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1、(10)授权公告号 CN 101182563 B (45)授权公告日 2011.06.22 CN 101182563 B *CN101182563B* (21)申请号 200710134999.9 (22)申请日 2007.11.02 C12P 19/12(2006.01) A23L 1/30(2006.01) A61K 31/7016(2006.01) A61P 1/10(2006.01) A61P 1/16(2006.01) (73)专利权人 江南大学 地址 214028 江苏省无锡市新区新华路 94 号江南大学国家大学科技园 (72)发明人 杨瑞金 刘芳 (74)专利代理机构 无锡市大为。
2、专利商标事务所 32104 代理人 时旭丹 刘品超 CN 1324956 A,2001.12.05, 全文 . CN 1057485 A,1992.01.01, 全文 . CN 1210863 A,1999.03.17, 全文 . 高新 . 乳糖异构化制备乳果糖的研究 .食 品科学 .2006, 第 27 卷 ( 第 1 期 ),130-134. (54) 发明名称 一种用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备 乳果糖的方法 (57) 摘要 一种用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备 乳果糖的方法， 属于食品生物技术领域。 本发明是 利用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶为催化剂， 以乳糖为单一底物， 在温和。
3、的反应条件下转化乳 糖制备乳果糖。本发明的独特之处是以乳糖作为 底物， 在反应过程中利用乳糖酶和葡萄糖异构酶 的协同作用， 提高制备乳果糖的反应效率， 减少副 产物， 简化下游分离步骤。本发明思路新颖， 环境 友好， 实用性强， 是化学法和游离酶法制备乳果糖 的良好替代。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 岳礼溪 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 CN 101182563 B1/1 页 2 1. 一种用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的方法， 其特征是用共固定化乳 糖酶和葡萄糖异构酶为催化剂， 以乳糖。
4、为单一底物制备乳果糖 ； (A) 共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶作为催化剂的间歇式乳糖转化反应 ： 用 pH4-9 的磷酸盐缓冲液配制 5 -40 (w/w) 的乳糖溶液， 稍加热使乳糖溶解， 添加 1.5-10U/mL 的共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶， 在 25-60温度下反应 12-48h， 并回收共 固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶 ； 或 (B) 共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶作为催化剂的连续式乳糖转化反应 ： 用 pH4-9 的磷酸盐缓冲液配制 5 -40 (w/w) 的乳糖溶液， 稍加热使乳糖溶解， 自上 而下进料反应， 按 0.02-0.3mL/min 的流速使乳糖溶液匀速通过装载共固定化。
5、乳糖酶和葡 萄糖异构酶的恒温酶反应柱， 温度为 25-55， 单程操作。 2. 根据权利要求 1 所述的一种用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的方法， 其特征是连续式反应中使用恒温酶反应柱。 权 利 要 求 书 CN 101182563 B1/3 页 3 一种用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的方法， 具体涉及 以共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶为催化剂， 以乳糖为单一底物， 在温和的反应条件下制 备乳果糖， 属于食品生物技术领域。 背景技术 0002 乳果糖是一种由半乳糖和果糖以 -1， 4 糖苷键结合。
6、而成的新型功能性低聚糖。 它具有促进双歧杆菌增殖， 调整肠道菌群平衡 ； 治疗肝性脑病， 降低内毒素 ； 监视肠壁的通 透性 ； 预防结肠息肉术后复发等许多重要的生理功能， 被广泛应用于便秘、 肝性脑病等临床 治疗， 以及添加到奶粉、 面包、 婴儿食品、 和饮料等中。 目前市面上已有出售治疗慢性功能性 便秘和肝性脑病的乳果糖口服溶液， 但纯度很低。 0003 工业上生产乳果糖主要采用化学催化法进行， 即以 NaOH 和硼酸为催化剂， 通过乳 糖异构化反应获得。曾研究过的催化剂有强碱性试剂、 镁的化合物、 碱金属的铝酸盐、 蛋壳 等， 但化学法制备乳果糖条件比较激烈， 得到的产品色泽深， 副产物。
7、多， 催化剂分离困难， 给 糖浆的进一步纯化及制取结晶带来困难。采用游离酶法生产乳果糖尽管催化剂专一性强、 副产物少、 产品色泽浅， 但酶的成本较高。因此寻找一种酶可以反复回收利用， 反应条件温 和的高效率制备乳果糖的途径是很有意义的。 发明内容 0004 本发明原理 ： 在一定的条件下， 以乳糖为底物， 通过乳糖酶水解活力的作用， 使乳 糖水解为葡萄糖和半乳糖， 再通过葡萄糖异构酶作用葡萄糖将其异构化为果糖， 最后通过 乳糖酶的转半乳糖苷作用， 将半乳糖通过 -1， 4 糖苷键连接到果糖上， 得到产物乳果糖。 0005 本发明的目的 ： 提供一种用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶作为催化剂， 在。
8、温和 的反应条件下制备乳果糖的方法。 通过对共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的工 艺条件进行研究， 以期得到一条在反应过程中能够发挥乳糖酶和葡萄糖异构酶之间的协同 作用， 催化效率高， 副反应少， 乳果糖产品质量较好的生产工艺。 0006 本发明的技术方案 ： 一种用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的方法， 用共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶为催化剂， 以乳糖为单一底物制备乳果糖 ； 0007 (A) 共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶作为催化剂的间歇式乳糖转化反应 ： 0008 用 pH4-9 的磷酸盐缓冲液配制 5 -40 (w/w) 的乳糖溶液， 稍加热使乳糖溶解， 添加 1.5-10。
9、U/mL 的共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶， 在 25-60温度下反应 12-48h， 并回 收共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶 ； 0009 或 (B) 共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶作为催化剂的连续式乳糖转化反应 ： 0010 用 pH4-9 的磷酸盐缓冲液配制 5 -40 (w/w) 的乳糖溶液， 稍加热使乳糖溶解， 自上而下进料反应， 按 0.02-0.3mL/min 的流速使乳糖溶液匀速通过装载共固定化乳糖酶 和葡萄糖异构酶的恒温酶反应柱， 温度为 25-70， 单程操作。 说 明 书 CN 101182563 B2/3 页 4 0011 所用的共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶的共固定化方法， 。
10、是以明胶、 海藻酸钠或 卡拉胶中的一种或几种为载体， 采用先包埋后交联的方法进行构建共固定化乳糖酶和葡萄 糖异构酶 ； 或以尼龙网为载体采用先交联后共价结合的方法进行构建共固定化乳糖酶和葡 萄糖异构酶 ； 0012 (1) 用明胶、 海藻酸钠或卡拉胶中的一种或几种为载体， 采用先包埋后交联的方法 进行构建共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶 ： 0013 a)配制pH4-9的质量浓度5-27的20g胶溶液， 在30水浴中使胶完全溶解 ； 0014 b) 按照活力比 2 1-1 5 将乳糖酶和葡萄糖异构酶溶于 2mL 去离子水中 ； 0015 c) 将 b) 配制的乳糖酶和葡萄糖异构酶的混合酶液添加到胶。
11、溶液中， 使两种酶的 添加量为 1-30U/g 胶溶液， 搅拌混匀 ； 0016 d) 在 c) 所得的胶溶液中加入 2mL 体积分数 0.05 -5的戊二醛， 搅拌后立即倒 入培养皿中， 4硬化过夜， 得凝胶 ； 0017 e) 次日将凝胶浸入到体积分数 0.05 -5的戊二醛中， 在 4 -30交联 10min-60min， 然后用去离子水清洗凝胶若干次， 滤纸吸干表面水， 最后切成 2mm 见方的小 方块， 即为共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶。 0018 或 (2) 采用尼龙网为载体共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶 ： 0019 a) 尼龙网的预处理 ： 将 60 目的尼龙网裁成边长 2cm 。
12、的小片， 先用 1mol/LNaOH 浸 洗 10min， 水洗至中性， 再用 1mol/L HCl 浸洗 10min， 再水洗至中性， 然后用乙醇洗去水分， 丙酮浸洗 20min 除去脂溶性杂质， 再用乙醇除去丙酮， 晾干， 接着将尼龙网浸泡在含 18.6 CaCl2和 18.6水的甲醇溶液中， 50保温 20min， 将尼龙网滤出并彻底水洗， 乙醇脱水， 晾 干 ； 0020 b) 尼龙网的活化 ： 将预处理后的尼龙网浸入到 3- 二甲氨基丙胺中， 70活化 5h-15h， 彻底水洗 ； 0021 c)载体的交联 ： 将活化后的尼龙网浸入体积分数0.05-5、 pH4-9的戊二醛中， 4 。
13、-30浸泡 10min-60min， 接着用 pH 7 的磷酸盐缓冲液反复清洗尼龙网 ； 0022 d) 酶与载体的结合 ： 配制浓度为 1-30U/mL 的乳糖酶溶液， 按照 5g/100mL 酶 液 -30g/100mL 酶液的量将尼龙网添加到乳糖酶液中， 4 -30下不断搅拌浸泡 5-20h， 滤 出尼龙网， 水洗至水洗液中无蛋白之后再将尼龙网浸泡到 1-30U/mL 的葡萄糖异构酶溶液 中， 尼龙网的添加量在 5g/100mL 酶液 -30g/100mL 酶液之间， 4 -30不停缓慢搅拌浸泡 5-20h， 最后用去离子水多次清洗尼龙网表面至水洗液中无蛋白， 用冷风吹干即得共固定化 乳。
14、糖酶和葡萄糖异构酶。 0023 所用的游离乳糖酶的比活力为3000U/g， 游离葡萄糖异构酶的比活力为2000U/g。 0024 共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的连续式反应中使用恒温酶反应柱。 0025 所制备的乳果糖在食品添加剂和医药领域中均有广泛应用。 0026 本发明所述的间歇式乳糖转化反应， 具体内容涉及以明胶、 海藻酸钠或 / 和卡拉 胶为载体。 0027 本发明所述的连续式乳糖转化反应， 具体内容涉及以尼龙网为载体。 0028 本发明的有益效果 ： 0029 1、 与目前的化学催化法制备乳果糖相比， 酶法生产乳果糖反应条件温和， 催化剂 说 明 书 CN 101182563。
15、 B3/3 页 5 专一性强， 产品色泽浅， 对设备没有较大损耗， 且不产生高碱性废水， 不会对环境造成污染。 0030 2、 与液态酶相比， 共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶能够回收利用， 使生产过程中 酶的成本大大下降， 简化反应产物的提纯， 提高产物乳果糖的收率。 0031 3、 与单独固定化一种酶相比， 共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶在制备乳果糖的过 程中更能发挥两种酶之间的协同作用， 实现底物到产物的一步转化， 转化效率高， 副产物 少。 附图说明 0032 图 1 不同温度对共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的影响。 0033 图 2 不同 pH 对共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳。
16、果糖的影响。 0034 图 3 不同乳糖浓度对共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的影响。 0035 图 4 不同反应时间对共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的影响。 具体实施方式 0036 实施例 1 ： 配制 20mL 乳糖溶液， 稍加热使乳糖溶解， 添加 100U 共固定化乳糖酶和 葡萄糖异构酶进行间歇式反应， 在一定温度、 pH 和时间下反应， 反应结束后回收共固定化酶 凝胶颗粒。 0037 图1显示了温度分别为25、 30、 35、 40、 45、 50和55对共固定化乳糖 酶和葡萄糖异构酶制备乳果糖的影响。如图所示， 最适温度为 45。 0038 图 2 显示了 pH 分别为。
17、 4、 5、 6、 7.5、 8 和 9 对共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶制备 乳果糖的影响。如图所示， 最适 pH 为 7.5。 0039 图 3 显示了乳糖浓度分别为 10、 20、 30和 40对共固定化乳糖酶和葡萄糖 异构酶制备乳果糖的影响。如图所示， 最适乳糖浓度为 40。 0040 图 4 显示了反应时间分别为 6h、 10h、 15h、 24h、 36h 和 48h 对共固定化乳糖酶和葡 萄糖异构酶制备乳果糖的影响。如图所示， 最适反应时间为 24h。 0041 实施例 2 ： 先将自由状态的乳糖酶和葡萄糖异构酶经 60 目的尼龙网固定， 再制 成固定化酶柱。所使用的恒温酶反应柱直径 26mm， 高 200mm。共固定化酶的装柱体积为 40mL， 总活力为2580U。 将乳糖配成30(w/w)的溶液， 调节pH 7， 自上而下进料反应， 恒温 501， 按 0.06mL/min 匀速通过共固定化酶反应柱， 单程操作并收集反应液， 得到产物乳 果糖溶液。 说 明 书 CN 101182563 B1/2 页 6 说 明 书 附 图 CN 101182563 B2/2 页 7 说 明 书 附 图 。