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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810955224.6 (22)申请日 2018.08.21 (71)申请人 苏州米苏生物技术有限公司 地址 215000 江苏省苏州市吴中经济开发 区田上江路105号3幢 (72)发明人 吴建勇易小萍滕小锘张大鹤 (74)专利代理机构 南京利丰知识产权代理事务 所(特殊普通合伙) 32256 代理人 王锋 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) (54)发明名称 免疫细胞培养基与其应用 (57)摘要 本发明公开了一种免疫细胞培养基， 其包含 无水氯化。
2、钙等多种无机盐、 L-亮氨酸等多种氨基 酸、 白介素2、 白介素4等组分。 本发明的免疫细胞 培养基在培养CAR-T细胞时， 能够显著提高细胞 的增殖倍数， 大幅延长细胞培养天数， 并能够有 效的保持表达表面标志物， 同时其还具有保质期 长， 易于制备等优点。 权利要求书2页 说明书7页 附图1页 CN 108949696 A 2018.12.07 CN 108949696 A 1.一种免疫细胞培养基， 其特征在于包括： 无水氯化钙112.5mg/L115.8mg/L、 L-亮氨 酸57.85mg/L58.95mg/L、 五水硫酸铜0.0011mg/L0.0012mg/L、 L-赖氨酸盐酸盐 。
3、92.20mg/L93.25mg/L、 硫辛酸0.101mg/L0.108mg/L、 九水硝酸铁0.04mg/L0.05mg/L、 L-蛋氨酸16.98mg/L17.28mg/L、 酚红7.8mg/L8.3mg/L、 七水硫酸亚铁0.410mg/L 0.418mg/L、 L-苯丙氨酸35.42mg/L36.55mg/L、 1,4-丁二胺二盐酸盐0.078mg/L 0.080mg/L、 氯化钾310.5mg/L311.3mg/L、 L-丝氨酸26.55mg/L27.15mg/L、 丙酮酸钠 52mg/L58mg/L、 氯化镁28.61mg/L28.38mg/L、 L-苏氨酸53.41mg/L53。
4、.49mg/L、 维生素 H 0.0025mg/L0.0045mg/L、 无水硫酸镁48.55mg/L49.54mg/L、 L-丙氨酸4.35mg/L 4.55mg/L、 乙醇胺500.0mg/L2000.0mg/L、 D-泛酸钙2.21mg/L2.26mg/L、 氯化钠 6950.5mg/L7120.5mg/L、 L-天门冬酰胺7.4mg/L8.5mg/L、 氯化胆碱8.88mg/L9.18mg/ L、 转铁蛋白40180mg/L、 无水磷酸二氢钠54.15mg/L54.55mg/L、 .利托那韦200.0nmol/L 1000.0nmol/L、 L-天门冬氨酸6.25mg/L6.75mg/。
5、L、 叶酸2.45mg/L2.65mg/L、 油酸 100.0mg/L1500.0mg/L、 磷酸氢二钠70.52mg/L73.22mg/L、 L-半胱氨酸盐酸盐16.98mg/ L17.65mg/L、 白介素410mg/L80mg/L、 i-肌醇12.2mg/L12.7mg/L、 人血清白蛋白 500.0mg/L3000.0mg/L、 庆大霉素11035106U/L、 七水硫酸锌56.431mg/L 210.433mg/L、 重组人胰岛素0.5mg/L5mg/L、 L-谷氨酸7.25mg/L7.55mg/L、 抗坏血酸 25.0mg/L150.0mg/L、 烟酰胺1.96mg/L2.0mg/。
6、L、 L-精氨酸盐酸盐145.5mg/L148.5mg/ L、 L-脯氨酸17.15mg/L17.25mg/L、 IL-77 g/L9 g/L、 IL-153 g/L5 g/L、 亚油酸 100.0mg/L1200.0mg/L、 盐酸吡哆醛1mg/L2mg/L、 孕酮8mg/L60mg/L、 L-胱氨酸盐酸盐 30.19mg/L32.29mg/L、 L-色氨酸8.72mg/L9.22mg/L、 人过氧化氢酶200.0mg/L 2200.0mg/L、 盐酸吡哆醇0.028mg/L0.035mg/L、 蛋氨酸脑啡肽385mg/L425mg/L、 干细胞 生长因子5mg/L40mg/L、 L-酪氨酸。
7、38.2mg/L39.4mg/L、 核黄素0.213mg/L0.219mg/L、 甘氨酸18.35mg/L19.25mg/L、 L-缬氨酸52.45mg/L53.65mg/L、 白介素21770mg/L、 盐 酸硫胺2.12mg/L2.18mg/L、 维生素C 0.55mg/L、 L-组氨酸盐酸盐31.23mg/L32.48mg/ L、 D-葡萄糖3110mg/L3165mg/L、 胸苷0.312mg/L0.386mg/L、 L-异亮氨酸54.21mg/L 54.83mg/L、 次黄嘌呤1mg/L3mg/L、 维生素B120.61mg/L0.72mg/L、 NaHCO33.0mmol/L 29。
8、mmol/L。 2.权利要求1所述的免疫细胞培养基在CAR-T细胞培养中的应用。 3.如权利要求2所述的应用， 其特征在于： 所述CAR-T细胞选自CD19-CAR-T、 CD20-CAR- T、 K轻链-CAR-T、 CD22-CAR-T、 CD23-CAR-T、 CD30-CAR-T或CD70-CAR-T。 4.一种CAR-T细胞培养方法， 其特征在于包括： 采用如权利要求1所述的免疫细胞培养 基培养CAR-T细胞。 5.根据权利要求6所述的培养方法， 其特征在于包括： 将CAR-T细胞和CD3单克隆抗体加 入所述的免疫细胞培养基中， 调整细胞密度， 进行细胞培养， 培养72h后补加所述培。
9、养基和 所述CD3单克隆抗体， 之后继续培养4天以上， 每隔23天补充所述免疫细胞培养基。 6.根据权利要求5所述的培养方法， 其特征在于， 所述细胞密度为(110)106cell/ mL。 7.根据权利要求5所述的培养方法， 其特征在于， 所述细胞培养的条件为5CO2、 37。 8.根据权利要求5所述的培养方法， 其特征在于， 所述CD3单克隆抗体的浓度为20 权利要求书 1/2 页 2 CN 108949696 A 2 50ng/mL。 权利要求书 2/2 页 3 CN 108949696 A 3 免疫细胞培养基与其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种免疫细胞培养基与其在培养CAR-T。
10、细胞中的应用， 属于生物医疗 技术领域。 背景技术 0002 以嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor， CAR)修饰的T细胞为代表的肿瘤靶 向免疫治疗在体外和临床试验中表现出良好的靶向性、 杀伤性和持久性， 展示了巨大的应 用潜力和发展前景。 CAR-T细胞治疗的原理在于经嵌合抗原受体修饰的T细胞， 可以特异性 地识别肿瘤相关抗原， 使效应T细胞的靶向性、 杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞 高， 并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境并打破宿主免疫耐受状态， 即表达CAR的T细胞以抗 原依赖、 非MHC限制的方式结合肿瘤抗原， 启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。 0003 C。
11、AR-T细胞治疗的一个重要环节是进行CAR-T细胞的扩增， 而此环节中的一个非常 关键的因素是选择有效的培养基。 0004 迄今， 有众多厂家发展了多种免疫细胞培养基， 例如， 如X-VIVO(Lonza出品)， KBM- 551K、 KBM-581、 LONZA X-VIVO 15培养基(康宁出品)等。 这些培养基产品目前已经被广泛的 使用。 但是， 这些培养基都含有动物源成分， 例如胎牛血清， 这些动物源成分系从动物血清 或组织中分离纯化出， 可能含有动物病原体， 因此有引起疾病的危险。 0005 尽管如Gibco公司的AIM-V、 Sigma公司的Stemline、 Takara公司的G。
12、T-T551H3、 Miltenyi公司的TexMACS等产品均声称是无血清培养基， 但其在使用时， 若非添加血清成 分， 则淋巴细胞的增殖较为缓慢， 难以满足临床细胞治疗所需要的细胞数量。 0006 此外， 现有的免疫细胞培养基还存在保质期较短的缺陷， 在培养CAR-T细胞的周期 内， 会在后期导致细胞增殖效率急剧下滑的问题。 发明内容 0007 本发明的主要目的在于提供一种免疫细胞培养基与其应用， 以克服现有技术中的 不足。 0008 为实现前述发明目的， 本发明采用的技术方案包括： 0009 本发明实施例提供了一种免疫细胞培养基， 其包括： 无水氯化钙112.5mg/L 115.8mg/。
13、L、 L-亮氨酸57.85mg/L58.95mg/L、 五水硫酸铜0.0011mg/L0.0012mg/L、 L-赖 氨酸盐酸盐92.20mg/L93.25mg/L、 硫辛酸0.101mg/L0.108mg/L、 九水硝酸铁0.04mg/L 0.05mg/L、 L-蛋氨酸16.98mg/L17.28mg/L、 酚红7.8mg/L8.3mg/L、 七水硫酸亚铁 0.410mg/L0.418mg/L、 L-苯丙氨酸35.42mg/L36.55mg/L、 1,4-丁二胺二盐酸盐 0.078mg/L0.080mg/L、 氯化钾310.5mg/L311.3mg/L、 L-丝氨酸26.55mg/L27.1。
14、5mg/L、 丙酮酸钠52mg/L58mg/L、 氯化镁28.61mg/L28.38mg/L、 L-苏氨酸53.41mg/L53.49mg/ L、 维生素H 0.0025mg/L0.0045mg/L、 无水硫酸镁48.55mg/L49.54mg/L、 L-丙氨酸 4.35mg/L4.55mg/L、 乙醇胺500.0mg/L2000.0mg/L、 D-泛酸钙2.21mg/L2.26mg/L、 氯 说明书 1/7 页 4 CN 108949696 A 4 化钠6950.5mg/L7120.5mg/L、 L-天门冬酰胺7.4mg/L8.5mg/L、 氯化胆碱8.88mg/L 9.18mg/L、 转铁。
15、蛋白40180mg/L、 无水磷酸二氢钠54.15mg/L54.55mg/L、 .利托那韦 200.0nmol/L1000.0nmol/L、 L-天门冬氨酸6.25mg/L6.75mg/L、 叶酸2.45mg/L 2.65mg/L、 油酸100.0mg/L1500.0mg/L、 磷酸氢二钠70.52mg/L73.22mg/L、 L-半胱氨酸 盐酸盐16.98mg/L17.65mg/L、 白介素410mg/L80mg/L、 i-肌醇12.2mg/L12.7mg/L、 人 血清白蛋白500.0mg/L3000.0mg/L、 庆大霉素11035106U/L、 七水硫酸锌56.431mg/L 210.。
16、433mg/L、 重组人胰岛素0.5mg/L5mg/L、 L-谷氨酸7.25mg/L7.55mg/L、 抗坏血酸 25.0mg/L150.0mg/L、 烟酰胺1.96mg/L2.0mg/L、 L-精氨酸盐酸盐145.5mg/L148.5mg/ L、 L-脯氨酸17.15mg/L17.25mg/L、 IL-77 g/L9 g/L、 IL-153 g/L5 g/L、 亚油酸 100.0mg/L1200.0mg/L、 盐酸吡哆醛1mg/L2mg/L、 孕酮8mg/L60mg/L、 L-胱氨酸盐酸盐 30.19mg/L32.29mg/L、 L-色氨酸8.72mg/L9.22mg/L、 人过氧化氢酶20。
17、0.0mg/L 2200.0mg/L、 盐酸吡哆醇0.028mg/L0.035mg/L、 蛋氨酸脑啡肽385mg/L425mg/L、 干细胞 生长因子5mg/L40mg/L、 L-酪氨酸38.2mg/L39.4mg/L、 核黄素0.213mg/L0.219mg/L、 甘氨酸18.35mg/L19.25mg/L、 L-缬氨酸52.45mg/L53.65mg/L、 白介素21770mg/L、 盐 酸硫胺2.12mg/L2.18mg/L、 维生素C 0.55mg/L、 L-组氨酸盐酸盐31.23mg/L32.48mg/ L、 D-葡萄糖3110mg/L3165mg/L、 胸苷0.312mg/L0.3。
18、86mg/L、 L-异亮氨酸54.21mg/L 54.83mg/L、 次黄嘌呤1mg/L3mg/L、 维生素B120.61mg/L0.72mg/L、 NaHCO33.0mmol/L 29mmol/L。 0010 本发明实施例还提供了所述的免疫细胞培养基在CAR-T细胞培养中的应用。 0011 进一步地， 所述CAR-T细胞选自CD19-CAR-T、 CD20-CAR-T、 K轻链-CAR-T、 CD22-CAR- T、 CD23-CAR-T、 CD30-CAR-T或CD70-CAR-T。 0012 本发明实施例还提供了一种CAR-T细胞培养方法， 其包括： 采用所述的免疫细胞培 养基培养CAR。
19、-T细胞。 0013 进一步地， 所述的培养方法包括： 将CAR-T细胞和CD3单克隆抗体加入所述的免疫 细胞培养基中， 调整细胞密度， 进行细胞培养， 培养72h后补加所述培养基和所述CD3单克隆 抗体， 之后继续培养4天以上， 每隔23天补充所述免疫细胞培养基。 0014 进一步地， 所述细胞密度为(110)106cell/mL。 0015 进一步地， 所述细胞培养的条件为5CO2、 37。 0016 进一步地， 所述CD3单克隆抗体的浓度为2050ng/mL。 0017 较之现有技术， 本发明的免疫细胞培养基在培养CAR-T细胞时， 能够显著提高细胞 的增殖倍数， 大幅延长细胞培养天数，。
20、 并能够有效的保持表达表面标志物， 同时其还具有保 质期长， 易于制备等优点。 附图说明 0018 图1是分别采用本发明实施例1-实施例5、 对照例1-对照例2的培养基进行免疫细 胞培养的细胞增殖曲线图。 具体实施方式 0019 鉴于现有技术存在的诸多缺陷， 本案发明人经长期研究和大量实践， 得以提出本 说明书 2/7 页 5 CN 108949696 A 5 发明的技术方案， 其主要涉及一种改进的免疫细胞培养基及其在培养CAR-T细胞中的应用。 0020 若非特殊说明， 本说明书中所涉及的技术术语的释义与本领域的常规释义相同， 例如： 0021 嵌合抗原受体(CAR)： 是CAR-T的核心部。
21、件， 赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤 抗原的能力， 这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的 目标。 CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen， TAA)结合区 (通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)， 一个胞外铰链区， 一个跨膜区和一个胞 内信号区。 目标抗原的选择对于CAR的特异性、 有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来 讲都是关键的决定因素。 0022 CAR-T细胞： 嵌合抗原受体T细胞。 0023 CD19-CAR-T： 靶向CD19分子的嵌合体抗原受体基因修饰的T细胞。 0024 C。
22、D3： 在免疫学中， CD3(分化簇3)T细胞的共受体是一种蛋白质复合物。 在哺乳动物 中， 该复合物含有一个CD3链， CD3 链， 和2CD3 链。 这些链具有被称为一个分子副T细胞受 体(TCR)和 -链以产生激活信号的T淋巴细胞。 该TCR， 链和CD3分子一起构成的T细胞受体 复合物。 本发明的免疫细胞培养基中各原料均应是符合美国药典或 国家标准化学试剂 或 中华人民共和国药典 2010年版第二部的超纯或分析纯试剂， 以满足临床安全合理的要 求。 0025 本发明的免疫细胞培养基不含任何动物源成份， 其中的生物来源成分均为药物级 或高度纯化的人源物质， 因此安全性是有保证的。 002。
23、6 本说明书中述及的免疫细胞培养基中各组分及细胞培养方法中所使用的细胞、 原 料均可由市场购得。 0027 以下结合若干实施例对本发明的技术方案作更为具体的说明。 0028 实施例1-实施例5的免疫细胞培养基的组分详见下表： 说明书 3/7 页 6 CN 108949696 A 6 0029 说明书 4/7 页 7 CN 108949696 A 7 0030 说明书 5/7 页 8 CN 108949696 A 8 0031 0032 前述实施例1-实施例5中各免疫细胞培养基的制备方法包括： 将上述培养基各组 分与高纯灭菌水按比例混合， 4震荡混匀1小时， 然后通过0.22 m的滤膜过滤除菌待。
24、用。 0033 采用实施例1-实施例5的免疫细胞培养基进行细胞培养， 过程如下： 将市购的表达 嵌合抗原受体CD19CAR的T细胞用实施例1-实施例5的培养基重悬， 同时加入30ng/mL的CD3 单抗， 调整接种密度1106cell/mL， 放入5CO2， 37培养箱中培养。 培养72小时后按照5 105cell/mL的密度补加实施例1-实施例5的培养基， 同时补加30ng/mL的CD3单抗。 之后每 2-3天补充该培养基一次， 保持细胞密度在5105cell/mL； 之后， 计算细胞的增殖曲线， 并 取培养到7天和21天的细胞进行流式检测。 0034 细胞检测具体为： 将收集到的细胞用PB。
25、S清洗2遍， 通过流式仪检测其表面标志物 CD4+， CD8+， 以及CD19CAR的表达率。 0035 另， 分别采用X-VIVO、 KBM-581培养基替代实施例1-实施例5的培养基， 按照相同方 式进行细胞培养， 并采用相同方式进行测试， 作为对比例1、 2。 0036 测试结果： 0037 1、 测得的细胞增殖曲线详见下图1。 其中实施例1-5相应的曲线为命名为 “实施例” 的曲线(所用数据为平均测试数据)， 对比例1、 2相应曲线命名为 “对比例1” 、“对比例2” 。 0038 2、 流式检测结果： 0039 说明书 6/7 页 9 CN 108949696 A 9 0040 00。
26、41 备注： 上表中 “实施例” 相关数据为实施例1-实施例5所得数据的平均值。 0042 显然， 本发明实施例的免疫细胞培养基至少具有如下优点： 能够大幅提高多种免 疫细胞的增殖倍数， 并可延长细胞培养天数， 培养天数能够达到21天以上， 且能非常好的保 持表达CD4+、 CD8+、 CD19CAR等表面标志物。 0043 应当理解， 以上所述仅为本发明的实施例， 并非因此限制本发明的专利范围， 凡是 利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换， 或直接或间接运用在其他 相关的技术领域， 均同理包括在本发明的专利保护范围内。 说明书 7/7 页 10 CN 108949696 A 10 图1 说明书附图 1/1 页 11 CN 108949696 A 11 。