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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611160806.2 (22)申请日 2016.12.15 (71)申请人 陕西玉航电子有限公司 地址 710065 陕西省西安市高新区沣惠南 路36号橡树街区1号楼10501室 (72)发明人 郝青 (74)专利代理机构 西安亿诺专利代理有限公司 61220 代理人 贾苗苗 (51)Int.Cl. C07K 14/765(2006.01) C07K 14/77(2006.01) (54)发明名称 一种玉米赤霉醇完全抗原的制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种玉米赤霉醇完。
2、全抗原的制 备方法， 其特征在于包括以下步骤： 称取2mgZER 溶于3mL丙酮， 加过量碳酸钾10mg和1微升4-溴丁 酸乙酯， 在60下回流24h； 本发明所述抗原效价 高， 灵敏性强， 且制备方法,操作简单， 可工业化 生产， 实用性强。 权利要求书1页 说明书3页 CN 106749624 A 2017.05.31 CN 106749624 A 1.一种玉米赤霉醇完全抗原的制备方法， 其特征在于包括以下步骤： （1） 称取2mgZER溶于3mL丙酮， 加过量碳酸钾10mg和1微升4-溴丁酸乙酯， 在60 下回流24h； （2） 反应完成后， 室温下避光静置2d， 抽滤去除沉淀， 旋转蒸。
3、发干滤液， 用2mL=20的 NaOH-甲醇溶液80摄氏度环境下碱解1h， 旋转蒸发干溶液； （3） 用2mL双蒸水溶解， 2mol L的硫酸调pH3 5， 再用23mL乙酸乙酯反复萃取5次， 弃去 水相， 用饱和食盐水过滤1次后加无水硫酸钠干燥， 抽滤后将溶液旋转蒸发干， 收集黄色油 状物即为改造好的半抗原， 称为ZERO； （4） 称取2mgZERO溶于1mL二氧六环， 加入1 2扯L三丁胺， 4冷却15min后加入0 5微升 氯甲酸异丁酯， 4下继续搅拌20min； 反应结束后将混合液缓慢滴加入含6mgBSA的溶液中， 加入过程在20min内完成； （5） 反应1h后用0 5mol LN。
4、aOH溶液将pH调至8 5后继续反应2h； （6） 反应产物用2L蒸馏水透析3d， 每天换透析液68次； 透析后所得溶液即为免疫抗原 ZERBSA； （7） 取2mg改造好的ZER半抗原溶于1mLN， N-二甲基甲酰胺(DMF)， 加入2mgEDC和1 2mgNHS， 室温下搅拌反应2h即为A液； （8） 将3mgOVA提前1d用0 5mL的1 3g L碳酸氢钠溶液溶解， 4冷藏即为B液； （9） 将A溶液缓慢滴加至B液中， 室温搅拌2h后把合成产物在0 01mol L的PBS溶液中透 析3d， 每天换透析液68次， 透析后所得溶液即为免疫抗原ZEROVA。 2.如权利要求1所述一种玉米赤霉醇。
5、完全抗原的制备方法， 其特征在于所述步骤 （4） 6mgBSA溶解在500微升CBS和500微升二氧六环的混合溶液中。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106749624 A 2 一种玉米赤霉醇完全抗原的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种玉米赤霉醇完全抗原的制备方法。 背景技术 0002 玉米赤霉醇(Zeranol， ZER)又名 “右环十四酮酚” ， 是玉米赤霉菌在生长过程中产 生的次生代谢产物玉米赤霉烯酮(Zearalenone， ZEN)的还原产物。 由于ZEN在玉米、 小麦、 高 梁等重要农作物中广泛存在， 因而玉米赤霉醇可能污染粮食、 饲料， 最终导致其在动物产品 中残留。
6、。 另外， 由于ZER可以提高牛、 羊饲料的转化率， 增加牛、 羊胴体瘦肉率， 曾一度作为 牛、 羊生长促进剂， 以埋植形式被广泛使用。 虽然ZER在体内大部分会被代谢掉， 但仍有一部 分会残留在埋植部位。 ZER及其代谢产物具有类雌激素作用， 能引发动物流产、 死胎、 甚至不 育， 还具有肝毒性、 免疫毒性、 细胞毒性、 致畸性和致癌性等4。 6j。 1998年， 欧盟明确禁止在 畜禽养殖过程中使用ZER。 中国农业部也在2002年发布的第235号公告中明确规定： 禁止在 所有食品动物中使用ZER， 并且在动物源性食品中不得检出。 目前， ZER的检测方法主要有薄 层色谱法(TLC)、 高效。
7、液相色谱法(HPLC)， 由于这2种方法本身一些限制而不能被普及， TLC 只能用来做定性分析； HPLC检测尽管比较灵敏、 准确， 但存在检测仪器贵重、 检测费用高、 需 要专业技术人员操作等缺点。 免疫分析技术是当今应用最广的检测方法之一， 因其具有快 速、 灵敏、 简便、 特异等优点已被广泛应用于食品和饲料中的真菌毒素检测凹。 0003 目前， ZER抗体制备及检测报道较少， 且检测灵敏度不高。 免疫学检测方法的灵敏 度主要决定于抗体质量， 而要获得高灵敏度抗体， 免疫原的制备是关键。 对于小分子物质而 言， 由于免疫原性较弱或没有免疫原性， 直接免疫动物不能刺激动物产生抗体。 发明内容。
8、 0004 本发明提出一种玉米赤霉醇完全抗原的制备方法。 0005 一种玉米赤霉醇完全抗原的制备方法， 包括以下步骤： （1） 称取2mgZER溶于3mL丙酮， 加过量碳酸钾10mg和1微升4-溴丁酸乙酯， 在60 下回流24h； （2） 反应完成后， 室温下避光静置2d， 抽滤去除沉淀， 旋转蒸发干滤液， 用2mL=20的 NaOH-甲醇溶液80摄氏度环境下碱解1h， 旋转蒸发干溶液； （3） 用2mL双蒸水溶解， 2mol L的硫酸调pH3 5， 再用23mL乙酸乙酯反复萃取5次， 弃去 水相， 用饱和食盐水过滤1次后加无水硫酸钠干燥， 抽滤后将溶液旋转蒸发干， 收集黄色油 状物即为改造好。
9、的半抗原， 称为ZERO； （4） 称取2mgZERO溶于1mL二氧六环， 加入1 2扯L三丁胺， 4冷却15min后加入0 5微升 氯甲酸异丁酯， 4下继续搅拌20min。 反应结束后将混合液缓慢滴加入含6mgBSA的溶液中， 加入过程在20min内完成； （5） 反应1h后用0 5mol LNaOH溶液将pH调至8 5后继续反应2h； （6） 反应产物用2L蒸馏水透析3d， 每天换透析液68次。 透析后所得溶液即为免疫抗原 说明书 1/3 页 3 CN 106749624 A 3 ZERBSA； （7） 取2mg改造好的ZER半抗原溶于1mLN， N-二甲基甲酰胺(DMF)， 加入2mgE。
10、DC和1 2mgNHS， 室温下搅拌反应2h即为A液； （8） 将3mgOVA提前1d用0 5mL的1 3g L碳酸氢钠溶液溶解， 4冷藏即为B液； （9） 将A溶液缓慢滴加至B液中， 室温搅拌2h后把合成产物在0 01mol L的PBS溶液中透 析3d， 每天换透析液68次， 透析后所得溶液即为免疫抗原ZEROVA。 0006 优选地， 所述步骤 （4） 6mgBSA溶解在500微升CBS和500微升二氧六环的混合溶液 中。 0007 本发明所述抗原效价高， 灵敏性强， 且制备方法,操作简单， 可工业化生产， 实用性 强。 具体实施方式 0008 实施例1。 0009 一种玉米赤霉醇完全抗原。
11、的制备方法， 包括以下步骤： （1） 称取2mgZER溶于3mL丙酮， 加过量碳酸钾10mg和1微升4-溴丁酸乙酯， 在60 下回流24h； （2） 反应完成后， 室温下避光静置2d， 抽滤去除沉淀， 旋转蒸发干滤液， 用2mL=20的 NaOH-甲醇溶液80摄氏度环境下碱解1h， 旋转蒸发干溶液； （3） 用2mL双蒸水溶解， 2mol L的硫酸调pH3 5， 再用23mL乙酸乙酯反复萃取5次， 弃去 水相， 用饱和食盐水过滤1次后加无水硫酸钠干燥， 抽滤后将溶液旋转蒸发干， 收集黄色油 状物即为改造好的半抗原， 称为ZERO； （4） 称取2mgZERO溶于1mL二氧六环， 加入1 2扯L。
12、三丁胺， 4冷却15min后加入0 5微升 氯甲酸异丁酯， 4下继续搅拌20min。 反应结束后将混合液缓慢滴加入含6mgBSA的溶液中， 加入过程在20min内完成； （5） 反应1h后用0 5mol LNaOH溶液将pH调至8 5后继续反应2h； （6） 反应产物用2L蒸馏水透析3d， 每天换透析液68次。 透析后所得溶液即为免疫抗原 ZERBSA； （7） 取2mg改造好的ZER半抗原溶于1mLN， N-二甲基甲酰胺(DMF)， 加入2mgEDC和1 2mgNHS， 室温下搅拌反应2h即为A液； （8） 将3mgOVA提前1d用0 5mL的1 3g L碳酸氢钠溶液溶解， 4冷藏即为B液；。
13、 （9） 将A溶液缓慢滴加至B液中， 室温搅拌2h后把合成产物在0 01mol L的PBS溶液中透 析3d， 每天换透析液68次， 透析后所得溶液即为免疫抗原ZEROVA。 0010 实施例2。 0011 一种玉米赤霉醇完全抗原的制备方法， 包括以下步骤： （1） 称取2mgZER溶于3mL丙酮， 加过量碳酸钾10mg和1微升4-溴丁酸乙酯， 在60 下回流24h； （2） 反应完成后， 室温下避光静置2d， 抽滤去除沉淀， 旋转蒸发干滤液， 用2mL=20的 NaOH-甲醇溶液80摄氏度环境下碱解1h， 旋转蒸发干溶液； （3） 用2mL双蒸水溶解， 2mol L的硫酸调pH3 5， 再用2。
14、3mL乙酸乙酯反复萃取5次， 弃去 说明书 2/3 页 4 CN 106749624 A 4 水相， 用饱和食盐水过滤1次后加无水硫酸钠干燥， 抽滤后将溶液旋转蒸发干， 收集黄色油 状物即为改造好的半抗原， 称为ZERO； （4） 称取2mgZERO溶于1mL二氧六环， 加入1 2扯L三丁胺， 4冷却15min后加入0 5微升 氯甲酸异丁酯， 4下继续搅拌20min。 反应结束后将混合液缓慢滴加入含6mgBSA的溶液中， 加入过程在20min内完成； （5） 反应1h后用0 5mol LNaOH溶液将pH调至8 5后继续反应2h； （6） 反应产物用2L蒸馏水透析3d， 每天换透析液68次。 。
15、透析后所得溶液即为免疫抗原 ZERBSA； （7） 取2mg改造好的ZER半抗原溶于1mLN， N-二甲基甲酰胺(DMF)， 加入2mgEDC和1 2mgNHS， 室温下搅拌反应2h即为A液； （8） 将3mgOVA提前1d用0 5mL的1 3g L碳酸氢钠溶液溶解， 4冷藏即为B液； （9） 将A溶液缓慢滴加至B液中， 室温搅拌2h后把合成产物在0 01mol L的PBS溶液中透 析3d， 每天换透析液68次， 透析后所得溶液即为免疫抗原ZEROVA。 0012 优选地， 所述步骤 （4） 6mgBSA溶解在500微升CBS和500微升二氧六环的混合溶液 中。 说明书 3/3 页 5 CN 106749624 A 5 。