技术领域
本发明涉及一种利用生物反应器促进雨生红球藻藻细胞分裂增殖提高藻的数量，获 取纯藻种的方法。
背景技术
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种单细胞绿藻，细胞呈椭圆形或卵形， 大小从5微米左右到20-30微米不等，有时甚至更大些。有两条等长鞭毛，鞭毛的摆动 推动细胞自由游动；细胞壁和原生质间具空隙，其间充满胶状物质，细胞壁和原生质体 间有细胞质连丝相连，营养繁殖为细胞分裂，形成2、4、8、16甚至更多个子细胞，无 性生殖在环境不良时形成胶群体或厚壁孢子。处于生长旺盛阶段的雨生红球藻细胞为绿 色，而处于不利条件时细胞分裂减慢并大量累积虾青素而呈现砖红色，故取名红球藻。 影响雨生红球藻的生理、生物量、产量和次生代谢产物成分和生成量，主要涉及藻的品 种和良好的培养条件(如环境的净化程度、温度、光照、溶解氧、营养液组成、流体切 变力等)。通过物理或化学以至基因工程及遗传工程手段改造现有藻种获得优良工程菌 株，提高藻种的光饱和值、抗光抑制，以及抗逆、抗污染能力，可以获得耐高温、细胞 增殖快和虾青素积累能力强的藻种。
目前，阻碍雨生红球藻大规模生产的主要因素是生物污染和雨生红球藻培养过程种 群密度低使单位面积产量低所导致的高成本。小规模由管道式光生物反应器或小型固定 化系统组成的生物反应器或气升式生物反应器进行培养的雨生红球藻，存在的缺陷是管 道壁易被藻细胞粘连遮蔽导致培养期间透光性下降及清洗困难，虽然已采用不同类型的 桨叶轮搅拌混合，以尽量降低藻细胞之间的遮蔽作用及提高光照的利用，但只适应实验 室的小规模试验。
发明内容
本发明的目的是提供一种可调控的全天候封闭式大规模运行系统光生物反应器促 进雨生红球藻生长，并加速细胞分裂增殖提高藻的数量、缩短扩种时间，获取纯藻种的 方法。
本发明的方法包括建立可调控的全天候封闭式大规模运行系统光生物反应器，在主 体反应器底部及四周和封盖采用透光材料及外置可调控的光照设施、调速桨叶轮搅拌器 及卷水轮、无菌空气鼓气设施及O2气体系统，咸淡水营养液调配和温度调控系统，清 洗和消毒杀菌系统等人工可控的环境条件，加速雨生红球藻细胞生长增殖，有效缩短扩 种时间，获取纯藻种。
本发明的方法具体步骤如下：
一、建立全天候封闭式大规模运行系统光生物反应器：改造并优化通常工业培养微 藻使用的浅水道光生物反应器成为封闭式光生物反应器，或设计光利用率高的全天候封 闭式大规模运行系统光生物反应器，其中包括支撑式主体底座，设置封闭式可调控排放 系统的主体反应器(水槽)，设置可调控的光照设施，设置调速桨叶轮搅拌器及卷水轮、 设置有进排气口的无菌空气设施及O2气体系统，设置有回流装置的咸淡水营养液调配 和温度调控系统，清洗和消毒杀菌系统等设施。主体反应器呈长方形，长宽为200- 1500cm×100-300cm，通常为220-500cm×110-150cm；深度为450-700cm，通常 为550-650cm。亦可将全天候封闭式大规模运行系统光生物反应器包括咸淡水营养液 调配、控光、控温、清洗、消毒、杀菌、搅拌、鼓气等由计算机控制实现长期半连续生 产。
二、在主体反应器底部及四周和封盖采用透光材料及外置可调控光照设施：透光材 料可选用高抗张力及抗压力的无色透明钢化玻璃，厚度为0.8-3cm，通常为1.5-2cm， 封盖部分透光材料可选用市售透明塑料薄膜或复合材料透明薄膜，厚度为0.01-0.6mm， 通常为0.03-0.3mm；透明薄膜用作主体反应器封盖并用胶带纸封贴或胶粘剂封贴，封盖 部分透光材料也可选用有机玻璃等透光材料；在主体反应器四周及上下安装多盏可调亮 度的照明用的日光灯、白炽灯、太阳灯或节能射灯，每盏灯功率为40-2000w，通常为 40-300w；可单独使用或组合使用；可调控光照强度为70-280μmol.m-2.s-1，通常为85 -140μmol.m-2.s-1。光照强度和光照周期可根据自然日光光照强度及通过灯的数量和功率 及光照时间进行调控。
三、调速桨叶轮搅拌器及卷水轮：调速浆叶轮搅拌器可使主体反应器咸淡水营养液 处于轻微流动状态并保持咸淡水营养液组成及溶解氧浓度和PH值的可调控性，使藻细 胞的生长处于悬浮状态；雨生红球藻在合适的流体切变力作用下，如咸淡水营养液以 0.01-0.08m/s的低速率循环，可有效减少藻细胞之间的遮蔽作用及提高光照的利用。 采用工业上使用的可调速桨叶轮搅拌器，转速为10-400r/m，通常为20-60r/m；卷水 轮为工业上使用的卷水轮，转速为10-300r/m，通常为20-80r/m；卷水轮装置于主体 反应器的一侧，调控咸淡水营养液循环流动的速率。
四、设置有进排气口的无菌空气设施及O2气体系统：在培养过程鼓入无菌空气有 助于促进雨生红球藻细胞分裂增殖和提高藻的数量。采用工业上使用的空压机并经常规 的滤油滤水滤菌处理成为无菌空气；O2气体采用工业氧气瓶，并采用过滤法除菌。通过 调节阀及分布于主体反应器底部管道式微孔导流孔鼓入无菌空气及氧气。无菌空气鼓入 量为0.02-2m3/m，通常为0.03-0.2m3/m；O2气体按咸淡水营养液所需溶解氧的浓度 进行调节。
五、设置有回流装置的咸淡水营养液调配和温度调控系统：咸淡水营养液调配及温 度调控系统由配置冷水循环制冷装置、加热装置、营养液循环泵、回流管道、测温控温 设施及带搅拌器的工业上使用的夹层贮液罐组成。每组贮液罐为2至3只，通常为2只， 贮液罐容量为100-10000L，通常为1000-6000L；搅拌器转速为20-300r/m，通常为 60-80r/m。
咸淡水营养液组成：咸淡水配比为清水30-70％，通常为45-65％；海水25-75％， 通常为35-55％；亦可采用人工调配海水；营养液配比为硝酸钾0.1-0.4g/L，通常为 0.2-0.28g/L；醋酸钠0.3-0.6g/L，通常为0.45-0.53g/L；亦可以加入尿素、硫酸镁、 磷酸二氢钾等营养盐，可以是一种或一种以上，加入量为0.01-1g/L。
处于细胞生长增殖阶段的雨生红球藻对咸淡水营养液溶解氧浓度需求为40-55％ 饱和度；雨生红球藻最适生长的pH值为中性至微碱性；藻细胞生长增殖温度为14-27 ℃，通常为20-24℃；藻细胞迅速生长及分裂增殖处于对数生长期的培养周期为48- 96h，通常为60-72h。
六、清洗和消毒杀菌系统：投入生产之前应将光生物反应器彻底清洗消毒，每次清 洗时均应清除封盖部分的透明薄膜并更换新的透明薄膜，咸淡水营养液调配过程应保持 洁净无污染，咸淡水中清水及海水可采用工业上使用的电解水臭氧发生器进行杀菌，营 养液可采用加热法杀菌，加热温度为70-80℃，时间15-25分钟，或95-100℃，时 间5-15分钟；亦可采用化学杀菌法进行杀菌。循环使用的咸淡水营养液可采用加热法 杀菌后再投入使用。
封闭式大规模运行系统中光生物反应器的设计对于提供可调控的环境条件促进雨 生红球藻迅速生长增殖及提高种群密度至关重要。培养雨生红球藻纯藻种由于非生物因 素的变量太多，如生物污染、光照强度、溶解氧、温度和营养液组成等多种因子的控制 而变得非常复杂。光照是雨生红球藻生长的重要因素。最适于雨生红球藻生长增殖的光 照度为中等强度光照85-140μmol.m-2.s-1；大于306.25μmol.m-2.s-1的光照强度将抑制雨生 红球藻的生长，分裂的细胞也由营养生长转为休眠状态。培养过程光照不足及藻细胞相 互之间的遮蔽作用，将导致藻细胞生长受到抑制而增加了其他生物污染的机会。在室外 人工培养微藻采用的桨叶轮搅拌的浅水道光生物反应器，构造上只接受正面光的光照， 对光线的充分利用及光照的调控受到局限，特别是昼夜和阴晴天光照强度差别的影响成 为大规模培养雨生红球藻纯藻种关键性技术难题。通过改造并优化浅水道光生物反应器 系统成为封闭式光生物反应器，在主体反应器的底部及四周和封盖采用透光材料提高光 生物反应器内整体光照强度，改善整体的培养条件为可调控的高净化度的环境条件，利 用日光光照并外置可调控的人工光源照射使藻细胞昼夜能均匀地接受到中等强度光照， 对光能利用率较高，在良好的培养条件下，既可全天候昼夜投入使用，又能促进雨生红 球藻迅速生长，加速雨生红球藻细胞分裂增殖提高藻的数量、缩短扩种时间，并易于克 服开放式大规模运行系统光生物反应器运转期间昼夜和阴晴天的影响及其他杂藻和生 物沾污以及大气污染。由于主体反应器封盖部分透光材料更换方便，使主体反应器整体 清洗更加便利快捷。因此，建立可调控的全天候封闭式大规模运行系统光生物反应器比 浅水道光生物反应器培养雨生红球藻纯藻种更具优越性。
具体实施方式
实施例一：
建立全天候封闭式大规模运行系统光生物反应器，主体反应器(水槽)长宽深为500 ×150×65cm，底部及四周采用2cm厚的无色透明钢化玻璃，封盖部分采用厚度为0.1mm 的透明薄膜并用胶带纸封牢，主体反应器四周及上下安装可调亮度的功率为100W太阳 灯26盏，40W节能射灯18盏；反应器内调速浆叶轮搅拌器转速为30r/m；卷水轮转速 为50r/m，咸淡水营养液以0.04m/s的低速率循环；咸淡水营养液调配及温度调控系统 配备3只容量4000L的贮液罐，搅拌器转速为80r/m。咸淡水营养液组成：清水65％， 海水35％，硝酸钾0.21g/L，醋酸钠0.52g/L，硫酸镁0.04g/L，磷酸二氢钾0.04g/L， 尿素0.1g/L；清水及海水可经臭氧发生器杀菌；营养液采用经100℃加热杀菌5分钟； 藻细胞生长温度为20℃；光照强度为113.75-148.75μmol.m-2.s-1；无菌空气鼓入量为 0.3m3/m；咸淡水营养液溶解氧浓度为40％饱和度；藻细胞生长的pH值为6.8，藻细胞迅 速生长增殖培养周期为60h，藻细胞分裂增殖处于对数生长期，藻细胞呈绿色。经检测， 所获取的雨生红球藻藻种无污染，藻种生命力旺盛。
实施例二：
建立全天候封闭式大规模运行系统光生物反应器，主体反应器(水槽)长宽深为220 ×110×55cm，底部及四周采用1.5cm厚的无色透明钢化玻璃，封盖部分采用厚度为 0.06mm的透明薄膜并用胶带纸封牢，主体反应器四周及上下安装可调亮度的功率为40W 日光灯20盏；反应器内调速浆叶轮搅拌器转速为20r/m；卷水轮转速为30r/m，咸淡水 营养液以0.02m/s的低速率循环；咸淡水营养液调配及温度调控系统配备3只容量800L 的贮液罐，搅拌器转速为60r/m。咸淡水营养液组成：清水40％，海水60％，硝酸钾0.2g/L， 醋酸钠0.6g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，硫酸镁0.2g/L，尿素1g/L；清水及海水可经臭 氧发生器杀菌；营养液采用经95℃加热杀菌10分钟；藻细胞生长温度为24℃；光照强 度为96.25-131.25μmol.m-2.s-1；无菌空气鼓入量为0.3m3/m；咸淡水营养液溶解氧浓度为 53％饱和度；藻细胞生长的pH值为中性，藻细胞迅速生长增殖培养周期为48h，藻细胞 呈绿色。经检测，所获取的雨生红球藻藻种无污染，藻种生命力旺盛。回收咸淡水营养 液经加热法杀菌后可循环使用于藻种培养。
实施例三：
建立全天候封闭式大规模运行系统光生物反应器，主体反应器(水槽)长宽深为200 ×100×65cm，底部及四周采用1cm厚的无色透明钢化玻璃，封盖部分采用厚度为0.2mm 的透明薄膜并用胶粘剂封贴，主体反应器四周及上下安装可调亮度的功率为40W日光灯 7盏，100W太阳灯5盏；反应器内调速浆叶轮搅拌器转速为10r/m；卷水轮转速为10r/m， 咸淡水营养液以0.03m/s的低速率循环；咸淡水营养液调配及温度调控系统配备2只容 量800L的贮液罐，搅拌器转速为20r/m。咸淡水营养液组成：清水25％，海水75％，硝 酸钾0.4g/L，醋酸钠0.4g/L，尿素0.3g/L，硫酸镁0.04g/L；清水及海水可经臭氧发 生器杀菌；营养液采用经98℃加热杀菌8分钟；藻细胞生长温度为27℃；光照强度为 70-140μmol.m-2.s-1；无菌空气鼓入量为0.05m3/m；咸淡水营养液溶解氧浓度为51％饱和 度；藻细胞生长的pH值为6.6，藻细胞迅速生长增殖培养周期为60h，藻细胞分裂增殖 处于对数生长期，藻细胞呈绿色。经检测，所获取的雨生红球藻藻种无污染，藻种生命 力旺盛。
实施例四：
建立全天候封闭式大规模运行系统光生物反应器，主体反应器(水槽)长宽深为500 ×150×65cm，底部及四周采用2cm厚的无色透明钢化玻璃，封盖部分采用厚度为0.09mm 的复合材料透明薄膜并用胶带纸封牢，主体反应器四周及上下安装可调亮度的功率为 100W太阳灯30盏；反应器内调速浆叶轮搅拌器转速为30r/m；卷水轮转速为50r/m，咸 淡水营养液以0.04m/s的低速率循环；咸淡水营养液调配及温度调控系统配备3只容量 4000L的贮液罐，搅拌器转速为80r/m。咸淡水营养液组成：清水65％，海水35％，硝酸 钾0.21g/L，醋酸钠0.5g/L，尿素0.4g/L，磷酸二氢钾0.01g/L；清水及海水可经臭氧 发生器杀菌；营养液采用经70℃加热杀菌25分钟；藻细胞生长温度为24℃；光照强度 为96.25-157.5μmol.m-2.s-1；无菌空气鼓入量为0.3m3/m；咸淡水营养液溶解氧浓度为55％ 饱和度；藻细胞生长的pH值为6.9，藻细胞迅速生长增殖培养周期为96h，藻细胞分裂 增殖处于对数生长期，藻细胞呈绿色。以上光生物反应器配置的营养液调配、控光、控 温、清洗、消毒、杀菌、搅拌、鼓气等装置由计算机控制实现半连续生产。经检测，所 获取的雨生红球藻藻种无污染，藻种生命力旺盛。
实施例五：
建立全天候封闭式大规模运行系统光生物反应器，主体反应器(水槽)长宽深为1500 ×300×70cm，底部及四周采用3cm厚的无色透明钢化玻璃，封盖部分采用厚度为0.4mm 的透明薄膜并用胶粘剂封贴，主体反应器四周及上下安装可调亮度的功率为300W白炽 灯20盏，30W节能射灯50盏；反应器内调速浆叶轮搅拌器转速为80r/m；卷水轮转速 为100r/m，咸淡水营养液以0.06m/s的低速率循环；咸淡水营养液调配及温度调控系统 配备3只容量10000L贮液罐，搅拌器转速为60r/m。咸淡水营养液组成：清水64％，海 水36％，硝酸钾0.33g/L，醋酸钠0.55g/L，硫酸镁0.03g/L，磷酸二氢钾0.08g/L，尿 素0.8g/L；清水及海水可经臭氧发生器杀菌；营养液采用经95℃加热杀菌10分钟；藻 细胞生长温度为16℃；光照强度为96.25-140μmol.m-2.s-1；无菌空气鼓入量为1m3/m；咸 淡水营养液溶解氧浓度为54％饱和度；藻细胞生长的pH值为中性，藻细胞迅速生长增殖 培养周期为60h，藻细胞分裂增殖处于对数生长期，藻细胞呈绿色。经检测，所获取的 雨生红球藻藻种无污染，藻种生命力旺盛。
实施例六：
建立全天候封闭式大规模运行系统光生物反应器，主体反应器(水槽)长宽深为1000 ×200×68cm，底部及四周采用2.5cm厚的无色透明钢化玻璃，封盖部分采用厚度为 0.25mm的透明薄膜并用胶带纸封牢，主体反应器四周及上下安装可调亮度的功率为150W 太阳灯18盏，40W日光灯12盏；反应器内调速浆叶轮搅拌器转速为30r/m；卷水轮转 速为60r/m，咸淡水营养液以0.04m/s的低速率循环；咸淡水营养液调配及温度调控系 统配备3只容量7000L的贮液罐，搅拌器转速为100r/m。咸淡水营养液组成：清水56％， 海水44％，硝酸钾0.38g/L，硫酸镁0.6g/L，醋酸钠0.38g/L，尿素0.9g/L；清水及海 水可经臭氧发生器杀菌；营养液采用经98℃加热杀菌6分钟；藻细胞生长温度为21℃； 光照强度为105-140μmol.m-2.s-1；无菌空气鼓入量为0.9m3/m；咸淡水营养液溶解氧浓度 为49％饱和度；藻细胞生长的pH值为7.2，藻细胞迅速生长增殖培养周期为54h，藻细 胞分裂增殖处于对数生长期，藻细胞呈绿色。经检测，所获取的雨生红球藻藻种无污染， 藻种生命力旺盛。
实施例七：
建立全天候封闭式大规模运行系统光生物反应器，主体反应器(水槽)长宽深为800 ×150×65cm，底部及四周采用2cm厚的无色透明钢化玻璃，封盖部分采用厚度为0.16mm 的透明薄膜并用胶带纸封牢，主体反应器四周及上下安装可调亮度的功率为300W太阳 灯8盏，40W日光灯13盏；反应器内调速浆叶轮搅拌器转速为60r/m；卷水轮转速为 30r/m，咸淡水营养液以0.06m/s的低速率循环；咸淡水营养液调配及温度调控系统配 备3只容量6000L的贮液罐，搅拌器转速为200r/m。咸淡水营养液组成：清水50％，海 水50％，硝酸钾0.33g/L，醋酸钠0.45g/L，尿素0.7g/L；清水及海水可经臭氧发生器杀 菌；营养液采用经96℃加热杀菌10分钟；藻细胞生长温度为23℃；光照强度为113.75 -122.5μmol.m-2.s-1；无菌空气鼓入量为0.7m3/m；咸淡水营养液溶解氧浓度为52％饱和度； 藻细胞生长的pH值为7.3，藻细胞迅速生长增殖培养周期为76h，藻细胞分裂增殖处于 对数生长期，藻细胞呈绿色。经检测，所获取的雨生红球藻藻种无污染，藻种生命力旺 盛。
实施例八：
建立全天候封闭式大规模运行系统光生物反应器，主体反应器(水槽)长宽深为900 ×160×65cm，底部及四周采用2.5cm厚的无色透明钢化玻璃，封盖部分采用厚度为 0.4mm的透明薄膜并用胶带纸封牢，主体反应器四周及上下安装可调亮度的功率为200W 太阳灯10盏，30W节能灯20盏；反应器内调速浆叶轮搅拌器转速为50r/m；卷水轮转 速为30r/m，咸淡水营养液以0.05m/s的低速率循环；咸淡水营养液调配及温度调控系 统配备3只容量8000L的贮液罐，搅拌器转速为200r/m。咸淡水营养液组成：清水70％， 海水30％，硝酸钾0.27g/L，硫酸镁0.01g/L，醋酸钠0.33g/L，尿素0.85g/L；清水及海 水可经臭氧发生器杀菌；营养液采用经96℃加热杀菌4分钟；藻细胞生长温度为26℃； 光照强度为105-113.75μmol.m-2.s-1；无菌空气鼓入量为0.8m3/m；咸淡水营养液溶解氧浓 度为54％饱和度；藻细胞生长的pH值为7.2，藻细胞迅速生长增殖培养周期为60h，藻 细胞分裂增殖处于对数生长期，藻细胞呈绿色。经检测，所获取的雨生红球藻藻种无污 染，藻种生命力旺盛。