《一株重盐碱地植物根际促生阿氏芽孢杆菌及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一株重盐碱地植物根际促生阿氏芽孢杆菌及其应用.pdf（10页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711396251.6 (22)申请日 2017.12.21 (83)生物保藏信息 CGMCC No.11973 2016.01.07 (71)申请人 山东省林业科学研究院 地址 250014 山东省济南市历下区文化东 路42号 (72)发明人 井大炜马海林刘方春刘幸红 马丙尧杜振宇杨庆山周健 彭琳 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 王志坤 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A01N 63/02(2006.。
2、01) A01N 63/00(2006.01) A01P 21/00(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一株重盐碱地植物根际促生阿氏芽孢杆菌 及其应用 (57)摘要 本发明公开了一株重盐碱地根际促生阿氏 芽孢杆菌及其应用。 该菌株可提高柽柳在重盐碱 环境中的耐盐碱能力。 将本发明的重盐碱地根际 促生阿氏芽孢杆菌制成生物菌剂， 接种到柽柳根 系周围， 经一定时间的盐分胁迫后， 同不接种菌 剂相比， 可促进柽柳生长， 提高柽柳的根系及植 株含水量。 因此， 本发明可作为接种剂在重盐碱 生境中应用， 为提高成柽柳的抗盐碱能力提供了 优良的菌株资源。 权利要求书。
3、1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 CN 108102958 A 2018.06.01 CN 108102958 A 1.一株重盐碱地根际促生阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)GPR018， 已于2016年 1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC No.11973。 2.权利要求1所述重盐碱地根际促生阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)GPR018的 培养方法， 包括在脱脂奶粉培养基上进行发酵的过程。 3.权利要求1所述重盐碱地根际促生阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)GPR018的 。
4、发酵培养物， 其特征在于， 所述发酵培养物包括阿氏芽孢杆菌GPR018菌体。 4.根据权利要求3所述的发酵培养物， 其特征在于， 发酵培养物中阿氏芽孢杆菌GPR018 菌落数为103-108cfu/mL。 5.一种包含权利要求1所述菌株或权利要求3-4任一项所述发酵培养物的使用产品， 包 括微生物菌剂或组合物形式。 6.根据权利要求5所述产品， 其特征在于， 所述产品包括载体， 所述载体为固体载体或 液体载体； 优选的， 固体载体选自黏土、 滑石、 高岭土、 蒙脱石、 沸石、 硅石、 玉米粉、 豆粉、 聚乙烯醇 和/聚乙二醇、 海藻糖中的一种或多种； 液体载体选自植物油、 矿物油、 水中的一种。
5、。 7.根据权利要求5所述产品， 其特征在于， 所述产品为粉末形态、 溶液形态或颗粒形态， 优选的， 产品的粉末形态是菌株或发酵培养物的冻干粉末。 8.权利要求1所述菌株或权利要求3-4任一项所述发酵培养物、 权利要求5-7任一项所 述产品在重盐碱环境下促进植物生长、 提高植物叶片含水量或降低植物膜质过氧化损害中 的应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述植物为柽柳。 10.根据权利要求8或9所述的应用， 其特征在于， 所述应用中， 将菌株或发酵培养物、 产 品施用到植物根系周围。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108102958 A 2 一株重盐碱地植物根际促生阿氏芽孢。
6、杆菌及其应用 技术领域 0001 本发明属于农林微生物技术领域， 具体涉及一株重盐碱地植物根际促生阿氏芽孢 杆菌及其应用。 背景技术 0002 土地盐碱化是制约农林业发展的重要因素之一。 盐渍化严重限制了植物生长， 从 而对作物产量造成很大影响。 据统计， 全世界由于盐渍化造成灌溉区作物的损失多达110亿 美元， 且在不断增加。 目前， 盐渍化土壤占陆地总面积的30左右， 全世界约有10亿多hm2的 土地处于盐渍化状态。 根据农业部组织的第2次全国普查资料统计报道， 中国的盐渍土总面 积占全国可利用土地面积的4.88， 其中耕地中盐渍化面积达到920.9万hm2， 占全国耕地 面积的6.62。。
7、 NaHCO3与Na2CO3是内陆苏打盐碱土的主要成分， 生长在此类土壤上的植物容 易受到Na+、 高pH及低水势的多重胁迫， 造成土壤透水性与通气性降低， 土壤溶液的渗透压 增加， 土壤养分的有效性降低， 严重限制了植物的正常生长， 导致地表植被群落多样性不断 降低。 0003 微生物在提高植物耐盐碱能力方面发挥着重要作用。 杨庆山等人申请了一株阴沟 肠杆菌TIA062(CN201610330288.8)， 可有效提高一定盐分条件下白蜡的耐盐性； 杜传英等 人采用温度筛选与表面定向培养相结合的方法对东北地区土壤中可培养耐盐芽胞杆菌进 行分离和筛选， 认为弯曲芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌的耐盐能力较。
8、好； 王慧捷等人研究认为， 番茄接种桔黄假单胞菌后， 可耐酸碱， 对病菌表现出较高的抗菌活性。 0004 植物根际促生细菌(Plant growth-promoting rhizobacteria， PGPR)是一类生存 于植物根际、 根表， 对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益细菌。 大量试验表明， 许多PGPR菌株表现出明显的促进植物生长、 防治土传病害、 提高植物对非生物胁迫的抗逆 性、 促进土壤生物修复等效果。 PGPR可以通过一种或几种作用机制直接或间接促进植物生 长， PGPR的直接促生机制包括： 产生植物激素、 溶鳞、 固氮、 产嗜铁素、 分泌ACC脱氨酶等。 然 而多数植。
9、物和植物根际促生细菌不具有抵抗高盐、 高盐碱的能力， 尤其是在重度盐碱的情 况下， 植物根际环境中的有益微生物减少， 导致植物根际的生物活性降低， 耐盐性下降。 筛 选适宜重度盐碱环境下适宜植物根际促生细菌， 提高植物耐盐碱性， 发挥微生物-植物联合 修复作用， 在重盐碱地生态修复中具有巨大的应用潜力。 发明内容 0005 针对上述现有技术存在的问题， 发明人针对重盐碱地植物根际土壤进行筛选， 从 柽柳根际土壤中获得一株重盐碱地根际促生阿氏芽孢杆菌， 可提高柽柳在重盐碱环境中的 耐盐碱能力。 0006 具体的， 本发明涉及以下技术方案： 0007 本 发 明 的 目 的 之 一 在 于 提 供。
10、 一 株 重 盐 碱 地 根 际 促 生 阿 氏 芽 孢 杆 菌 (Bacillusaryabhattai)GPR018， 已于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 说明书 1/5 页 3 CN 108102958 A 3 会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC No.11973。 0008 本 发 明 的 目 的 之 二 在 于 提 供 重 盐 碱 地 根 际 促 生 阿 氏 芽 孢 杆 菌 (Bacillusaryabhattai)GPR018的培养方法， 尤其是包括在脱脂奶粉培养基上进行发酵的 过程。 0009 本 发 明 的 目 的 之 三 在 于 提 供 重 盐 碱 。
11、地 根 际 促 生 阿 氏 芽 孢 杆 菌 (Bacillusaryabhattai)GPR018的发酵培养物， 所述发酵培养物包括阿氏芽孢杆菌GPR018 菌体。 0010 优选的实施方案中， 发酵培养物中阿氏芽孢杆菌GPR018菌落数为103-108cfu/mL。 0011 本发明的目的之四在于提供一种包含GPR018菌株或其发酵培养物的使用产品， 包 括微生物菌剂或组合物形式。 0012 优选的实施方案中， 所述产品包括载体， 所述载体可以为固体载体或液体载体； 例 如固体载体可以选自黏土、 滑石、 高岭土、 蒙脱石、 沸石、 硅石、 玉米粉。 豆粉、 聚乙烯醇或聚 乙二醇、 海藻糖等；。
12、 液体载体可以为植物油、 矿物油、 水等。 优选的实施方案中， 所述产品可 以为粉末形态、 溶液形态、 颗粒形态等。 例如产品的粉末形态可以是菌株或其发酵物的冻干 粉末。 0013 本发明的目的之四在于提供上述菌株或其发酵培养物、 以及产品在重盐碱环境下 促进植物生长、 提高植物叶片含水量或降低植物膜质过氧化损害中的应用。 优选的， 所述植 物为柽柳。 0014 优选的实施方案中， 所述应用中， 将上述菌株或其发酵培养物、 以及产品施用到植 物根系周围。 0015 本发明所述盐碱环境， 主要是NaHCO3与Na2CO3为主要成分是苏打盐碱土， 生长在此 类土壤上的植物容易受到Na+、 高pH及。
13、低水势的多重胁迫， 造成土壤透水性与通气性降低， 土壤溶液的渗透压增加， 土壤养分的有效性降低， 严重限制了植物的正常生长。 0016 本发明取得了以下有益效果： 0017 本发明的一株重盐碱地根际促生阿氏芽孢杆菌及其应用， 可提高柽柳在重盐碱环 境中的耐盐碱能力。 将本发明的重盐碱地根际促生阿氏芽孢杆菌制成生物菌剂， 接种到柽 柳根系周围， 经一定时间的盐分胁迫后， 同不接种菌剂相比， 可促进柽柳生长， 提高柽柳的 根系、 叶片及植株含水量。 因此， 本发明可作为接种剂在重盐碱生境中应用， 为提高成柽柳 的抗盐碱能力提供了优良的菌株资源。 附图说明 0018 图1本发明菌株GPR018菌落形。
14、态； 0019 图2本发明菌株GPR018光学显微镜镜检视野图； 0020 图3本发明菌株GPR018的系统发育树 0021 图4实施例3不同盐分浓度下不同菌株的所测OD600值 具体实施方式 0022 下面结合实施例对本发明做进一步的说明， 以下所述， 仅是对本发明的较佳实施 例而已， 并非对本发明做其他形式的限制， 任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 说明书 2/5 页 4 CN 108102958 A 4 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。 凡是未脱离本发明方案内容， 依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化， 均落在本发明的保护范围内。 0023 实。
15、施例1重盐碱地根际促生菌的筛选分离及保藏 0024 采集黄河三角洲柽柳根际土样样品6个。 通过梯度稀释法， 从根际土样中分离出细 菌分离物。 通过三区划线法对分离到的细菌进行纯化， 并通过镜检判断菌株是否纯化， 对纯 化后的细菌进行编号， 挑取单菌落， 用灭菌牙签接种于脱脂奶粉培养基平板上。 37培养2d 后， 选取出现透明圈的菌落， 测量菌落直径d和透明圈直径D， 并计算D/d， 选出比值大的进行 纯化并反复验证产蛋白酶的效果， 选取功能稳定的菌株进一步复筛。 0025 复筛采用Folin酚法。 将1mL原发酵液加2mL质量分数为0.5的酪蛋白液在pH值 7.0、 37水浴15min， 再用。
16、质量分数为10的三氯乙酸灭活， 然后取1mL上述反应液的离心 上清液加1mL Folin酚在5mL 0.55mol/L的Na2CO3的碱性条件下37水浴15min测660nm下的 吸光度值。 以加灭活酶液的反应系统为空白。 将复筛得到的菌株通过柽柳育苗及盆栽实验， 确定一株促进柽柳生长效果最好的细菌， 编号为GPR018。 0026 实施例2重盐碱地根际促生菌GPR018的生理生化及分子鉴定 0027 菌落特征及菌体形态： 菌落圆形规则， 菌落大， 表面凸起， 较湿润， 微黄色， 不透明， 菌体较小， 呈杆状， 有芽孢， 其菌落形态如图1所示， 其光学显微镜镜检如图2所示。 0028 生理生化。
17、特征： 接触酶试验阳性， 柠檬酸盐利用试验阳性， 水解淀粉试验阴性， V-P 测定试验阴性， D-葡萄糖试验阴性， D-甘露醇试验阴性， 海藻糖试验阴性， D-山梨醇试验阴 性， 蔗糖试验阴性， 葡萄糖产气试验阴性。 0029 功能定性及定量测定： 将1mL原发酵液加2mL质量分数为0.5的酪蛋白液， 在pH值 7.0、 37水浴15min， 再用质量分数为10的三氯乙酸灭活， 然后取1mL上述反应液的离心 上清液加1mL Folin酚在5mL 0.55mol/L的Na2CO3的碱性条件下37水浴15min测660nm下的 吸光度值。 以加灭活酶液的反应系统为空白。 在此反应条件下定义： 每1。
18、min生成1ug酪氨酸 所需酶量定义为一个酶活(IU)。 通过测定， 发酵液中蛋白酶酶活为47.22 g/ml。 0030 GPR018的16S rDNA序列 0031 ACATTGGGGGCATGCCTATAATGCAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGT GAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCT CCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGT。
19、GCATTAGCTAGTTGGTGA GGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAT GAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACAAGAGTAACTGCTTGTACCTTGACGGTACC TAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC。
20、GTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTG GGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAAC TGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACC AGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCC TGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTG。
21、TTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAA GCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCAT GTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCC 说明书 3/5 页 5 CN 108102958 A 5 CCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC。
22、CGCAA CGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAA GGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCT GCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAG CTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTA。
23、CACACCGCCCGTCACAC CACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAAGGAGCTAGCCGCCTAAGGTGGACAGGATAATGG (SEQ ID NO:1) 0032 鉴定分析： 系统发育树如图3所示， 由系统发育树可以看出， GPPR018同阿氏芽孢杆 菌(Bacillus aryabhattai)处于同一分枝上， 两者的相似度达98.57， 因此将GPR018初步 鉴定为阿氏芽孢杆菌。 0033 生物保藏信息： 一株重盐碱地根际促生阿氏芽孢杆菌， 该菌株分类命名为阿氏芽 孢杆菌(Bacillus aryabhattai)GPR018。
24、， 已于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院 微生物研究所， 邮编100101)， 保藏编号为CGMCC No.11973。 0034 实施例3GPR018的耐盐能力和重盐碱环境下的促生效果 0035 1.耐盐能力 0036 选 择 4 种阿氏 芽 孢 杆 菌 ， 分 别 为 阿氏 芽 孢 杆 菌 B P R 0 7 8 (保 藏 编 号 为 (CGMCCNo.11971)、 阿氏芽孢杆菌BPR088(保藏编号为(CGMCC No.11972)、 阿氏芽孢杆菌 JIA2(保藏编号为(CGMC。
25、C No.11967)和本发明的阿氏芽孢杆菌GPR018(保藏编号为(CGMCC No.11973)。 将4株产生长素菌株先接种至液体LB培养基中， 180rpm， 37恒温摇床培养24h。 后取200 L活化菌液到到氯化钠浓度分别是1， 3， 6， 9的LB的液体培养基里， 每个梯 度三个平行， 后置于180rpm， 37恒温摇床培养24h， 采用分光光度计， 以不接种菌悬液的对 应培养基为空白对照， 比浊法定期取样， 平行3次测定菌液的OD600。 结果如图4所示， 可以看 出， 当氯化钠浓度增加到6时， GPR018的OD600明显大于其他三种阿氏芽孢杆菌， 说明其耐 盐能力明显高于其他。
26、菌株。 0037 2.重盐碱环境下的应用效果 0038 将保存在斜面上的GPR018用三区划线的方法活化在LB(蛋白胨10g； NaCl 10g； 酵 母浸膏5g； 琼脂15-20g； 水1000ml； pH 7.0-7.2， 分装， 121灭菌20min)平板上。 挑取单菌落 至相应的10ml液体培养基中， 37， 180rpm培养24h。 按1接种量将种子液接种至相应的 50ml液体培养基中进行发酵， 37， 180rpm培养2d。 0039 将培育的柽柳容器苗栽植于塑料盆中， 培养一段时间2个月后， 对柽柳进行胁迫处 理。 2种碱性盐NaHCO3和Na2CO3按摩尔比9:1混合， 设置4。
27、00mmol/L浓度， 胁迫处理时以浇透盐 水为准。 胁迫的同时接种GPR018菌液， 取5ml菌液稀释10倍接种到柽柳根部周围。 以不接种 菌液(浇灌相同量的培养基)作为对照， 每个处理10株， 正常管理。 胁迫处理历时40天， 然后 取相同部位的成熟叶片进行生理指标的测定。 分别采用卷尺测定株高， 计算株高生长量(碱 胁迫结束时株高-碱胁迫开始时株高)； 对照的株高测定和计算方法与胁迫处理一致。 采用 烘干法测定柽柳叶片的相对含水量， 采用硫代巴比妥酸比色法测定柽柳叶片的丙二醛 (MDA)含量。 结果如表1所示， 可以看出， 柽柳胁迫40d后， 接种GPR018可使叶片相对含水量提 高12。
28、.29， 丙二醛含量降低22.15， 株高生长量增加了27.0， 盐胁迫下GPR018可提高柽 说明书 4/5 页 6 CN 108102958 A 6 柳的耐盐性， 促进柽柳生长。 0040 表1GPR018在重盐碱环境下的促生效果 0041 说明书 5/5 页 7 CN 108102958 A 7 SEQUENCE LISTING 山东省林业科学研究院 一株重盐碱地植物根际促生阿氏芽孢杆菌及其应用 1 PatentIn version 3.5 1 1461 DNA Bacillus aryabhattai 1 acattggggg catgcctata atgcagtcga gcgaact。
29、gat tagaagcttg cttctatgac 60 gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gcaacctgcc tgtaagactg ggataacttc 120 gggaaaccga agctaatacc ggataggatc ttctccttca tgggagatga ttgaaagatg 180 gtttcggcta tcacttacag atgggcccgc ggtgcattag ctagttggtg aggtaacggc 240 tcaccaaggc cacgatgcat agccgacctg agagggtgat cggccacact gggact。
30、gaga 300 cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct 360 gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ctttcgggtc gtaaaactct gttgttaggg 420 aagaacaagt acaagagtaa ctgcttgtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480 taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gaattattgg 540 gcgtaaagcg 。
31、cgcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg 600 gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagaga aaagcggaat tccacgtgta 660 gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcggctt tttggtctgt 720 aactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780 cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttag。
32、a gggtttccgc cctttagtgc tgcagctaac 840 gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg 900 gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960 ggtcttgaca tcctctgaca actctagaga tagagcgttc cccttcgggg gacagagtga 1020 caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggt。
33、taag tcccgcaacg 1080 agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat ttagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140 gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200 cacacgtgct acaatggatg gtacaaaggg ctgcaagacc gcgaggtcaa gccaatccca 1260 taaaaccatt ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc tacatgaagc tggaatcgct 1320 agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380 tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtggagt aaccgtaagg agctagccgc 1440 ctaaggtgga caggataatg g 1461 序列表 1/1 页 8 CN 108102958 A 8 图1 图2 说明书附图 1/2 页 9 CN 108102958 A 9 图3 图4 说明书附图 2/2 页 10 CN 108102958 A 10 。