技术领域
本发明涉及一种评价增溶性辅料生物安全性的方法，属于药用辅 料领域。具体地，本发明以嗜热四膜虫为生物模型，结合微量量热法， 考察增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢的影响，从而评价增溶性辅料 的生物安全性。
背景技术
增溶性辅料大多是一类非离子表面活性剂，其结构中既有亲水基 团，又有亲油基团，在溶液中可以形成胶束或反胶束，作为增溶剂、 乳化剂在难溶药物液体制剂中应用。随着现代液体制剂的改善和提 高，以及现代新剂型的出现，增溶性辅料的地位愈显重要。但是增溶 性辅料本身及生产储存过程中存在环氧乙烷、二氧六环、2-氯乙醇、 二乙二醇等毒性物质残留，是其在应用中安全性问题频发的原因之 一，尤其是在注射剂中。现有的安全性评价方法主要通过红细胞悬浮 液溶血或凝集等常规药理实验，虽然结果较直观，但判断的主观性较 强，误差大，难以实现客观量化评价。
嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)是一种淡水中常见的单 细胞真核原生动物，不仅具有在绝大多数真核细胞中可见的典型的亚 细胞结构，而且与高等动物细胞具有很好的相似性。它无细胞壁，直 接通过细胞膜与环境接触，对环境变化能够迅速作出反应，显示出比 高等动物细胞更高的敏感性；而且其生长符合典型的微生物生长曲线 模型。据此可通过动态生长曲线来分析嗜热四膜虫对所处生长环境中 的毒物性质的反应情况。目前嗜热四膜虫已成为生物学和药理学研 究、环境安全的监测，以及水生态系统污染物安全毒理学评价的理想 材料，但其用于药用辅料、尤其是注射剂增溶性辅料的评价还未见报 道。
微量量热法具有快速、灵敏、重复性好等特点，能够连续动态地 追踪生物体在药物作用下的生长代谢情况，且该方法在密封独立的环 境中进行，不易受外界环境影响；在测定微生物、细胞、组织和器官 等生物体在生长代谢过程中的微量热变化(吸热或放热)规律方面广 泛应用。
技术原理：
嗜热四膜虫的生长、繁殖、衰亡过程中伴随着代谢，有热量释放， 释放的热量随生长期的变化关系，即产热功率-时间曲线，称为生物 热活性谱(又称“热谱曲线”或“生物效应谱”)。在不同药物物质的 作用下，该生物效应谱会发生规律性、特征性变化。
在既定的条件下嗜热四膜虫的生长与一般微生物生长曲线相似。 生长曲线分为四个期，即延滞期、指数生长期、稳定期和衰亡期。指 数生长期的嗜热四膜虫生长规律符合指数生长数学模型。
Pt＝P0exp(kt)或lnPt＝lnP0+kt (1)
式中，P0为指数生长起点的嗜热四膜虫产热功率，Pt为t时刻的嗜 热四膜虫产热功率，k为生长速率常数。同时还可提取最大产热功率 (Pmax1，Pmax2)、达峰时间(T1，T2)、产热量(Q)等热活性谱的特征参 数。
发明内容
本发明的目的是提供一种评价增溶性辅料生物安全性的方法。
本发明的方法以嗜热四膜虫为模型，结合微量量热法，通过考察 增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢的影响，评价增溶性辅料的生物安 全性。
所述方法包括以下步骤：
1)分别取增溶性辅料0.3-10.0mg，加入适量蒸馏水，配成一系 列不同浓度的增溶性辅料溶液，无菌条件下，用0.22μm滤膜滤过，4 ℃保存备用；
2)在25-37℃恒温条件下，在每个安瓿中，将嗜热四膜虫悬液 20-100μL接种到1-5mL无菌培养基中，接种后优选嗜热四膜虫混悬 液的浓度为1000-2500个细胞/mL，分别加入不同浓度的增溶性辅料溶 液60-240μL，置于微量量热仪中测定嗜热四膜虫生长代谢过程中的 产热功率，记录产热功率-时间曲线；
3)分析增溶性辅料的不同浓度与产热功率-时间曲线中特征参数 或其衍生参数的关系，得到增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢的促进 作用、抑制作用或毒性作用结果，初步评价增溶性辅料的生物安全性；
其中，所述特征参数包括生长速率常数、最大产热功率、达峰时 间和产热量，所述衍生参数包括抑制率和5％抑制浓度(IC5)。
上述方法还可以进一步包括如下步骤：
4)对步骤3)中所述的特征参数进行主成分分析，提取能够较全 面代表产热功率-时间曲线信息的特征参数；
5)通过每个主成分的得分系数与其贡献率，建立增溶性辅料的 综合评价函数，计算增溶性辅料的得分，综合评价增溶性辅料的生物 安全性。
其中，步骤1)中所述增溶性辅料优选注射剂增溶性辅料，更优 选吐温20、吐温80、聚乙二醇400、聚乙二醇600或泊洛沙姆188； 所述更优选的辅料是非离子表面活性剂的典型代表，在医药领域应用 较广泛，具有较好地增溶作用；另外，吐温80、泊洛沙姆188等辅 料目前已有应用，但由于其质量标准不完善，仍存在潜在的安全隐患， 因此有必要对其进行生物安全性评价；
所述增溶性辅料溶液的浓度范围为0.3-10.0mg/mL，优选系列浓 度0.3mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL，更 优选系列浓度0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0 mg/mL，更优选系列浓度1.0mg/mL、4.0mg/mL、6.0mg/mL、8.0 mg/mL、10.0mg/mL；
步骤2)中优选28℃恒温条件，接种后优选嗜热四膜虫混悬液的 浓度为1500个细胞/mL，优选加入增溶性辅料的体积为120μL。
本发明测定了不同增溶性辅料作用下嗜热四膜虫生长代谢的热 谱曲线，应用热谱曲线的各特征参数进行评价，考察各增溶性辅料的 生物安全性。
本发明采用微量量热法考察了不同增溶性辅料对嗜热四膜虫生 长代谢的影响，以生长速率常数(k)、最大产热功率(Pmax1、Pmax2)、 达峰时间(T1、T2)和产热量(Q)等生物热动力学特征参数为指标，对增 溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢的影响进行了客观的定量评价。建立 了以嗜热四膜虫为生物模型，采用微量量热法对增溶性辅料进行生物 安全性评价的方法。
本发明以增溶性辅料对嗜热四膜虫生长的全面的作用过程，通过 对具有整体性特征的热谱曲线进行信息分析，采用反映不同阶段的特 征参数，全面、客观量化地考察了增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢 的影响，评价了增溶性辅料的生物安全性。该方法操作简单，有利于 检测的规范化。
本发明的技术效果在于：
1)以嗜热四膜虫为模型，结合微量量热法，建立了新的增溶性 辅料生物安全性评价方法，对于注射剂增溶性辅料的生物安全性评价 具有重要意义。
2)该方法在密封独立的环境中进行，干扰小，能够真实动态全 面反映增溶性辅料与嗜热四膜虫的相互作用，客观评价增溶性辅料的 生物安全性。
3)所选的生物模型能够真实表征增溶性辅料的毒性效应，从而 为其安全性提供参考依据。
4)该方法对嗜热四膜虫混悬液的浓度、加入增溶性辅料的体积 以及生长温度等条件进行了优化，有利于准确测定。
5)评价的参数全面、客观并且能够量化，自动化操作简单，有 利于检测的规范化。
6)建立了增溶性辅料对嗜热四膜虫生长影响的综合评价方法。
附图说明
图1为正常条件下嗜热四膜虫生长代谢的产热功率-时间曲线。
图2为不同增溶性辅料作用下嗜热四膜虫生长代谢的产热功率- 时间曲线。
图3为不同增溶性辅料作用下嗜热四膜虫生长速率常数与浓度的 关系。
图4为各样品的综合评价得分图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
1.仪器：TAM III 12通道毫瓦级热导式等温量热仪(TA公司， 美国)，YXQ LS-B全自动立式电热蒸汽灭菌器(上海降拓仪器设备有 限公司)，303AB-3型隔水式培养箱(上海树立仪器仪表有限公司)。
2.材料与试剂：嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila BF5)由 武汉大学提供；培养基(取蛋白胨15g、酵母粉5g、葡萄糖1g，溶 于1000mL双蒸水中；取5份，每份10mL分装于试管中，121℃灭菌 20min，冷却备用)；吐温20(北京市东环联合化工厂，批号：960703)； 吐温80(江苏晨牌药业有限公司，批号：9080220)；聚乙二醇400(广 东汕头市西陇化工厂，批号：060908)；聚乙二醇600(天津市科密欧 化学试剂开发中心，批号：2041027)；泊洛沙姆188(上海协泰辅料 有限公司，批号：090309)；无菌蒸馏水。
3.嗜热四膜虫传代培养：取灭菌的培养基，接入200μL指数生长 期的嗜热四膜虫悬液，于28℃培养箱内静止培养4d后进入稳定期， 备用。
实施例1
1.供试品制备
取5种增溶性辅料，每种辅料分别取0.5mg、1.0mg、2.0mg、3.0 mg、4.0mg，精密称定，加入1mL蒸馏水溶解，配制成浓度分别0.5 mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL的各增溶性 辅料溶液。无菌条件下，用0.22μm滤膜滤过，4℃保存备用。
2.测定方法
采用安瓿法，在28℃恒温条件下，待仪器系统基线稳定后，在每 个安瓿中，将50μL生长稳定期的嗜热四膜虫悬液接种到2mL无菌培 养基中形成混悬液，使嗜热四膜虫悬液的浓度为1500个细胞/mL。加 入增溶性辅料溶液120μL，混合均匀，置于微量量热仪中测定嗜热四 膜虫生长代谢过程中的产热功率，记录产热功率-时间曲线。待曲线 回到基线后结束实验。
3.结果
3.1正常条件下嗜热四膜虫生长热功率曲线的测定
按照上述测定方法项，不加入增溶性辅料(即空白样品)，测定 了正常条件下嗜热四膜虫生长代谢的热谱曲线(见图1，其中A-B为 延滞期、B-C为指数生长期、C-D为稳定期、D-E为衰亡期)，其符合 微生物生长曲线模型。根据式(1)，将平行实验中获得的产热功率- 时间曲线上指数生长期的lnPt、t值进行线性拟合，得到嗜热四膜虫 (BF5)的生长速率常数k。拟合生长速率常数见表1，结果重现性良 好。
表1正常条件下嗜热四膜虫生长速率常数测定结果
实验组 1 2 3 4 5 6 生长速率常数k(h-1) 0.4335 0.4302 0.4347 0.4365 0.4352 0.4325 相关系数r 0.9853 0.9854 0.9918 0.9878 0.9913 0.9886
3.2不同增溶性辅料作用下嗜热四膜虫生长代谢热谱曲线的测定
按照上述测定方法项，分别测定了嗜热四膜虫在不同增溶性辅料 作用下的生长代谢热谱曲线，如图2所示。
参数测定结果见表2。通过分析可知，随着各增溶性辅料浓度的 增大，嗜热四膜虫的生长速率常数降低。其中在吐温80和泊洛沙姆188 的部分浓度下，其生长速率常数较正常条件下大，与浓度之间的线性 关系较好(P＜0.05)。嗜热四膜虫生长传代时间不断增加。第一最大 产热功率随增溶性辅料浓度的增加而减小，除吐温80的低浓度外，其 与正常条件下嗜热四膜虫的产热功率相比都较小；第二最大产热功率 亦随浓度的增加而减小，直至消失。说明增溶性辅料的存在对嗜热四 膜虫的生长代谢产生了抑制作用。
表2不同增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢影响的热谱曲线的 参数测定结果
注：C表示增溶性辅料浓度；k表示嗜热四膜虫生长速率常数；r表示k值拟合的相关系数； T1、T2表示达峰时间；Pmax1、Pmax2表示最大产热功率；I表示抑制率。
3.3抑制率和5％抑制浓度(IC5)的测定
根据表2中的参数测定结果可知，不同增溶性辅料对嗜热四膜虫 的生长抑制不同，故以生长速率为指标对抑制率(I)进行计算：
I＝[(k0-k)/k0]×100％ (2)
式中，k0为正常条件下嗜热四膜虫指数生长期的生长速率常数， k为增溶性辅料作用下嗜热四膜虫指数生长期的生长速率常数。通过 计算，IC5分别为：吐温20为0.0407mg/mL，吐温80为1.202mg/mL， 聚乙二醇400为0.668mg/mL，聚乙二醇600为1.358mg/mL，泊洛沙姆 188为2.402mg/mL。可知相同浓度下，吐温20对嗜热四膜虫指数生长 代谢阶段抑制较强，毒性较强。泊洛沙姆188、聚乙二醇600的抑制作 用较弱，对嗜热四膜虫指数生长代谢阶段抑制较小，毒性较弱。
3.4生长速率常数与增溶性辅料浓度关系
指数生长期的生长速率常数k随各增溶性辅料不同浓度的变化趋 势见图3。直线拟合方程如下(除原点)，相关系数检验P＜0.01，各增 溶性辅料的浓度与生长速率常数k具有较好的线性关系。
吐温20：k＝-0.0952c+0.3674 r＝-0.9711
吐温80：k＝-0.0542c+0.4709 r＝-0.9953
聚乙二醇400：k＝-0.0380c+0.4332 r＝-0.9801
聚乙二醇600：k＝-0.0302c+0.4663 r＝-0.9901
泊洛沙姆188：k＝-0.0216c+0.4678 r＝-0.9918
随着各增溶性辅料浓度的增加，嗜热四膜虫的生长速率常数都在 减小，表明浓度的增加会增大其对嗜热四膜虫的毒性作用。从增溶性 辅料浓度与生长速率常数关系曲线斜率的绝对值可知，其毒性作用 为：吐温20最大，吐温80和聚乙二醇400次之，聚乙二醇600和泊洛沙 姆188较小。这表明随着浓度的增加，吐温20对嗜热四膜虫指数生长 期毒性的增加较快，聚乙二醇600和泊洛沙姆188的增加较慢。
3.5热谱参数的主成分分析
由热谱曲线和特征参数可知，不同增溶性辅料对嗜热四膜虫生长 代谢的影响存在差异。以X1～X6为变量，分别代表参数生长速率常 数k、产热功率Q、达峰时间T1、第一最大产热功率Pmax1、达峰时间 T2、第二最大产热功率Pmax2，采用SPSS13.5进行主成分分析，提取 能够较全面代表热谱曲线信息的特征参数。
由主成分分析的特征参数的初始特征值(Initial Eigenvalues)、提 取负荷平方的求和值(Extraction Sums of Squared Loadings)和旋转 负荷平方和(Rotation Sums of Squared loadings)可知，前两个主成分 的特征值都大于1，累积贡献率(V)为82.751％，即前两个主成分代 表原有参数的82.751％的信息。见表3。
表3各样品的综合评价结果
样品 空白 吐温20 吐温80 聚乙二醇400 聚乙二醇600 泊洛沙姆188 贡献率(％) 第1主成分得分 -0.567 -1.699 0.877 -0.025 0.602 0.812 55.539 第2主成分得分 0.971 -0.477 -1.385 -0.220 -0.233 1.344 27.212 第3主成分得分 0.576 0.306 1.103 -1.572 -0.839 0.426 13.253 第4主成分得分 -0.380 0.482 -0.497 -1.275 1.658 0.012 3.084 第5主成分得分 -1.557 0.852 -0.119 0.136 -0.544 1.233 0.912 第6主成分得分 0 0 0 0 0 0 1*e-14 综合得分 -0.040 -101.016 24.008 -32.010 20.596 88.463 100
由成分负荷矩阵可知，提取了两个主成分，用F表示，其表达式为：
F1＝0.943X1+0.969X2-0.510X3+0.989X4-0.342X5-0.384X6
F2＝0.080X1-0.038X2-0.816X3+0.030X4+0.228X5+0.522X6
系数的绝对值越大，说明主成分与该参数的关系越密切。因此， 第一主成分与Q、k、Pmax1的关系密切，第二主成分与T1和Pmax2的 关系密切。两主成分代表了原有6个指标的82.751％的信息。
由成分得分系数矩阵可知，两个主成分的表达式如下：
Z1＝0.283X1+0.291X2-0.0153X3+0.297X4-0.103X5-0.115X6
Z2＝0.049X1-0.024X2-0.500X3+0.019X4+0.507X5+0.320X6
3.6增溶性辅料对嗜热四膜虫生长影响的综合评价
热谱曲线考察的是嗜热四膜虫生长代谢的整体信息，提取的参数 也是反映其生长代谢的综合参数。因此，建立一种科学综合的数学模 型评价方法。通过每个主成分的得分系数与其贡献率，建立各个样品 的综合评价函数，计算每个样品的得分：
S＝V1*Z1+V2*Z2+V3*Z3+...+Vn*Zn
式中，S表示样品综合得分；V表示各成分贡献率；Z表各成分的 得分。计算各样品的综合分数。结果见表3和图4。由图4可知，与空 白相比，泊洛沙姆188得分最高，吐温80和聚乙二醇600次之，吐温20 最低。提示我们泊洛沙姆188和吐温80对嗜热四膜虫的毒性较小，吐 温20的毒性最大。
4.结论
结果表明，泊洛沙姆188(0～2.0mg/mL)、聚乙二醇600(0～1.0 mg/mL)、吐温80(0～0.5mg/mL)作用下的生长速率常数较空白的 值大，对嗜热四膜虫的生长有促进作用。吐温20、聚乙二醇400对嗜 热四膜虫的生长有毒性作用，能抑制其生长。在5种增溶性辅料部分 低浓度的作用下，产热功率Pmax1、Pmax2较空白值高，在5种增溶性 辅料部分高浓度的作用下，产热功率Pmax1、Pmax2较空白值低；无 论高浓度还是低浓度，产热量Q都较正常值低。由IC5、主成分分析和 综合得分结果可知，相同浓度下，泊洛沙姆188、吐温80和聚乙二醇 600对嗜热四膜虫的毒性较其他小，三者的安全范围较大。综合分析 可知，不同增溶性辅料对嗜热四膜虫生长代谢影响不同。通过生长热 谱曲线的参数分析，能够较好评价各增溶性辅料的生物安全性。