技术领域
本发明是一种用于分子生物学方法检测中药材的技术领域的鉴定引物序列及 其鉴定方法,特别是一种中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定引物序列及其鉴定方法。
技术背景
中药肉苁蓉(Herba Cistanches)为列当科植物肉苁蓉(Cistanche deserticola Y.C.Ma)的干燥带鳞叶的肉质茎,是传统的补益中药。现代研究证明肉苁蓉具有 调节神经内分泌系统、免疫调节、抗氧化、增强体力和抗疲劳、抗肝炎、抗肿瘤、 通便作用以及镇静、抗衰老及促进创伤愈合等作用。肉苁蓉生于干旱沙漠,为根 寄生植物,寄主为梭梭(Haloxylon ammodena Bunge)、白梭梭(H.persicum Bunge)、 柽柳、盐爪爪、珍珠柴和白刺等。肉苁蓉属植物全世界约有20余种,主要分布于 欧、亚洲温暖的干燥地区,我国分布有4种,即肉苁蓉、盐生肉苁蓉(C.salsa(C.A. Mey.)G Beck)、管花肉苁蓉(C.tubulosa(Schrenk.)R.Wight)、沙苁蓉(C.sinensis G Beck),其中肉苁蓉为《中华人民共和国药典》规定的中药肉苁蓉的基源植物,因 其药材粗壮、密被鳞片、质感柔润而备受欢迎。由于肉苁蓉生长繁殖的特殊性, 加之疗效显著而被人为的滥挖以及大批砍伐其寄主梭梭,致使肉苁蓉野生资源急 骤减少,因此同属其它植物也在各地区作肉苁蓉入药。市场上甚至有锁阳 (Cynomorium songaricum Rupr.)混淆使用。
鉴于肉苁蓉药材资源紧缺以及市场上伪品较多等问题,因此需要快速、准确 鉴别药材真伪的方法。然而传统的形态及理化方法鉴定要求有一定的经验,对于 破碎后的药材就更加难以准确鉴别。基于DNA序列的分子遗传标记技术则不存 在这方面的问题,同时具有用量少、效率高、准确可靠的特点。对于肉苁蓉的开 发与生产有着重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足,提供一种中药肉苁蓉聚合酶链反 应的鉴定引物序列及其鉴定方法。使其能够对肉苁蓉药材准确鉴别其真伪,有益于 控制药材质量,同样适用于海关检验等相关部门的使用。
本发明是通过以下技术方案实现的,本发明肉苁蓉聚合酶链式反应的鉴定引 物序列为:
引物1:5’-AGA GAG AGA GAG AGA GTC-3’,
引物2:5’-AAC TCG TGA CAA CCA CAC-3’。
本发明的中药肉苁蓉聚合酶链反应的鉴定方法为:
1)药材DNA的提取:按常规方法进行,用无离子水将受试样品模板DNA浓 度调节至0.2~0.5ng/μl。
2)鉴别性聚合酶链式反应:
反应体系以50μl为参考,引物用无离子水调至10pmol/μl,各试剂的用量分 别为:
10×TaqDNA聚合酶缓冲液 5μl
MgCl2(25mM) 3μl
dNTP(10mM) 1μl
引物1 1.5~2.0μl
引物2 1.5~2.0μl
供试样品DNA模板 40~60ng
Taq DNA聚合酶 1.0~2.0单位
无离子水 加到50μl
混匀后,瞬时离心
3)鉴定反应条件:反应在基因扩增仪上进行,94℃预变性5分钟,然后按照 下列参数进行40次循环反应:
变性94℃ 50秒
复性50~55℃ 1分钟
延伸72℃ 1分钟
循环结束后在72℃保持8分钟,反应结束后在4℃保存。
4)反应产物的电泳检测:取出上述反应混和液6~8μl,与2μl加样缓冲液混合 均匀,用2%琼脂糖凝胶,电压5v/cm,电泳检测扩增结果。
所述的2%琼脂糖凝胶是指:含0.5%溴化乙锭,即EB。
5)若有阳性扩增,则供试样品为正品肉苁蓉;若为阴性,即无扩增条带,则 供试样品不为肉苁蓉。
本发明解决了中药材肉苁蓉真伪的鉴别问题,在对肉苁蓉的研究中设计了可 以鉴别肉苁蓉的一对高效特异性引物。该引物在给定的反应条件下只特异性地鉴 别肉苁蓉,对于其他种类的肉苁蓉药材或伪品均不能扩增出该基因片段。由于应 用了聚合酶链式反应的方法,因此可以快速方便地检测样品的真伪,通常只需要 极少量的样品,用此引物还可以制造用于肉苁蓉鉴别的试剂盒。本发明对于从事中 药生产、销售的部门快速准确地鉴定肉苁蓉,控制药材质量是十分必要,对于各地 药检部门打击假冒伪劣药材,净化药材市场将是十分有效的。肉苁蓉植物为濒危 保护植物,其资源的保护尤为重要,本发明的方法同样适用于海关检验等相关部门 的使用。
附图说明
图1是实施例的聚合酶链式反应结果示意图
其中M为100bp分子量梯度,1为盐生肉苁蓉,2为沙苁蓉,3为肉苁蓉,4 为管花肉苁蓉,5为空白对照。
具体实施方法
首先用植物DNA提取试剂盒(QIAGEN,Germany)从不同肉苁蓉植物中 提取总DNA,用ISSR-PCR方法扩增并比较扩增产物,对不同种植物的特异性片 段进行纯化、克隆,并测序,根据测序后DNA序列再设计引物并进行不同植物 样品的PCR扩增,直至根据克隆、测序所获得的引物能够针对某种植物或药材只 能扩增出单一条带。针对肉从药材以及伪、混品出现的情况,分别设计一对鉴别 性PCR引物:
引物1:5’-AGA GAG AGA GAG AGA GTC-3’,
引物2:5’-AAC TCG TGA CAA CCA CAC-3’。
用全自动DNA合成仪按上述DNA序列进行合成,即可得到鉴定引物的白色 粉末结晶。以上均为本发明的基础工作,本发明的使用者只需按实施例实施即可:
药材DNA的提取:按常规方法进行,用无离子水将受试样品模板DNA浓度 调节至0.2~0.5ng/μl。
鉴别性聚合酶链反应:反应体系以50μl为参考,引物用无离子水调至 10pmol/μl,各物品的用量分别为:
10×TaqDNA聚合酶缓冲液 5μl
MgCl2(25mM) 3μl
dNTP(10mM) 1μl
引物1 17μl
引物2 16μl
供试样品DNA 2.0~3.0μl
Taq DNA聚合酶 1.0单位
无离子水 加到50μl
混匀后,瞬时离心。
聚合酶链反应条件:反应在PCR仪上进行,94℃预变性5分钟,然后按照下 列参数进行40次循环反应:
变性94℃ 50秒
复性50~55℃ 1分钟
延伸72℃ 1分钟
循环结束后在72℃保持8分钟,反应结束后在4℃保存。
反应产物的电泳检测:取出上述反应混和液6~8μl,与2μl加样缓冲液混合均 匀,用2%琼脂糖凝胶(含0.5%溴化乙锭,即EB),电压5v/cm,电泳检测扩增 结果,如图1所示。