酶的比例是10-501， 胃蛋白酶用前溶在 0.1N HCl 中 ； 8) 胃蛋白酶反复处理 2 至 5 次， 共计 3 至 7 天 ； 9)胃蛋白酶处理过的软骨粉末溶液， 4， 12,000g离心30分钟， 分离并保存上清， 沉淀 重复步骤 8) ； 10) 用终浓度为 0.5-0.8M 的 NaCl 溶液处理上述分离并保存的上清， 4， 4 小时。

11、至 1 天 ； 11)12,000g， 4离心 30 分钟， 弃沉淀， 收集上清 ； 12) 上清在中性条件下滴定至 NaCl 终浓度为 2.6M ； 13) 上述溶液 4处理 4 小时至 1 天， 离心， 弃沉淀， 收集上清 ； 14) 向收集到的上清中加入 NaCl， 至 NaCl 终浓度为 3.5-4.0M， 4静置 4 小时至 1 天 ； 15) 离心， 弃上清， 所得沉淀用 95乙醇洗涤一至两次， 蒸馏水重悬 ； 16) 在重悬溶液中加入 1N HCl， 每 100mL 悬浮液加 1mL 1N HCl， 4中性条件下滴定 ； 17) 上述滴定溶液 30-37静置 4 小时至 1 天，。

12、 离心 ； 18) 沉淀下来的胶原蛋白用弱酸溶剂或 PBS 重悬， 浓度为 1-30mg/mL， 4保藏。 5. 如权利要求 4 所述的从动物组织制备胶原蛋白溶液的方法， 对胶原蛋白做最后处 理， 其特征在于， 在上述步骤 18) 之后， 包括 ： 19) 中性、 低温条件下， 将胶原蛋白溶液处理成预定浓度， 接下来 30-35过夜处理 ； 离心收集胶原蛋白 ； 将收集到的胶原蛋白溶解于冷弱酸溶剂或者磷酸缓冲盐溶液， 制备胶原蛋白浓度为 1-5mg/mL 的溶液。 6.如权利要求4或5所述的制备胶原蛋白基质的方法， 其特征在于， 在上述步骤18)或 19) 之后， 包括 ： 向适合浓度和 pH。

13、 值的胶原蛋白溶液中注入经过滤的纯空气， 形成预定的气孔 ； 冻干形成气孔的溶液制成基质 ； 所述基质是由浓度为 3-5mg/mL 的胶原蛋白溶液制成的， 将过滤的纯空气注入到 pH 值 为 5.0-6.0 的胶原蛋白溶液中， 形成预定的气孔， 冻干已形成气孔的胶原蛋白溶液， 包装， 冻干产品热处理， 然后环氧乙烷气体或者 射线照射灭菌， 由此制备胶原蛋白基质。 7. 一种从动物组织中分离胶原蛋白的方法， 从而获得重量为原始组织重量的 10 -15的胶原蛋白， 包括 ： 1) 分离的猪皮组织经蒸馏水和乙醇充分洗涤， -20保藏 ； 2) 为了从皮肤组织中分离胶原蛋白， 皮肤组织制成厚度为 50。

14、0m-5mm 的片状 ； 3) 片状组织置于网格尺寸为 200-500m 的网中， 用乙醇和蒸馏水洗涤 ； 4)洗涤过的皮肤组织用胃蛋白酶处理， 其中组织和胃蛋白酶的比例是10-501， 胃蛋 权 利 要 求 书 CN 101213308 B3/4 页 4 白酶用前溶在 0.1N HCl 中 ； 5) 胃蛋白酶重复处理 2-3 次， 共计 2-3 天 ； 6) 胃蛋白酶处理过的皮肤组织溶液 4， 12,000g 离心 30 分钟， 分离并保存上清， 沉淀 重复步骤 5) ； 7) 用终浓度为 0.5 至 0.8M 的 NaCl 溶液处理上述分离并保存的上清， 4， 4 小时至 1 天 ； 8)。

15、12,000g， 4离心 30 分钟， 弃沉淀， 收集上清 ； 9) 上清在中性条件下滴定至 NaCl 终浓度为 1.6M ； 10) 上述溶液 4处理 4 小时至 1 天， 离心， 弃沉淀， 收集上清 ； 11) 向收集到的上清中加入 NaCl， 至 NaCl 终浓度为 2.6M， 4静置 4 小时至 1 天 ； 12) 离心， 弃上清， 所得沉淀用 95乙醇洗涤一至两次， 蒸馏水重悬 ； 13) 在重悬溶液中加入 1N HCl， 每 100mL 悬浮液加 1mL1N HCl， 4中性条件下滴定 ； 14) 上述滴定溶液 30 至 37静置 4 小时至 1 天， 离心 ； 15) 沉淀下来的。

16、胶原蛋白用弱酸溶剂或 PBS 重悬， 浓度为 1-30mg/mL， 4保藏。 8. 如权利要求 7 所述的从动物组织制备胶原蛋白溶液的方法， 对胶原蛋白做最后处 理， 其特征在于， 在上述步骤 15) 之后， 包括 ： 16) 中性、 低温条件下， 将胶原蛋白溶液处理成预定浓度， 接下来 30-35过夜处理 ； 离心收集胶原蛋白 ； 将收集到的胶原蛋白溶解于冷弱酸溶剂或者磷酸缓冲盐溶液， 制备胶原蛋白浓度为 1-5mg/mL 的溶液。 9.如权利要求7或8所述的制备胶原蛋白基质的方法， 其特征在于， 在上述步骤15)或 16) 之后， 包括 ： 向适合浓度和 pH 值的胶原蛋白溶液中注入经过滤。

17、的纯空气， 形成预定的气孔 ； 冻干形成气孔的溶液制成基质 ； 所述基质是由浓度为 3-5mg/mL 的胶原蛋白溶液制成的， 将过滤的纯空气注入到 pH 值 为 5.0-6.0 的胶原蛋白溶液中， 形成预定的气孔， 冻干已形成气孔的胶原蛋白溶液， 包装， 冻干产品热处理， 然后环氧乙烷气体或者 射线照射灭菌， 由此制备胶原蛋白基质。 10. 一种从动物组织中分离胶原蛋白的方法， 从而获得重量为原始组织重量 10 -20的胶原蛋白， 包括 ： 1) 分离的猪腱 / 肌肉组织用蒸馏水和乙醇充分洗涤， -20保藏 ； 2) 为了从腱 / 韧带组织中分离胶原蛋白， 腱 / 韧带组织制成厚度为 500m。

18、-5mm 的片 状 ； 3) 用乙醇和蒸馏水洗涤组织片 ； 4) 洗涤过的腱 / 韧带组织用胃蛋白酶处理， 组织和胃蛋白酶的比例是 10-50 1， 胃蛋 白酶用前溶在 0.1N HCl 中 ； 5) 胃蛋白酶重复处理 2-3 次， 共计 2-3 天 ； 6) 胃蛋白酶处理过的腱 / 韧带组织溶液， 4， 12,000g 离心 30 分钟， 分离并保存上清， 沉淀重复步骤 5 ； 7) 用终浓度为 0.5-0.8M 的 NaCl 溶液处理上述分离并保存的上清， 4， 4 小时至 1 天 ； 权 利 要 求 书 CN 101213308 B4/4 页 5 8)12,000g， 4离心 30 分钟。

19、， 弃沉淀， 收集上清 ； 9) 上清在中性条件下滴定至 NaCl 终浓度为 1.6M ； 10) 上述溶液 4处理 4 小时至 1 天， 离心， 弃沉淀， 收集上清 ； 11) 向收集到的上清中加入 NaCl， 至 NaCl 终浓度为 2.6M， 4静置 4 小时至 1 天 ； 12) 离心， 弃上清， 所得沉淀用 95乙醇洗涤一至两次， 蒸馏水重悬 ； 13) 在重悬溶液中加入 1N HCl， 每 100mL 悬浮液加 1mL1N HCl， 4中性条件下滴定 ； 14) 上述滴定溶液 30-37静置 4 小时至 1 天， 离心 ； 15) 沉淀下来的胶原蛋白用弱酸溶剂或 PBS 重悬， 浓。

20、度为 1-30mg/mL， 4保藏。 11. 如权利要求 10 所述的从动物组织制备胶原蛋白溶液的方法， 对胶原蛋白做最后处 理， 其特征在于， 在上述步骤 15) 之后， 包括 ： 16) 中性、 低温条件下， 将胶原蛋白溶液处理成预定浓度， 接下来 30-35过夜处理 ； 离心收集胶原蛋白 ； 将收集到的胶原蛋白溶解于冷弱酸溶剂或者磷酸缓冲盐溶液， 制备胶原蛋白浓度为 1-5mg/mL 的溶液。 12. 如权利要求 10 或 11 所述的制备胶原蛋白基质的方法， 其特征在于， 在上述步骤 15) 或 16) 之后， 包括 ： 向适合浓度和 pH 值的胶原蛋白溶液中注入经过滤的纯空气， 形成。

21、预定的气孔 ； 冻干形成气孔的溶液制成基质 ； 所述基质是由浓度为 3-5mg/mL 的胶原蛋白溶液制成的， 将过滤的纯空气注入到 pH 值 为 5.0-6.0 的胶原蛋白溶液中， 形成预定的气孔， 冻干已形成气孔的胶原蛋白溶液， 包装， 冻干产品热处理， 然后环氧乙烷气体或者 射线照射灭菌， 由此制备胶原蛋白基质。 权 利 要 求 书 CN 101213308 B1/6 页 6 胶原蛋白人造产品、 胶原蛋白溶液制备方法及从动物组织 中分离胶原蛋白的方法 技术领域 0001 本发明涉及从不同动物组织中分离胶原蛋白的方法， 制备胶原蛋白溶液的方法及 胶原蛋白的人造产品。本发明尤其涉及一种从动物骨。

22、骼、 软骨组织、 皮肤组织及腱 / 韧带组 织有效分离胶原蛋白的方法， 一种利用上述分离组织制备胶原蛋白溶液、 胶原蛋白基质及 高度浓缩胶原蛋白溶液的方法。 背景技术 0002 通常， 胶原蛋白是一种构成动物骨骼、 软骨、 牙齿、 腱、 皮肤及鱼鳞的硬质蛋白。胶 原蛋白是一种纤维样的固体， 在电子显微镜下观察， 呈现为缠结的具有交叉条纹的周期结 构。 0003 胶原蛋白是一种结构蛋白， 常常存在于各种哺乳动物中， 其构成了机体所有蛋白 总重量的 30。目前， 已知的胶原蛋白有 20 种， 其中 I 型胶原蛋白是最大量的。胶原蛋白 是由分子量大约为 300kDa 的单体蛋白通过特定位点的共价键横。

23、向连接而成的。因此， 成熟 的胶原蛋白呈现为一种典型的纤维样形状， 不溶于水， 具有高拉伸强度。 胶原蛋白由组成型 氨基酸构成， 例如， 甘氨酸、 脯氨酸、 羟基脯氨酸、 丙氨酸及谷氨酸， 其显著特征是羟基脯氨 酸含量高， 这在其它形式的蛋白中是不常见的。 0004 其中， 胶原蛋白具有一种结构， 三个多肽链通过氢键围绕另一个多肽链呈螺旋状 扭转。 胶原蛋白在水、 弱酸和弱碱中不降解， 但是胶原蛋白煮沸后导致其变成单链结构的明 胶， 是可溶的。与明胶不同， 胶原蛋白不需加热即有一定的粘度， 因此其易于凝胶化。另外， 由于胶原蛋白的分子量比明胶大， 胶原蛋白更适合生物组织并且具有高生物活性。 因。

24、此， 当 用胶原蛋白处理伤口时， 与明胶促进组织再生相比， 胶原蛋白更易促进愈合过程。另外， 即 使胶原蛋白变硬， 其还是具有高柔韧性， 并且在短时间内快速横向连接， 这致使减少凝胶化 时间。胶原蛋白对蛋白水解酶不敏感， 例如胰蛋白酶、 胃蛋白酶、 无花果蛋白酶、 木瓜蛋白 酶和弹性蛋白酶， 但是其易被胶原酶降解。从组织中分离胶原蛋白包括有机溶剂萃取， 酸 / 碱处理， 蛋白水解酶作用， 例如胰蛋白酶、 胃蛋白酶、 无花果蛋白酶、 木瓜蛋白酶和弹性蛋白 酶， 得到胶原蛋白。 0005 另外， 为了体内应用， 如上获得的胶原蛋白溶解于生物无毒溶剂， 例如水、 生理盐 水、 硼酸盐缓冲液， 或者含。

25、盐水溶液， 例如氯化钠、 蛋白质、 糖和脂肪。 0006 目前， 许多提高胶原蛋白分离效率的方法正在研究中。为了保证足够的医疗用途 用胶原蛋白， 需要大量的原材料， 也需要胶原蛋白分离方法的重大改进。 0007 尤其， 胶原蛋白不仅在提高血小板浓度和聚集血小板方面有一定作用， 而且可以 通过改变血小板的形状和生物化学结构来激活血小板， 因此胶原蛋白可以广泛地被应用于 止血剂。 0008 自从十九世纪五十年代以来， 已有大量分离胶原蛋白的方法， 但是分离非变性形 式的纯胶原蛋白是十分困难的。 因此， 为了在不同领域应用胶原蛋白， 发展从不同组织中分 说 明 书 CN 101213308 B2/6。

26、 页 7 离胶原蛋白并获得大量胶原蛋白的方法是必要的。 0009 然而， 现在已知的分离胶原蛋白的方法是从哺乳动物 ( 鼠、 牛、 猪及类似物 ) 的皮 肤或腱中分离胶原蛋白。不幸的是还没有能从骨组织中分离胶原的方法。 发明内容 0010 本发明鉴于上述问题， 第一个目的是提供一种从动物不同组织中分离及利用胶原 蛋白的方法。 0011 为了这个目的， 本发明的第二个目的是提供一种从动物骨及软骨组织、 皮肤组织 和腱 / 肌肉组织中有效分离胶原蛋白的方法。 0012 本发明的第三个目的是提供一种从上述分离组织中制备胶原蛋白溶液的方法。 0013 本发明的第四个目的在于提供一种利用上述胶原蛋白溶液。

27、制备胶原蛋白基质和 高度浓缩胶原蛋白溶液的方法。 0014 本发明的第五个目的在于提供一种从各种动物组织中分离胶原蛋白的方法， 一种 制备胶原蛋白溶液及人造产品的方法， 通过显著地提高产品质量和可靠性来提高消费者的 满意度。 0015 上述其它目的与本发明的一个方面一致， 通过提供用动物不同组织制备胶原蛋白 溶液的方法来实现， 包括在最终处理胶原蛋白后将具有预定浓度的胶原蛋白溶液置于低温 中性条件， 然后 30-35过夜处理 ； 离心收集胶原蛋白 ； 将上述收集的胶原蛋白溶解于冷弱 酸溶剂或者磷酸缓冲盐溶液 (PBS)， 胶原蛋白的浓度为 1 至 5mg/mL。 0016 为达到上述目的， 本。

28、发明的首选方式将配合附图作详细描述。 0017 本发明应用的一种从动物不同组织分离胶原蛋白的方法， 一种制备胶原蛋白溶液 及人工制品的方法， 参见图 1 至图 4。 0018 与本发明以下的描述相关， 考虑到与本发明相关的已知功能或结构的描述可能会 使本发明不清楚， 其中的详细描述会被省略掉。 0019 下文提到的术语是考虑到本发明的功能而确定的， 可能与厂商的意图或者相关领 域的普通实践不同。因此， 这里用到的术语是根据本发明的说明书内容定义的。 0020 本发明提供可一种改进的从不同组织中有效分离胶原蛋白的方法， 尤其是从骨组 织中分离胶原蛋白的方法， 及分离的胶原蛋白的应用方法。 002。

29、1 这里使用的术语 “分离的胶原蛋白” 是指胶原蛋白经处理后去除了强抗原性肽， 用 酸或酶从不同动物中提取来的， 例如胃蛋白酶、 胰蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶、 木瓜蛋白酶和无 花果蛋白酶。 0022 本发明所述的胶原蛋白在 4-10， 酸性条件下可溶， 但是在 30-37， 中性条件下 不可溶解。另外， 当预定浓度的胶原蛋白在 30-37时， 将 PH 值由酸性调至中性， 本发明所 述的胶原蛋白呈凝胶形式。 给胶原蛋白一个刺激导致其由凝胶形式转变为不可溶的纤维样 形式。 0023 在本方法适合的温度和 PH 条件下， 在 4， 中性条件下滴定胶原蛋白， 在预定的时 间段内， 甚至是中性条件下， 。

30、可以保持特定的溶液状态。 0024 另外， 利用胶原蛋白在不同 PH 值、 温度、 盐浓度和乙醇沉淀条件下的优点分离胶 原蛋白。 说 明 书 CN 101213308 B3/6 页 8 0025 进一步， 本发明利用胶原蛋白置于 30-37， 中性条件下一段时间可发生分层分离 的特点聚集胶原蛋白， 离心使胶原蛋白沉淀。 0026 如下文讨论， 胶原蛋白可以提高血小板浓度， 引起血小板凝集， 通过改变血小板形 状和生物化学结构来激活血小板。因此胶原蛋白可以被广泛应用于止血剂。 0027 胶原蛋白的粘度与 PH 相关， 在 pH5.0 至 6.0 粘度最高。 0028 为此， 本发明所述的胶原蛋白。

31、经过最终处理， 胶原蛋白溶液具有一个预定的浓度， 先在低温、 中性条件下处理， 然后 30-35振荡过夜处理。过夜处理后， 离心收集胶原蛋白， 浓缩的胶原蛋白溶解在弱酸溶剂或者磷酸缓冲盐溶液 (PBS)， 冷藏， 制备胶原蛋白浓度为 1-5mg/mL 的胶原蛋白溶液。 0029 本发明所述的胶原蛋白可被应用于制备基质和高度浓缩溶液。 0030 如图 3 所示， 基质的制备是将过滤纯空气注入到适合浓度和 PH 值的胶原蛋白中， 形成预定气孔， 冻干， 干热干燥。 0031 胶原蛋白基质是由浓度为 3-5mg/mL 的胶原蛋白溶液制备的。特别地， 过滤纯空气 被注入至 PH 为 5.0-6.0 的。

32、胶原蛋白溶液中， 因此形成预定的气孔。然后将形成气孔的胶原 蛋白溶液冻干处理， 热处理包装， 环氧乙烷气体或 - 射线照射灭菌， 形成胶原蛋白基质。 基质根据模子的形状可以被制成各种形式。上述制备的基质可以用作止血剂， 支持物及类 似物， 不同形式的胶原蛋白止血剂及支持物通常可以在市场上购买到。 进一步， 胶原蛋白基 质还可以包括其它成分， 例如纤维蛋白原、 凝血酶， 用来提高胶原蛋白作为止血剂的作用。 所述胶原蛋白基质还可以用在附着有止血剂的绑带上。 0032 为了利用高度浓缩胶原蛋白， 参见图 4， 本发明通过用孔径为的 0.22m 的滤器过 滤灭菌浓度为 1mg/mL 的胶原蛋白溶液， 。

33、然后浓缩灭菌胶原蛋白至胶原蛋白浓度为 3-7， 制备胶原蛋白溶液。高度浓缩胶原蛋白溶液可以作为皮肤去皱填充物， 作为相关产品还可 以购买到。另外， 在伤口和被损坏区域喷洒含有抗生物质或者生长因子的高度浓缩胶原蛋 白溶液， 可以促进创伤和损坏区域组织再生。 附图说明 0033 图 1 是本发明制备的胶原蛋白 SDS-PAGE 电泳分离结果照片 ； 0034 图 2 是利用图象分析仪分析本发明制备的胶原蛋白结果曲线图及照片 ； 0035 图 3 是利用本发明的胶原蛋白制造的基质产品照片 ； 0036 图 4 是利用本发明胶原蛋白制造的高度浓缩胶原蛋白溶液照片。 具体实施方式 0037 现在， 参考。

34、如下实施例， 对本发明做进一步详细描述。 这些实施例仅用于解释本发 明， 不限制本发明的范围和精神。 0038 实施例 1 0039 将猪骨组织粉碎成粒径为 1-500m 的粉末， 用 0.5N HCl 处理。经酸处理的骨组 织用胃蛋白酶重复处理 2 至 5 次， 共计 3 至 7 天， 分离 I 型胶原蛋白， I 型胶原蛋白用盐处 理进行分级分离和乙醇处理， 从而获得重量为原始组织重量5-10的胶原蛋白。 特别地， 本 程序如下做进一步详细描述 ： 说 明 书 CN 101213308 B4/6 页 9 0040 1. 分离的猪骨组织经蒸馏水、 乙醇、 丙酮及类似物充分洗涤。 0041 2.。

35、 骨组织切成圆环形状， -20保存。 0042 3. 为了从骨组织中分离胶原蛋白， 骨组织制成粒径为 1-500m 的粉末。 0043 4. 研磨成粉末的骨组织用乙醇和蒸馏水洗涤。 0044 5. 上述洗涤过的骨粉末用 0.5N HCl 过夜处理， 10-100rpm 振荡。 0045 6. 过夜处理后， 骨粉末用胃蛋白酶处理， 组织和胃蛋白酶的比例是 10-50 1， 胃 蛋白酶用前溶在 0.1N HCl 中。 0046 7. 胃蛋白酶处理 2-5 次， 共计 3-7 天。 0047 8. 胃蛋白酶处理过的骨粉末溶液 4， 12,000g 离心 30 分钟， 分离并保存上清， 沉 淀重复步骤。

36、 7。 0048 9. 用终浓度为 0.5 至 0.8M 的 NaCl 处理上述分离并保存的上清， 4， 4 小时至 1 天。 0049 10.12,000g， 4离心 30 分钟， 弃沉淀， 收集上清。 0050 11. 上清在中性条件下滴定至 NaCl 终浓度为 1.6M。 0051 12. 上述溶液 4处理 4 小时至 1 天， 离心， 弃沉淀， 收集上清。 0052 13. 向收集到的上清中加入 NaCl， 至 NaCl 终浓度为 2.6M， 4静置 4 小时至 1 天。 0053 14. 离心， 弃上清， 所得沉淀用 95乙醇洗涤一至两次， 蒸馏水重悬。 0054 15. 在重悬溶液。

37、中加入 1N HCl， 每 100mL 悬浮液加 1mL1N HCl， 4中性条件下滴 加。 0055 16. 上述滴定溶液 30-37静置 4 小时至 1 天， 离心。 0056 17. 沉淀下来的胶原蛋白用弱酸溶剂或 PBS 重悬， 浓度为 1-30mg/mL， 4保藏。 0057 实施例 2 0058 将猪软骨组织粉碎为粉末， 用 0.5N HCl 处理。经酸处理的软骨组织用胃蛋白酶重 复处理， 分离 II 型胶原蛋白， II 型胶原蛋白用盐处理进行分级分离和乙醇处理， 从而获得 重量为原始组织重量 5 -10的胶原蛋白。特别地， 本程序如下做进一步详细描述 ： 0059 1. 分离的猪。

38、软骨组织经蒸馏水、 乙醇、 丙酮及类似物充分洗涤。 0060 2. 为了从软骨组织中分离胶原蛋白， 软骨组织制成粒径为 1-500m 的粉末。 0061 3. 研磨成粉末的软骨组织用乙醇和蒸馏水洗涤。 0062 4. 上述洗涤过的软骨粉末用盐酸胍溶液 (4M 盐酸胍， 0.05MTris-HCl， pH 7.5) 过 夜处理。 0063 5. 过夜处理的软骨粉末用 0.1N HCl 洗涤一至两次。 0064 6. 软骨粉末用 0.5N HCl 过夜处理， 10 至 100rpm 振荡。 0065 7. 过夜处理后， 软骨粉末用胃蛋白酶处理， 组织和胃蛋白酶的比例是 10-50 1， 胃蛋白酶用。

39、前溶在 0.1N HCl 中。 0066 8. 胃蛋白酶处理 2-5 次， 共计 3-7 天。 0067 9. 胃蛋白酶处理过的软骨粉末溶液 4， 12,000g 离心 30 分钟， 分离并保存上清， 沉淀重复步骤 8。 0068 10.用终浓度为0.5-0.8M的NaCl处理上述分离并保存的上清， 4， 4小时至1天。 0069 11.12,000g， 4离心 30 分钟， 弃沉淀， 收集上清。 说 明 书 CN 101213308 B5/6 页 10 0070 12. 上清在中性条件下滴定至 NaCl 终浓度为 2.6M。 0071 13. 上述溶液 4处理 4 小时至 1 天， 离心， 。

40、弃沉淀， 收集上清。 0072 14. 向收集到的上清中加入 NaCl， 至 NaCl 终浓度为 3.5-4.0M， 4静置 4 小时至 1 天。 0073 15. 离心， 弃上清， 所得沉淀用 95乙醇洗涤一至两次， 蒸馏水重悬。 0074 16. 在重悬溶液中加入 1N HCl， 每 100mL 悬浮液加 1mL1N HCl， 4中性条件下滴 加。 0075 17. 上述滴定溶液 30-37静置 4 小时至 1 天， 离心。 0076 18. 沉淀下来的胶原蛋白用弱酸溶剂或 PBS 重悬， 浓度为 1-30mg/mL， 4保藏。 0077 实施例 3 0078 将猪皮肤组织制成厚度为500。

41、m-5mm的片， 置于网格尺寸为200-500m的网中， 用 0.5N HCl 处理。经酸处理的软骨组织用胃蛋白酶重复处理， 分离 I 型胶原蛋白， I 型胶 原蛋白用盐处理进行分级分离和乙醇处理， 从而获得重量为原始组织重量 10 -15的胶 原蛋白。特别地， 本程序如下做进一步详细描述 ： 0079 1. 分离的猪皮肤组织经蒸馏水、 乙醇及类似物充分洗涤， -20保藏。 0080 2. 为了从皮肤组织中分离胶原蛋白， 皮肤组织制成厚度为 500m-5mm 的片状。 0081 3. 片状组织至于网格尺寸为 200-500m 的网中， 用乙醇和蒸馏水洗涤。 0082 4. 洗涤过的组织片用胃蛋。

42、白酶 ( 组织和胃蛋白酶的比例是 10-50 1， 胃蛋白酶 用前溶在 0.1N HCl 中 ) 处理。 0083 5. 胃蛋白酶重复处理 2-3 次， 共计 2-3 天。 0084 6.胃蛋白酶处理过的皮肤组织溶液， 4， 12,000g离心30分钟， 分离并保存上清， 沉淀重复步骤 5。 0085 7. 用终浓度为 0.5 至 0.8M 的 NaCl 处理分离并保存的上清， 4， 4 小时至 1 天。 0086 8.12,000g， 4离心 30 分钟， 弃沉淀， 收集上清。 0087 9. 上清在中性条件下滴定至 NaCl 终浓度为 1.6M。 0088 10. 上述溶液 4处理 4 小。

43、时至 1 天， 离心， 弃沉淀， 收集上清。 0089 11. 向收集到的上清中加入 NaCl， 至 NaCl 终浓度为 2.6M， 4静置 4 小时至 1 天。 0090 12. 离心， 弃上清， 所得沉淀用 95乙醇洗涤一至两次， 蒸馏水重悬。 0091 13. 在重悬溶液中加入 1N HCl， 每 100mL 悬浮液加 1mL1N HCl， 4中性条件下滴 加。 0092 14. 上述滴定溶液 30-37静置 4 小时至 1 天， 离心。 0093 15. 沉淀下来的胶原蛋白用弱酸溶剂或 PBS 重悬， 浓度为 1-30mg/mL， 4保藏。 0094 实施例 4 0095 将猪腱 / 。

44、韧带组织制成厚度为 500m-5mm 的片， 用胃蛋白酶处理， 分离 I 型胶 原蛋白， I 型胶原蛋白用盐处理进行分级分离和乙醇处理， 从而获得重量为原始组织重量 10 -20的胶原蛋白。特别地， 本程序如下做进一步详细描述 ： 0096 1. 分离的猪腱 / 韧带组织经蒸馏水、 乙醇及类似物充分洗涤， -20保藏。 0097 2.为了从腱/韧带组织中分离胶原蛋白， 腱/韧带组织制成厚度为500m-5mm的 片状。 说 明 书 CN 101213308 B6/6 页 11 0098 3. 用乙醇和蒸馏水洗涤组织片。 0099 4.洗涤过的组织片用胃蛋白酶处理， 组织和胃蛋白酶的比例是10-5。

45、01， 胃蛋白 酶用前溶在 0.1N HCl 中。 0100 5. 胃蛋白酶重复处理 2-3 次， 共计 2-3 天。 0101 6. 胃蛋白酶处理过的腱 / 韧带组织溶液， 4， 12,000g 离心 30 分钟， 分离并保存 上清， 沉淀重复步骤 5。 0102 7. 用终浓度为 0.5-0.8M 的 NaCl 处理上述分离并保存的上清， 4， 4 小时至 1 天。 0103 8.12,000g， 4离心 30 分钟， 弃沉淀， 收集上清。 0104 9. 上清在中性条件下滴定至 NaCl 终浓度为 1.6M。 0105 10. 上述溶液 4处理 4 小时至 1 天， 离心， 弃沉淀， 收。

46、集上清。 0106 11. 向收集到的上清中加入 NaCl， 至 NaCl 终浓度为 2.6M， 4静置 4 小时至 1 天。 0107 12. 离心， 弃上清， 所得沉淀用 95乙醇洗涤一至两次， 蒸馏水重悬。 0108 13. 在重悬溶液中加入 1N HCl， 每 100mL 悬浮液加 1mL1N HCl， 4中性条件下滴 加。 0109 14. 上述滴定溶液 30-37静置 4 小时至 1 天， 离心。 0110 15. 沉淀下来的胶原蛋白用弱酸溶剂或 PBS 重悬， 浓度为 1-30mg/mL， 4保藏。 0111 实施例 1-4 提到的效果通过 SDS-PAGE 分析结果可以得到证实。

47、， 参见图 1 所示， 相 关条带分子量分别是大约 140kDa 和 130kDa。 0112 另外， 图 2 所示的胶原蛋白图象分析结果证实了 I 型胶原蛋白的特性， 例如 1 2 是 2 1， 此为实验结果的评估。图 3 展示了利用本发明所得的胶原蛋白制备的 人造基质产品。图 4 展示了利用本发明的胶原蛋白制备的人造高度浓缩胶原蛋白溶液。 0113 从以上描述可见本发明可以从动物不同组织中分离并利用胶原蛋白。为了这个 目的， 本发明提供了一种从动物骨、 软骨组织、 皮肤和腱 / 韧带组织有效分离胶原蛋白的方 法， 一种利用上述分离组织制备胶原蛋白溶液的方法， 一种利用胶原蛋白溶液制备基质和 高度浓缩溶液的方法。 因此， 本发明实现了产品的高质量和可靠性， 有助于提高消费者的满 意度。 0114 尽管本发明的较佳实施例揭示了目的， 然而对本技术的修改、 增加和代替是允许 的， 并没有避开本发明的权利范围和精神。 说 明 书 CN 101213308 B1/2 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101213308 B2/2 页 13 说 明 书 附 图 。