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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410111298.3 (22)申请日 2014.03.24 C12N 15/113(2010.01) C12N 15/84(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A01H 5/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 安徽省农业科学院水稻研究所 地址 230031 安徽省合肥市农科南路 40 号 (72)发明人 魏鹏程 杨剑波 秦瑞英 李浩 张银萍 倪大虎 李莉 马卉 杨亚春 宋丰顺 陆徐忠 (74)专利代理机构 北京律谱知识产权代理事务。
2、 所 ( 普通合伙 ) 11457 代理人 黄云铎 CN 103468740 A,2013.12.25, 全文 . CN 103275983 A,2013.09.04, 全文 . CN 102586246 A,2012.07.18, 全文 . CN 101413006 A,2009.04.22, 全文 . WO 2004085641 A1,2004.10.07, 全文 . US 6441273 B1,2002.08.27, 全文 . Mundy,J. and Chua,N.H.Rice rab21 gene for water-stress inducible protein RAB21， G。
3、enBank: Y00842.1.Genbank .2006, (54) 发明名称 一种植物干旱诱导表达启动子 PosDro1 及其 应用 (57) 摘要 本发明提供一种植物干旱诱导表达启动子 PosDro1 及其应用。本发明的启动子能够驱动植 物或植物的特定基因对于干旱进行快速响应。本 发明还提供了含有该启动子的表达盒、 植物表达 载体、 宿主菌和转化子。具体而言， 本发明将上述 启动子应用在植物转基因工程中。本发明提供的 启动子可以启动外源基因在干旱诱导下在植物中 表达， 适用于任何植物， 尤其能够驱动外源基因在 水稻植株中表达， 因此可以用于提高和改善水稻 的生长特性， 尤其是抗旱特性，。
4、 从而培育出理想的 耐旱水稻品种。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 汪未申 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 103882021 B 2016.05.25 CN 103882021 B 1.一种植物干旱诱导表达启动子PosDro1， 其特征在于， 所述植物干旱诱导表达启动子 PosDro1由SEQIDNo:1所示的序列构成。 2.一种表达盒， 其特征在于， 所述表达盒包含权利要求1所述的植物干旱诱导表达启动 子PosDro1。 3.一种重组表达载体， 其特征在于， 所述重组表达载体包含权利要求1所述的植物干旱 。
5、诱导表达启动子PosDro1， 在所述重组表达载体中， 所述植物干旱诱导表达启动子PosDro1 连接于植物表达载体中待表达的基因序列的上游。 4.根据权利要求3所述的重组表达载体， 其特征在于， 所述待表达的基因为Gus基因， 所 述重组表达载体为pCAMBIA1391-PosDro1， 其中pCAMBIA1391为植物双元表达载体。 5.一种植物干旱诱导表达启动子PosDro1的应用， 其特征在于， 所述植物干旱诱导表达 启动子PosDro1用于构建宿主菌， 所述宿主菌包含权利要求1所述的植物干旱诱导表达启动 子PosDro1， 所述宿主菌为根癌农杆菌。 6.一种植物干旱诱导表达启动子Po。
6、sDro1的应用， 其特征在于， 所述植物干旱诱导表达 启动子PosDro1用于构建转化子， 所述转化子包含权利要求1所述的植物干旱诱导表达启动 子PosDro1。 7.一种根据权利要求1所述的植物干旱诱导表达启动子PosDro1在培育转基因植物中 的应用， 其特征在于， 所述应用包括： 将根据权利要求1所述的植物干旱诱导表达启动子 PosDro1连接于植物表达载体中待表达的基因序列上游， 从而构建重组表达载体； 将所述重 组表达载体转化到植物细胞、 组织或器官中进行培育。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103882021 B 2 一种植物干旱诱导表达启动子PosDro1及其应用 技术领域。
7、 0001 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。 具体而言， 本发明涉及一种植物 干旱诱导表达启动子及其应用， 该启动子能够在水稻转基因调控体系中在干旱条件诱导下 驱动目标基因在植株中表达。 背景技术 0002 干旱等非生物逆境一直是限制作物生长和产量的重要因素， 并且随着全球环境恶 化、 气候异常等变化将日益危害着我国的粮食生产安全。 水稻是重要的粮食作物， 其生产规 模与发展在粮食生产中占有举足轻重的位置。 水稻又是耗水第一大户， 在水资源日益缺乏、 旱灾频发的今天， 降低水稻的用水量， 提高水资源的有效利用已成为育种家们关注的主要 课题。 0003 准确鉴定水稻育种材料的耐旱性， 。
8、培育水稻耐旱品种是节约水资源和提高水资源 利用的一个重要途径。 近年来， 随着分子生物学的不断发展， 转基因已经成为研究功能基因 组学的有效手段， 并且通过转基因途径改良植物抗逆性正逐步得到可行性论证和普遍接 受。 已经有大量文献报道， 通过在植物中过量或超量表达逆境相关基因能够在一定程度上 提高植物的抗逆性。 但是这些报道中的超量表达的启动子通常都是组成型启动子， 而这些 启动子驱动的目的基因在植物的各组织器官中均有广泛的表达， 难免造成转基因植物的物 质和能量浪费以及凸显食品安全性问题。 0004 特异性启动子由于其表达的时间和空间特异性而具有许多组成型启动子所不具 备的特点， 即外源基因。
9、在转基因植物中定时、 定位表达不但可以降低植物负担、 减轻对农作 物农艺性状的影响， 还可以提高外源基因在特定时空的浓度， 增加转基因的效果。 0005 尽管已有文献报道从植物中分离了一些与抗逆有关的诱导特异性表达启动子， 如 SalT启动子和RD29A启动子等， 但在重要农作物水稻中尚未分离到受干旱强烈诱导表达的 启动子用于植物抗逆遗传工程。 因此， 挖掘一些特异性表达特别是受干旱诱导的启动子在 改良作物抗旱育种上具有十分重要的意义。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种驱动外源基因在干旱诱导条件下表达的启动子、 获得含 有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。 其中， 本文中所涉及。
10、的 “植物” 是指单子叶 植物， 例如水稻、 小麦、 玉米、 大麦、 高粱或燕麦， 优选为水稻。 0007 为了实现上述目的， 一方面， 本发明提供一种植物干旱诱导表达启动子， 所述植物 干旱诱导表达启动子包含序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列。 序列表中SEQIDNo:1所 示的DNA序列为来源于日本晴水稻 （OryzasativaLcv.Nipponbare） 的水稻干旱诱导表达 启动子， 本文中称为PosDro1或启动子PosDro1。 0008 优选地， 本发明提供的植物干旱诱导表达启动子PosDro1的DNA序列为SEQIDNo: 1所示的序列， 即PosDro1或启动子Po。
11、sDro1。 说明书 1/6 页 3 CN 103882021 B 3 0009 另一方面， 本发明提供一种植物干旱诱导表达启动子PosDro1， 其DNA序列与SEQ IDNo:1所示的DNA序列有至少80%同源性； 或者， 所述植物干旱诱导表达启动子PosDro1为 在SEQIDNo:1所示的DNA序列中添加、 取代、 插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突 变体或等位基因或衍生物； 或者所述植物干旱诱导表达启动子PosDro1具有与SEQIDNo:1 所示的DNA序列杂交的产物。 并且这些植物干旱诱导表达启动子序列与SEQIDNo:1所示的 DNA序列具有相同功能， 即驱动外源基因在干旱。
12、诱导条件下表达。 0010 另一方面， 本发明还提供一种包含上述植物干旱诱导表达启动子PosDro1的表达 盒。 0011 又一方面， 本发明还提供一种重组表达载体， 所述重组表达载体包含上述的植物 干旱诱导表达启动子PosDro1， 在所述重组表达载体中， 所述植物干旱诱导表达启动子 PosDro1连接于待表达的基因序列的上游。 在一种实现方式中， 所述待表达的基因为Gus基 因， 所述重组表达载体为pCAMBIA1391-PosDro1， 该重组表达载体为将SEQIDNo:1所示的 序列即PosDro1或启动子PosDro1构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体， 本文中称为 p。
13、CAMBIA1391-PosDro1。 在实际应用中， 本发明中所采用的待表达基因， 可以根据需要具体 选择， 优选为耐旱基因。 0012 另一方面， 本发明还提供一种宿主菌， 所述宿主菌包含本发明提供的上述植物干 旱诱导表达启动子PosDro1、 上述表达盒、 或上述重组表达载体； 优选地， 所述宿主菌为根癌 农杆菌。 0013 另一方面， 本发明提供一种转化子， 所述转化子包含本发明提供的上述植物干旱 诱导表达启动子PosDro1、 上述表达盒、 上述重组表达载体。 其中， 所述转化子优选为转基因 细胞系、 愈伤组织或植株。 0014 再一方面， 本发明提供上述植物干旱诱导表达启动子Pos。
14、Dro1在培育转基因植物 中的应用。 所述应用包括将本发明提供的上述植物干旱诱导表达启动子PosDro1连接于载 体的待表达的基因序列上游 （例如， 将所述启动子序列置于目标基因之前） ， 从而构建重组 表达载体， 将所述重组表达载体转化到植物细胞、 组织或器官中进行培育。 0015 并且优选地， 所述应用可以用于改良植物生长特性， 所述植物为单子叶植物， 例如 水稻、 小麦、 玉米、 大麦、 高粱或燕麦， 优选为水稻。 0016 本发明中所提供的启动子的DNA序列为 （与序列表中SEQIDNo： 1中相同） ： 0017 gttggattgagccagacggggatcgagtcagtcgg。
15、tggtcatggaggaatgcacgccgca60 0018 ttacttggcacgtggtggggttcacgtgagccacacactgagtgcacccacaagggctga120 0019 ctgcactgtagagaggatgacccttgtcaccaccgtcatgtacgaggctgctccaccact180 0020 gcctcactcgccaccagcgtctcccgccgcgtgcaatacaagaagaaacatcgaacggtc240 0021 atataaggtaagacccactaccgatttaacctatccttcccacaatctaatccactcatt。
16、300 0022 tctcctcccacgatcttattctctcatttctcctcactatttttgcatttgtaggaaaca360 0023 caatgacaccgtcgaagaaagctggtggagcaccgtagccagcaatcaccaaaacacaga420 0024 ggggaggaggtcggcagcggccatgcggacggcgacgagacaacgtgacgcaaagaggga480 0025 ggaggacgttggcgatcatgctggtgttggcggaggaggtcactggccacgcggatgaca540 0026 gcggggcagcgcaac。
17、acaaaaaggggggaggatgccggcgaccacgctagtgaccatgaa600 0027 gcaagatgatgtgaaagggaggaccggacgagggttggacctctgctgccgacatgaaga660 说明书 2/6 页 4 CN 103882021 B 4 0028 gcgtgatgtgtagaaggagatgttagaccagatgccgacgcaactagccctggcaaggtc720 0029 acccgactgatatcgctgcttgcccttgtcctcatgtacacaatcagcttgcttatctct780 0030 cccatactgg。
18、tcgtttgtttcccgtggccgaaatagaagaagacagaggtaggttttgtt840 0031 agagaattttagtggtattgtagcctatttgtaattttgttgtactttattgtattaatc900 0032 aataaaggtgtttcattctattttgactcaatgttgaatccattgatctcttggtgttgc960 0033 actcagtatgttagaatattacattccgttgaaacaatcttggttaagggttggaacatt1020 0034 tttatctgttcgtgaaacatccgtaatattttc。
19、gttgaaacaatttttatcgacagcacc1080 0035 gtccaacaatttacaccaatttggacgtgtgatacatagcagtccccaagtgaaactgac1140 0036 caccagttgaaaggtatacaaagtgaacttattcatctaaaagaccgcagagatgggccg1200 0037 tgggccgtggcctgcgaaacgcagcgttcaggcccatgagcatttattttttaaaaaaat1260 0038 atttcacaacaaaaaagagaacggataaaatccatcgaaaaaaaaaactttcc。
20、tacgcat1320 0039 cctctcctatctccatccacggcgagcactcatccaaaccgtccatccacgcgcacagta1380 0040 cacacacatagttatcgtctctccccccgatgagtcaccacccgtgtcttcgagaaacgc1440 0041 ctcgcccgacaccgtacgtggcgccaccgccgcgcctgccgcctggacacgtccggctcc1500 0042 tctccacgccgcgctggccaccgtccaccggctcccgcacacgtctccctgtctccctcc1560 0043 acc。
21、catgccgtggcaatcgagctcatctcctcgcctcctccggcttataaatggcggcca1620 0044 ccaccttcacctgcttgcacaccacagcaagagctaagtgagctagccactgatcagaag1680 0045 aacacctcgatctccgagagttttttttcagctttagcttaagcagg 1727 0046 需要说明的是： 上述启动子的DNA序列中， 序列开头以斜体并加粗表示的序列 “gttggattgagccagacgggga” 为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列， 共计 22bp； 序列末尾以斜体并加粗。
22、表示的序列 “tttcagctttagcttaagcagg” 为获得启动子过程 中使用的反向引物的留存序列 （该留存序列与反向引物的相应序列互补） ， 共计22bp； 该DNA 序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。 需要强调的是， 本文中所提到的启动 子既可以指上述整个DNA序列， 也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。 0047 综上所述， 本发明的发明人从日本晴水稻 （OryzasativaLcv.Nipponbare） 中分 离克隆得到结构包括转录起始位点在内的1727bp的DNA序列， 并将其命名为PosDro1 （序列 表中的SEQIDNo:1） 。 将该序列经酶。
23、切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上， 获得 相应的重组质粒 （即重组表达载体） ， 利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105， 然后用 农杆菌介导的方法进行水稻的转化， 得到转基因水稻植株。 对获得的转基因水稻进行组织 化学检测发现， 转基因植株在干旱诱导处理后， 整体上的Gus基因表达水平相对较高并显蓝 色， 从而证明该1727bp的序列具有驱动基因表达的活性， 而且该启动子驱动的Gus基因在水 稻干旱诱导处理后表达。 0048 本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接， 用于取代组成型启动子。 并且， 该启动子序列可以与所需的靶标基因链接， 构建重组植物表达载体，。
24、 经转化后， 再经 干旱诱导处理后可驱动靶标基因在植株中特异性表达， 从而提高外源靶标基因在植物中的 表达量， 增加转基因的效果。 0049 技术效果 0050 本发明所克隆的水稻启动子PosDro1能够在干旱条件诱导下调控基因在植株中集 中表达， 在实际应用中具有显著价值。 通过该启动子对农作物品种进行基因改造， 如通过该 说明书 3/6 页 5 CN 103882021 B 5 启动子调控目标基因在植株中表达， 可以提高和改善水稻的生长特性和抗旱能力， 代替35S 等组成型启动子， 从而培育出理想的生物安全性高的耐旱转基因植物品种 （只需将本发明 实施例中所采用的待表达基因换成耐旱基因即可。
25、） 。 附图说明 0051 以下， 结合附图来详细说明本发明的实施方案， 其中： 0052 图1为将PosDro1启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图， 其中图1中A为 pCAMBIA1391示意图， 图1中B为pCAMBIA1391-PosDro1示意图， 其中示出了利用PosDro1启动 子驱动位于其下游的GUS基因表达； 0053 图2为萌发21天后的PosDro1:GUS转基因植株组织染色结果图。 其中， A为未处理 茎组织染色24小时后的结果， 仅在个别位置出现微弱GUS染色； B为未处理叶片组织染色24 小时后的结果， 仅在叶片边缘个别位置出现微弱GUS染色； C为。
26、离体茎组织， 在干燥空气中干 旱3小时进行染色的结果， 染色仅30分钟后， 出现强烈GUS染色； D为离体叶片， 在干燥空气中 干旱3小时进行染色的结果， 染色仅30分钟后， 出现强烈GUS染色 （标尺=10mm） 。 0054 图3为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。 具体实施方式 0055 以下参照具体的实施例来说明本发明。 本领域技术人员能够理解， 这些实施例仅 用于说明本发明， 其不以任何方式限制本发明的范围。 0056 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的药 材原料、 试剂材料等， 如无特殊说明， 均为市售购买产品。 0057 含有酶切。
27、位点的PosDro1启动子的获得 0058 步骤1、 引物的设计 0059 根据NCBI中提供的水稻品种日本晴 （OryzasativaLcv.Nipponbare） 全基因组 序列， 依据水稻PosDro1基因的序列设计扩增引物， 并根据选用的载体及靶标基因的特点， 设计引物的酶切位点。 本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391 （该载体在图1中A部分 示出， 来自于CAMBIA， 为公开使用载体， 在安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监 督检验测试中心水稻组保存） 为例， 靶标基因为Gus基因， 具体设计的引物为： 正向引物 （SEQ IDNo:2） 5 端带HindIII。
28、， 酶切位点 （AAGCTT） ， 反向引物 （SEQIDNo:3） 5 端带EcoRI， 酶切 位点 （GAATTC） ， 引物序列如下： 0060 正向引物： AAGCTTGTTGGATTGAGCCAGACGGGGAHindIII 0061 反向引物： GAATTCCCTGCTTAAGCTAAAGCTGAAAEcoRI 0062 由深圳华大基因公司合成。 0063 步骤2、 启动子PosDro1的获得 0064 以水稻品种日本晴DNA为模板， 利用正向引物、 反向引物扩增启动子PosDro1， 按常 规PCR体系， 采用如下扩增程序： 0065 95预变性5min； 95变性30s， 58。
29、退火30s， 72延伸2min30s， 执行35个从95 预变性到72延伸的循环； 最后72延伸10min。 0066 回收PCR扩增的目的片段， 目的片段长度1727bp， 将其连接到PGEM-T-Easy载体 （购 说明书 4/6 页 6 CN 103882021 B 6 自Promega公司， 按载体说明书中的比例混合） 上， 按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态 细胞后， 使感受态细胞激活， 进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中， 然后， 经菌落PCR 筛选获得阳性克隆， 挑取单克隆摇菌液提质粒， 用HindIII和EcoRI进行双酶切验证， 如图3 所示。 将经过鉴定的阳性克。
30、隆送交Invitrogen公司测序。 验证正确的克隆即为所要获得的 启动子PosDro1， 其核酸序列如SEQIDNo:1所示。 0067 植物表达载体的构建和农杆菌的转化 0068 从上面 “启动子PosDro1的获得” 过程中获得的阳性克隆中提取质粒， 用HindIII和 EcoRI双酶切， 回收启动子PosDro1片段。 同时利用HindIII和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性 化处理、 回收pCAMBIA1391， 将上述的PosDro1片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶 （购于 TaKaRa公司） 进行连接， 得到启动子PosDro1与Gus基因融合的植物表达载体。
31、pCAMBIA1391- PosDro1 （图1B） ， 利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens） EHA105 （安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水 稻组保存） ， 从冻融法所得产物中提取阳性质粒， 用HindIII和EcoRI进行酶切验证， 验证结 果如图3中所示。 0069 利用启动子PosDro1驱动Gus报告基因在水稻中表达 0070 步骤1： 农杆菌介导的水稻遗传转化 0071 将成熟水稻种子去掉颖壳后， 用70%酒精浸泡种子1min， 倒掉酒精。 用含有1滴 Tween20的50%次氯酸钠 （原液有效氯。
32、浓度大于4%） 溶液浸泡种子40min （150r/min） 。 倒掉次 氯酸钠， 无菌水洗5遍至溶液澄清， 无次氯酸钠味道。 无菌水浸泡种子过夜。 用解剖刀对种子 沿糊粉层将胚剥下， 将胚接种于愈伤诱导培养基上。 30下暗培养11天后将愈伤与胚乳及 胚芽分离， 将去芽的状态良好、 分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养35天后用于农杆菌 转化。 0072 采用上述 “植物表达载体的构建和农杆菌的转化” 过程中转入了重组表达载体的 根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化， 该遗传转化、 转化子筛选及转基因植株再生等参 照YongboDuan （YongboDuan， ChenguangZhai， eta。
33、l.Anefficientandhigh- throughputprotocolforAgrobacteriummediatedtransformationbasedon phosphomannoseisomerasepositiveselectioninJaponicarice(OryzasativaL.) J.PlantCellReport， 2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.） 等提出的方法。 0073 共获得32株pCAMBIA1391-PosDro1植株 （PosDro1： ： gus转基因水稻植株） 。 0074 步骤2、 干旱处理和GUS组织化学。
34、染色 0075 取所得植株的离体茎组织， 在干燥空气中干旱3小时后进行GUS染色， 染色方法参 照Jefferson(JeffersonRA等人.GUSfusion： -Glucuronidaseasasensitiveand versatilegenefusionmarkerinhigherplantJ.EMBOJ.， 1987， 6:3901-3907)等提 出的方法， 将需要染色的组织抽真空， 然后浸入染色液中， 37染色24小时。 脱色时在37 条件下用95%乙醇处理， 至阴性对照材料呈白色。 0076 对萌发21天后的PosDro1:GUS转基因植株组织染色后所得结果如图2所示。 具。
35、体 而言， 在图2的A中可以看出未处理的茎组织染色24小时后， 仅在个别位置出现微弱GUS染 色； 从B中可以看出： 未处理的叶片组织染色24小时后仅在叶片边缘个别位置出现微弱GUS 染色； 从C中可以看出： 对于离体茎组织在干燥空气中干旱3小时之后， 对其染色仅30分钟就 说明书 5/6 页 7 CN 103882021 B 7 出现强烈GUS染色； 从D中可以看出： 对于离体叶片在干燥空气中干旱3小时之后， 对其染色 仅30分钟就出现强烈GUS染色。 0077 因此， 从实验结果可以看出本发明的植物干旱诱导表达启动子PosDro1能够在干 旱条件的诱导下驱动Gus基因特异性表达。 0078 以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明， 本领域技术人员可以根据本 发明作出各种改变或变形， 只要不脱离本发明的精神， 均应属于本发明所附权利要求的范 围。 说明书 6/6 页 8 CN 103882021 B 8 图1 说明书附图 1/3 页 9 CN 103882021 B 9 图2 说明书附图 2/3 页 10 CN 103882021 B 10 图3 说明书附图 3/3 页 11 CN 103882021 B 11 。