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1、(10)授权公告号 CN 101348818 B (45)授权公告日 2011.05.18 CN 101348818 B *CN101348818B* (21)申请号 200810198243.5 (22)申请日 2008.08.29 C12P 19/40(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (73)专利权人 广东肇庆星湖生物科技股份有限 公司 地址 526040 广东省肇庆市端州区工农北路 67 号 (72)发明人 刘咏梅 陈华强 杨琼 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 罗晓林 JP 特开平 6-113876 A,1994.04.。
2、26, 全文 . JP 特开 2007-75109 A,2007.03.29, 全文 . CN 1410527 A,2003.04.16, 全文 . Demain A L et al.Production of guanosine-5-monophosphate and inosine-5-monophosphate by fermentation. Appl Microbiol .1966, 第 14 卷 ( 第 5 期 ),821-825. 吴敏芝等 . 肌苷发酵酵母粉量控制及其 表现 .发酵科技通讯 .2001, 第 30 卷 ( 第 4 期 ),8-11. (54) 发明名称 一种肌苷。
3、的生产方法 (57) 摘要 本发明公开了一种肌苷的生产方法， 一种肌 苷的生产方法， 步骤为 ： A、 一级种培养 ： 将菌株放 在一级培养中培养， 培养温度为 30 32、 旋转 式摇床22020rpm、 培养时间10-15小时， 得增值 菌株 ； B、 二级种培养 ： 将步骤A所得的增值菌株再 放到二级培养基中， 培养温度为 350.5、 培养 时间8-12小时， 得放大菌株 ； C、 菌株发酵 ： 将步骤 B 所得的放大菌株放到发酵培养基中， 进行发酵。 在整个发酵过程的不同时期， 糖苷转化率较对照 提高 10-30， 肌苷产率达到 545g/L。 (51)Int.Cl. (56)对比文。
4、件 审查员 李影 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 CN 101348818 B1/1 页 2 1. 一种肌苷的生产方法， 步骤为 ： A、 一级种培养 ： 将菌株放在一级培养基中培养， 培养温度为 30 32、 旋转式摇床 22020rpm、 培养时间 10-15 小时， 得增值菌株 ； B、 二级种培养 ： 将步骤 A 所得的增值菌株再放到二级培养基中， 培养温度为 350.5、 培养时间 8-12 小时， 得放大菌株 ； C、 菌株发酵 ： 将步骤 B 所得的放大菌株放到发酵培养基中， 进行发酵 ； 所述的一级种培养基是以下各浓度。
5、组份的混合物， 各组分的浓度单位是 g/L， 淀粉双 酶糖 305、 酵母粉 266、 KH2PO442、 硫酸铵 102、 硫酸镁 10.5、 CaCO3102、 尿素 51、 玉米浆 6010、 酵母膏 143、 蛋白胨 102、 NaCL 10.4、 腺嘌呤 1.20.1、 鸟嘌呤 1.20.1， 用去离子水配制后灭菌 ； 所述的二级种培养基是以下各浓度组份的混合物， 各组分的浓度单位是 g/L， 淀粉双酶 糖 505、 酵母粉 266、 KH2PO442、 硫酸铵 102、 硫酸镁 10.5、 CaCO3102、 尿素 51、 玉米浆 6010、 酵母膏 143、 NaCL 10.4、。
6、 腺嘌呤 1.20.1、 鸟嘌呤 1.20.1、 链霉素 1.80.1， 用去离子水配制后灭菌 ； 所述的发酵培养基是以下各浓度组份的混合物， 浓度单位是 g/L， 淀粉双酶糖 10030、 酵母粉 145、 KH2PO451、 硫酸镁 21、 脯氨酸 21， 味精 0.50.1、 玉米浆 805、 链霉素 1.80.1、 消泡剂， 用去离子水配制后灭菌 ； 在 发 酵 培 养 基 中 添 加 CaCL215g/L3、脂 肪 酸 10.1g/L 以 及 乙 酰 辅 酶 A 0.040.02g/L。 2. 根据权利要求 1 所述的生产方法， 其特征在于 ： 所述的尿素需在 1185的温度下 单独。
7、消毒 20min5 分钟。 3. 根据权利要求 2 所述的生产方法， 其特征在于 ： 所述的一级种培养时， 光密度的 26 倍 OD*26 净值 0.04、 无杂菌或噬菌体污染 ； 所述的二级种培养时， 通过碱性溶液控制二级 培养基的 pH 值为 6.7 0.2， 光密度的 26 倍 OD*26 净值 0.05， 无杂菌或噬菌体污染。 4. 根据权利要求 3 述的生产方法， 其特征在于 ： 所述的酵母粉先水解 365 小时， 在发 酵过程中通过流加糖份， 维持糖浓度在 2.2 2.5。 5. 根据权利要求 4 所述的生产方法， 其特征在于 ： 所述菌株发酵 403 小时后， 加入 5ug/ml。
8、 溶菌酶， 发酵 555 小时后， 停止加入溶菌酶。 6. 根据权利要求 5 所述的生产方法， 其特征在于 ： 所述的发酵初温 370.5， 发酵开 始时的 pH 值是 7.0， 在发酵过程中通过碱性溶液调节 pH 值维持在 6.0 7.0。 权 利 要 求 书 CN 101348818 B1/4 页 3 一种肌苷的生产方法 技术领域 0001 本发明涉及一种肌苷的发酵生产方法， 尤其是应用于生产各种药物及其前体物、 功能性食品等肌苷的发酵生产方法。 背景技术 0002 在食品工业中， 肌苷主要用于二步法生产 5 - 肌苷酸， 由于食品增味剂需求的增 加和对环境保护意识的增强， 发酵法生产肌苷。
9、已成为生产第二代和第三代增鲜剂的主要途 径， 取代了化学合成法和水解法。存在已知的利用枯草芽孢杆菌属微生物发酵生产肌苷 的方法， 所述的微生物时候腺嘌呤缺陷型菌株， 或者赋予了对各种物质， 包括嘌呤类似物 抗性的腺嘌呤营养缺陷型菌株 ( 日本专利公开 (KOKOKU) 号 38-23099， 5417033， 55-2956， 57-14160， 短杆菌属微生物 ( 日本专利公开 (KOKOKU) 号 51-5075， 58-17592， Agric.Biol. Chem， 42， 399(1978)， 对 8氮杂鸟嘌呤、 磺胺胍、 链霉素有三重抗性等等。微生物经诱变育 种后能够产生核酸类物质。
10、。肌苷产生菌应该具有以下特征 ： (1) 缺少 sAMP 合成酶 ： (2) 解 除在 5 -IMP 生物合成处的调节 ： (3) 缺乏肌苷降解的酶系， 如核苷磷酸化酶和核苷水解酶。 肌苷发酵的生产菌种主要有枯草杆菌、 短小芽孢杆菌和产氨短杆菌， 其中枯草杆菌的磷酸 酯酶活性较强， 有利于将 IMP 脱磷酸化形成肌苷， 分泌至胞外， 因而肌苷的发酵多采用枯草 杆菌的腺嘌呤缺陷型。 0003 目前主要用枯草杆菌， 产氨短杆菌及短小芽孢杆菌为出发菌种。生产菌种首先要 腺嘌呤与鸟嘌呤缺陷型。为了有效地积累肌苷， 还应该选择核苷酸酶活性强而核苷酸磷酸 化酶活性弱的菌株， 以促进肌苷的生成和生成的肌苷不。
11、再分解， 提高肌苷产量。 柏建新等经 诱变处理， 获得一株缺失核苷水解酶活性的突变株JSIM-B-198。 发酵50h-60h后， 平均产肌 苷 18.38g/L。王敖全等 M 用枯草芽孢杆菌 (BacillusSubtilis) 腺嘌呤缺陷形 (ade-)Na18 经一次亚硝基肌 (MNNG) 诱变处理及两次单菌落分离， 获得能利用酶法制造葡萄糖三次结 晶母液， 发酵生产肌苷的变异菌株 B:a， 摇瓶肌苷产量在 7.0 克 / 升以上。杨志荣等分离鉴 定出 6 株产氨短杆菌 (Brevibacterium ammoniagenes)， 筛选出腺嘌呤缺陷型和鸟嘌呤缺 陷型菌株， 摇瓶发酵最高产。
12、量达 12.1g/L. 0004 中国专利 CN101104865 属于芽孢杆菌属的肌苷生产细菌和生产肌苷的方法。具体 地， 本发明涉及从芽孢杆菌群中筛选出在含有 6- 乙氧基嘌呤的培养基中表现为有利生长 的菌株， 并从获得的菌株中筛选出表现为肌苷生产能力高的一种菌株， 以获得肌苷生产能 力改善的芽孢杆菌。 0005 中国专利 CN1410527 一种新型肌苷产生菌及其生产肌苷的方法， 该新型肌 苷产生菌为经选育的肌苷高产突变株产氨短杆菌 (Brevibacterium ammoniagenes) GMA-1198CCTCC M201025。本发明所提供的生产肌苷的方法， 其特点是用 GMA-。
13、1198CCTCC M201025 做发酵菌株， 利用糖质原料和生长素进行摇瓶发酵。产肌苷最高可达 28g/l。 说 明 书 CN 101348818 B2/4 页 4 发明内容 0006 本发明要解决的技术问题是提供一种工艺稳定、 产率高、 生产成本低的肌苷生产 方法。 0007 本发明所采用的技术方案是 ： 一种肌苷的生产方法， 步骤为 ： A、 一级种培养 ： 将菌 株放在一级培养基中培养， 培养温度为3032、 旋转式摇床22020rpm、 培养时间10-15 小时， 得增值菌株 ； B、 二级种培养 ： 将步骤 A 所得的增值菌株再放到二级培养基中， 培养温 度为 350.5、 培养。
14、时间 8-12 小时， 得放大菌株 ； C、 菌株发酵 ： 将步骤 B 所得的放大菌株 放到发酵培养基中， 进行发酵。菌株先后通过二级培养基后， 繁殖很多活性相同， 生物特性 相同的菌株。 0008 进一步 ： 在上述的肌苷的生产方法中， 所述的菌株是诱导突变的枯草芽孢杆菌 JSIM-1019-193 的突变体。为获得这样的突变菌株， 常规使用的一种方法是进行诱变处理 如紫外线照射或者亚硝基胍 (N- 甲基N硝基N亚硝基胍 ) 处理， 用合适的选择培 养基筛选目标突变菌株。所述的一级种培养基是以下各浓度组份的混合物， 浓度单位是 g/ L， 淀粉双酶糖 305， 酵母粉 266， KH2PO4。
15、42、 硫酸铵 102、 硫酸镁 10.5、 CaCO3102、 尿素 51、 玉米浆 6010、 酵母膏 143、 蛋白胨 102、 NaCL10.4、 腺嘌呤 1.20.1、 鸟嘌呤 1.20.1， 用去离子水配制后灭菌， 例如调节 pH 值为 7.00.5， 压力 0.1Mpa121 灭菌 25min。所述的二级种培养基是以下各浓度组份的混合物， 浓度单位是 g/L， 淀粉双 酶糖 505、 酵母粉 266、 KH2PO442、 硫酸铵 102、 硫酸镁 10.5、 CaCO3102、 尿素 51、 玉米浆 6010、 酵母膏 143、 NaCL10.4、 腺嘌呤 1.20.1、 鸟嘌呤。
16、 1.20.1、 链霉 素 1.80.1， 用去离子水配制后灭菌， 例如调节 pH 值为 7.00.5， 压力 0.1Mpa121灭菌 25min， 所述的尿素需在 11810的温度下单独消毒 20min5 分钟。 0009 所述的一级种培养时， 光密度的 26 倍 0D*26 净值 0.04、 无杂菌或噬菌体污染 ； 所述的二级种培养时， 通过碱性溶液控制二级培养基的 PH 值为 6.70.2， 光密度的 26 倍 0D*26 净值 0.05， 无杂菌或噬菌体污染。 0010 所述的发酵培养基是以下各浓度组份的混合物， 浓度单位是 g/L， 淀粉双酶糖 10030、 酵母粉 145、 KH2。
17、PO451、 硫酸镁 21、 脯氨酸 21， 味精 0.50.1、 玉米浆 805、 链霉素 1.80.1、 消泡剂， 用去离子水配制后灭菌， 例如调节 pH 值为 7.00.5， 压 力 0.10.1Mpa1215灭菌 255min。在发酵培养基中添加 CaCL215g/L3、 脂肪酸 10.1g/L 以及乙酰辅酶 A0.040.02g/L。所述的酵母粉先水解 365 小时 ； 在发酵过程 中通过添加蒸馏水， 维持糖浓度在 2.2 2.5。所述菌株发酵 403 小时后， 加入 5ug/ml 溶菌酶， 发酵 555 小时后， 停止加入溶菌酶。所述的发酵初温 370.5， 发酵开始时的 PH 值。
18、是 7.0， 在发酵过程中通过碱性溶液调节 PH 值维持在 6.0 7.0， 优选的是通氨气控 制 PH 值为 6.7、 通风比 1 ： 1， 4.0 CO2 6.0， 溶氧度 D0 10 ； 发酵 20 小时开始流 加稀释培养基和糖份。培养 8-12 小时、 0D*26 净值 0.05， 无杂菌或噬菌体污染。Ca2+抑 制丙酮酸激酶活性， 脂肪酸和乙酰辅酶 A 也可抑制丙酮酸激酶的活力、 减少丙酮酸的积累， 造成磷酸烯醇式丙酮酸的积累， 磷酸烯醇式丙酮酸是 EMP 途径限速酶磷酸果糖激酶的抑制 剂， 所以磷酸烯醇式丙酮酸的积累降低了磷酸果糖激酶的活性， 从而降低了 EMP 途径的通 量， 缓。
19、解了 EMP 和 TCA 之间的代谢溢流， 同时葡萄糖总通量没有变化， 所以更多的葡萄糖进 入HMP途径合成肌苷， 相应地提高了肌苷的产率和糖苷转化率。 对溶菌酶(细胞壁降解酶) 说 明 书 CN 101348818 B3/4 页 5 有高敏性， 该酶被认为能够使细胞壁合成能力部分丧失， 从而使大量胞内产生的肌苷易于 分泌出细胞， 而且对链霉素有抗性， 从而有效应对发酵时发生的污染。 在细胞外存在积累的 大量溶质时， 细胞内脯氨酸对渗透压调节起重要作用。 因此增加细胞内脯氨酸浓度， 能够更 有效地排出渗透压的作用。 0011 上述各种培养基以及溶菌酶都是分批量加入到相应的器皿中， 最后在发酵培。
20、养基 中收集提取肌苷。在整个发酵过程的不同时期， 糖苷转化率较对照提高 10-30， 肌苷产率 达到 54g5/L。 具体实施方式 0012 本发明的主旨是通过采用二级种发酵工艺， 提高糖苷转化率， 最终使肌苷产率达 到 545g/L。以下的实施例是以举例来进一步说明本发明， 因此， 不应该构成对本发明 范围的限制。特别是实施条件的选择并不导致肌苷产率的实质性差异， 仅属因地因事而 异的区别， 故下述实施例并非对本发明内容的穷举和限定 ： 首先， 一种肌苷的生产方法， 步 骤为 ： A、 一级种培养 ： 将菌株放在一级培养基中培养， 培养温度为 30 32、 旋转式摇床 22020rpm、 培。
21、养时间 10-15 小时， 得增值菌株 ； B、 二级种培养 ： 将步骤 A 所得的增值菌株 再放到二级培养基中， 培养温度为 350.5、 培养时间 8-12 小时， 得放大菌株 ； C、 菌株发 酵 ： 将步骤 B 所得的放大菌株放到发酵培养基中， 讲行发酵。 0013 实施例 0014 采用的菌株为枯草芽孢杆菌， 将 50ml 菌液接种至摇瓶中的一级种培养基， 摇瓶在 220 转 / 分， 温度 32、 PH7.2、 培养 10-15 小时， 得增值菌株 ； 光密度的 26 倍 0D*26 净值 0.04， 菌体分裂良好， 无杂菌或噬菌体污染。再将所得的增值菌株再放到二级培养基中， 培养。
22、温度为 350.5、 培养时间 8-12 小时， 得放大菌株， 且通氨气控制 PH 值是 6.7， 通风 比 1 ： 1， 培养 8-12 小时 ； 0D*26 净值 0.05， 无杂菌或噬菌体污染。 0015 所述的一级种培养基是以下各浓度组份的混合物， 各组分的浓度单位是 g/L， 淀粉 双酶糖 30， 酵母粉 26， KH2PO44， 硫酸铵 10， 硫酸镁 1， CaCO310， 尿素 5， 玉米浆 60， 酵母膏 14， 蛋白胨 10， NaCL1， 腺嘌呤 1.2， 鸟嘌呤 1.2， 去离子水配制， NaOH 调 pH7.0， 121 25min( 尿 素， 分消 118 20mi。
23、n) 0016 所述的二级种培养基是以下各浓度组份的混合物， 各组分的浓度单位是 g/L， 淀粉 双酶糖 50， 酵母粉 26， KH2PO44， 硫酸铵 10， 硫酸镁 1， CaCO310， 尿素 5， 玉米浆 60， 酵母膏 14， NaCL1， 腺嘌呤 1.2， 鸟嘌呤 1.2， 链霉素 1.8， 去离子水配制， NaOH 调 pH7.0， 121 25min( 尿 素， 分消 118 20min) 0017 在调配相应的培养基之前， 先将酵母粉水解 30h， 使其能尽快被菌体吸收利用， 采 用低糖培养， 在整个发酵过程中一直维持低糖浓度， 约 2.2 2.5。发酵 20h 后开始流加。
24、 糖份， 以保持整个发酵液的糖浓度。溶菌酶 5ug/ml 于发酵 40h 后随培养基流加。 0018 50L 罐发酵控制 ： 容接种量 10， 即放大菌株占发酵发酵培养基基的体积是 10。 移种后定容 35L， 即放大菌株与发酵培养基的总体积是 35L。温度控制 370.5， 开始 时， 控制 PH 值 7.0。发酵过程中， 通氨气控制 PH 值是 6.0-7.0， 最大通风比 1 ： 1， 4.0 C02 6.0， 氧溶量 DO 10 ； 发酵 20 小时开始流加稀释培养基和糖份， 溶菌酶 5ug/ ml 于发酵 40h 后随培养基流加， 发酵 55h 后停止流加， 60h 时放罐， 这时的。
25、发酵液澄清， 镜检 说 明 书 CN 101348818 B4/4 页 6 菌体完整， 发酵液经离心后取上清。检测肌苷含量为 48g/L。 0019 所述的发酵培养基是以下各浓度组份的混合物， 各组分的浓度单位是 g/L， 淀粉双 酶糖 100， 酵母粉 14， KH2PO45， 硫酸镁 2， 脯氨酸 2， 味精 0.5， 玉米浆 80， 脂肪酸 1、 CaCL215 和 乙酰辅酶 A0.04， 链霉素 1.8， 消泡剂， 等。自来水配制， NaOH 调 pH7.0， 121灭菌 30min 0020 通过在发酵培养基中添加脂肪酸、 CaCL2和乙酰辅酶 A， 使其在培养基中的浓度分 别为 1。
26、g/L、 15g/L 和 0.04g/L， 摇瓶培养方法， 37。使糖苷转化率和肌苷转化率大大提高。 0021 以下列表数据是发酵培养基中添加上述浓度脂肪酸、 CaCL2和乙酰辅酶A与不添加 这几种组份时， 糖苷转化率与肌苷产率 g/L 实验结果， 如表 1。添加上述浓度脂肪酸、 CaCL2 和乙酰辅酶 A 对发酵过程糖代谢关键酶比活 (U/mg 蛋白 ) 测定， 测定结果如表 2 0022 表 1 0023 0024 表 2 0025 时间 ( 小时 )1224364860 丙氨酸脱氢酶 (U/mg) 1.81.41.61.11.0 丙酮酸激酶 (U/mg)2.01.41.71.31.2 磷酸果糖激酶 (U/mg) 510111210 葡萄糖激酶 (U/mg)7466.58 柠檬酸合成酶 (U/mg) 12.72.82.62.7 6- 磷酸葡萄糖脱氢酶 (U/mg) 1.41.61.41.31.1 说 明 书 。