一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂及应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810952488.6 (22)申请日 2018.08.21 (83)生物保藏信息 CGMCC NO:15611 2018.04.12 (71)申请人 山东省花生研究所 地址 266600 山东省青岛市莱西市望城路 64号 (72)发明人 王明清孙杰张初署于丽娜 毕洁杨庆利刘宾赵善仓 江晨 (74)专利代理机构 北京天奇智新知识产权代理 有限公司 11340 代理人 贾文健 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12P 1/04(2006.01) 。

2、A23L 5/20(2016.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂及应用 (57)摘要 本发明公开了一种降解黄曲霉毒素的微生 物制剂及应用， 属于黄曲霉毒素脱毒技术领域。 本发明降解黄曲霉毒素的微生物制剂的有效成 分为暹罗芽孢杆菌菌悬液或暹罗芽孢杆菌全培 养液培养物或暹罗芽孢杆菌的粗提物或暹罗芽 孢杆菌的胞外代谢物； 所述暹罗芽孢杆菌为暹罗 芽孢杆菌A2025， 于2018年04月12日保藏于： 中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保 藏编号为CGMCCNO:15611， 地址为： 北京市朝阳 区北辰西路1号院3号， 请求保。

3、藏单位为山东省花 生研究所。 本发明的暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲 霉毒素具有高效的降解作用。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图4页 CN 109161497 A 2019.01.08 CN 109161497 A 1.一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂， 其特征在于： 其有效成分为暹罗芽孢杆菌菌悬 液或暹罗芽孢杆菌全培养液培养物或暹罗芽孢杆菌的粗提物或暹罗芽孢杆菌的胞外代谢 物； 所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)A2025， 于2018年04月12日 保藏于： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC NO:15611，。

4、 地 址为： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 请求保藏单位为山东省花生研究所。 2.根据权利要求1所述降解黄曲霉毒素的微生物制剂， 其特征在于： 暹罗芽孢杆菌 A2025全培养液培养物的制备方法为： 取50 L冻存暹罗芽孢杆菌A2025菌液接种到装有5mL的LB液体培养基试管中， 培养12h 活化菌株， 向100mL LB液体培养基中接入活化的500 L菌液， 在37震荡培养48h， 菌液浓度 为1.6108cfu/mL。 3.根据权利要求1所述降解黄曲霉毒素的微生物制剂， 其特征在于： 暹罗芽孢杆菌 A2025菌悬液的制备方法为： 取10mL的暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物， 菌液浓。

5、度为1.6108cfu/mL， 经10000r/ min离心10min后， 分离得到菌体和上清液， 制备的菌体经无菌水洗涤后离心， 加入无菌水补 齐至10mL， 悬浮菌体获得暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液。 4.根据权利要求1所述降解黄曲霉毒素的微生物制剂， 其特征在于： 暹罗芽孢杆菌 A2025胞外代谢物的制备方法为： 取10mL的暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物， 菌液浓度为1.6108cfu/mL， 经10000r/ min离心10min后， 分离得到菌体和上清液， 上清液即为暹罗芽孢杆菌A2025胞外代谢物。 5.根据权利要求1所述降解黄曲霉毒素的微生物制剂， 其特征在于： 暹罗芽孢。

6、杆菌 A2025粗提物的制备方法为： 暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液经低温超声破碎后， 10000r/min离心10min得到的液体经 0.22 m滤膜过滤制备暹罗芽孢杆菌A2025的粗提物。 6.权利要求15任一项所述降解黄曲霉毒素的微生物制剂在被黄曲霉毒素污染的农 产品或由该农产品进一步加工成的制品脱毒中的应用。 7.一种黄曲霉毒素的脱毒方法， 其特征在于： 将权利要求15任一项所述的微生物制 剂与含有黄曲霉毒素的样品按照5mL/g混合， 于37下孵育72h。 8.根据权利要求7所述黄曲霉毒素的脱毒方法， 其特征在于： 所述微生物制剂的有效成 分为暹罗芽孢杆菌A2025的胞外代谢物。 9.根。

7、据权利要求7或8所述黄曲霉毒素的脱毒方法， 其特征在于： 所述黄曲霉毒素为黄 曲霉毒素B1和/或黄曲霉毒素G1。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109161497 A 2 一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂及应用 技术领域 0001 本发明属于黄曲霉毒素脱毒技术领域， 具体涉及一种降解黄曲霉毒素的微生物制 剂及应用。 背景技术 0002 黄曲霉毒素(Aflatoxin)是一类主要由黄曲霉(Aspergillusflavus)、 寄生曲霉 (A.parasiticus)等真菌产生的次级代谢物。 从分子结构上分析， 该类毒素是由二呋喃环和 香豆素组成的结构类似物。 曲霉毒素具有极强的致畸、 致癌、。

8、 致突变性， 广泛污染花生、 玉 米、 棉籽、 稻谷、 干果、 牛奶等农产品和食品。 我国是花生出口大国， 每年都有出口花生到日 本和欧盟因为黄曲霉毒素超标而导致的退回事件， 是影响我国出口花生的主要问题。 现在 已鉴定出二十多种黄曲霉素素， 其中黄曲霉毒素B1(AFB1)分布范围最广， 并且毒性最强， 1993年AFB1被世界卫生组织癌症研究机构(IARC)归为IA类致癌物。 0003 目前常用的脱除AFB1方法主要是物理法和化学法。 物理法包括有挑拣、 漂洗、 高温 加热、 辐射法、 溶剂萃取等方法， 这些方法或者耗费大量人力物力效率不高， 或者会破坏农 产品的营养成分， 以加热去除为例，。

9、 AFB1的热稳定性较高， 分解温度为在268。 化学法是利 用一些氧化剂、 氢氧化钠等化学试剂与毒素反应造成毒素降低， 但有很大的局限性， 很多试 剂对操作人员的皮肤、 眼睛、 呼吸道造成伤害， 并且化学试剂残留不易去除， 影响农产品和 食品的质量安全。 微生物脱毒法成为近年来的研究热点， 该方法主要是利用细菌、 真菌等微 生物及其代谢产物去除食品中污染的AFB1， 该脱毒法对原料无污染、 具有高度专一性、 同时 避免毒素重新产生， 降解条件温和、 特异性强和脱毒效率高等优点， 因此是一种高效、 安全 的去毒方法。 微生物不同， 脱毒效率明显不同， 很多微生物能去除的AFB1效率低， 需要寻。

10、找 脱毒效率高的菌株。 发明内容 0004 针对现有技术中存在的问题， 本发明的目的在于提供一种降解黄曲霉毒素的微生 物制剂以及使用该微生物制剂对于黄曲霉毒素污染的农产品脱毒的方法。 0005 为了达到上述目的， 本发明的技术方案为： 0006 一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂， 其有效成分为暹罗芽孢杆菌菌悬液或暹罗芽 孢杆菌全培养液培养物或暹罗芽孢杆菌的粗提物或暹罗芽孢杆菌的胞外代谢物； 0007 所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)A2025， 于2018年04月12 日保藏于： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCCNO:1561。

11、1， 地址为： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 请求保藏单位为山东省花生研究所。 0008 在上述方案的基础上， 暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物的制备方法为： 0009 取50 L冻存暹罗芽孢杆菌A2025菌液接种到装有5mL的LB液体培养基试管中， 培养 12h活化菌株， 向100mL LB液体培养基中接入活化的500 L菌液， 在37震荡发酵培养48h， 菌液浓度为1.6108cfu/mL。 说明书 1/7 页 3 CN 109161497 A 3 0010 在上述方案的基础上， 暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液的制备方法为： 0011 取10mL的暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物。

12、， 菌液浓度为1.6108cfu/mL， 经 10000r/min离心10min后， 分离得到菌体和上清液， 制备的菌体经无菌水洗涤后离心， 加入 无菌水补齐至10mL， 悬浮菌体获得暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液。 0012 在上述方案的基础上， 暹罗芽孢杆菌A2025胞外代谢物的制备方法为： 0013 取10mL的暹罗芽孢杆菌A2025全培养液培养物， 菌液浓度为1.6108cfu/mL， 经 10000r/min离心10min后， 分离得到菌体和上清液， 上清液即为暹罗芽孢杆菌A2025胞外代 谢物。 0014 在上述方案的基础上， 暹罗芽孢杆菌A2025粗提物的制备方法为： 0015 暹。

13、罗芽孢杆菌A2025菌悬液经低温超声破碎后， 10000r/min离心10min得到的液体 经0.22 m滤膜过滤制备暹罗芽孢杆菌A2025的粗提物。 0016 上述降解黄曲霉毒素的微生物制剂在被黄曲霉毒素污染的农产品或由该农产品 进一步加工成的制品脱毒中的应用。 0017 一种黄曲霉毒素的脱毒方法， 将上述微生物制剂与含有黄曲霉毒素的样品按照 5mL/g混合， 于37下孵育72h。 0018 在上述方案的基础上， 所述微生物制剂的有效成分为暹罗芽孢杆菌A2025的胞外 代谢物。 0019 在上述方案的基础上， 所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1和/或黄曲霉毒素G1。 0020 本发明技术方案的优。

14、点 0021 本发明的暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素具有高效的降解作用， 并且对黄曲霉 毒素的降解率随着孵育时间的增加而提高， 其中， 在37孵育72h时降解效果最好。 本发明 的暹罗芽孢杆菌A2025不仅能够高效降解黄曲霉毒素B1， 降解率97.1； 还对黄曲霉毒素G1 具有很好的降解作用， 降解率95.9。 而且， 本发明的暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素的 降解作用是细菌分泌至胞外的活性代谢物质主导的生物降解作用， 不是细菌细胞壁的吸附 作用。 用本发明的暹罗芽孢杆菌A2025的胞外代谢物处理被黄曲霉毒素污染的花生， 可显著 降低污染花生中的黄曲霉毒素含量。 附图说明 0022 图。

15、1 A2025菌落形态图； 0023 图2 A2025菌株16S rRNA琼脂糖凝胶电泳图， 左边是Marker， 右边两个是A2025的 16S rRNA电泳图； 0024 图3暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解图谱(A是对照组， B是试验组)； 0025 图4不同孵育时间暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解情况。 0026 图5暹罗芽孢杆菌A2025对AFG1的降解图谱(A是试验组， B是对照组)； 0027 图6暹罗芽孢杆菌A2025不同组分对AFB1的降解分析。 具体实施方式 0028 在本发明中所使用的术语， 除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。 说明。

16、书 2/7 页 4 CN 109161497 A 4 0029 下面结合具体实施例， 并参照数据进一步详细的描述本发明。 以下实施例只是为 了举例说明本发明， 而非以任何方式限制本发明的范围。 0030 本发明所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)A2025， 于2018 年04月12日保藏于： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC NO:15611， 地址为： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 请求保藏单位为山东省花生研究所。 0031 实施例1样品采集、 菌株分离及筛选 0032 1、 样品采集时间和地点 0033 2017年5。

17、月5日上午从山东省花生研究所试验基地(青岛市莱西市望城镇)采集花 生地土壤样品。 0034 2、 样品的处理、 菌株的分离和筛选 0035 在超净台中取1g采集的土壤样品悬浮在10mL无菌水中， 震荡稀释制备土壤悬浊 液， 然后用无菌蒸馏水稀释100倍。 取100 L悬浮液涂布在LB固体平板上， 放置于37进行培 养， 3天后将长出的菌落在LB固体平板上进行划线纯化， 经过3次划线纯化后， 得到一个菌 株， 编号A2025。 0036 实施例2菌株A2025的鉴定 0037 按照 “伯杰细菌鉴定手册” (第八版)中描述的方法， 对菌株A2025进行形态特征和 生理生化特征鉴定， 具体结果如下：。

18、 0038 1、 形态特征： 菌株A2025在LB培养基上单菌落凸起， 乳白色， 不透明(图1)， 在37 培养2天后， 菌落约为4-6mm， 培养3天后菌落表面出现皱褶。 0039 2、 生理生化特征： 氧化酶活性为阴性， 能在4-54生长， 革兰氏染色为阳性， 能水 解利用酪蛋白、 明胶和淀粉， 不能利用吐温40和吐温80。 0040 3、 16S rRNA基因分析 0041 提取A2025的细菌基因组DNA， 利用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增， 琼脂糖凝 胶电泳结果如图2所示； 扩增产物连接到pMD19-T载体， 转化重组质粒到大肠杆菌， 测序得到 的1508bp基因序列。。

19、 根据EzTaxon-e server数据库标准菌株序列同源性比较， 菌株A2025的 16S rRNA基因与标准菌株Bacillus siamensis KCTC 13613T的16S rRNA基因同源性为 100， 基因分析表明该菌为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。 0042 综合形态特点、 生理生化鉴定和16S rDNA测序和同源性分析的结果， 鉴定菌株 A2025为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。 命名为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)A2025， 于2018年04月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心。

20、， 地址为： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所， 邮编100101； 保 藏单位为山东省花生研究所， 保藏编号为CGMCC NO:15611。 0043 实施例3暹罗芽孢杆菌A2025的培养 0044 暹罗芽孢杆菌A2025的培养基为LB培养基： 10g蛋白胨， 10g氯化钠， 5g酵母提取物， 水1000mL； 能在4-54生长， 最优培养温度为26-37， 能在pH 5-9生长， 最优pH为7-8。 也可 以在GY培养基生长， GY液体培养基： 葡萄糖20g， 酵母粉5g， 水1000mL； GY固体培养基： 葡萄糖 20g， 酵母粉5g， 琼脂20g， 水1000。

21、mL。 0045 从-80冰箱中取出冻存的暹罗芽孢杆菌A2025， 在超净工作台中取50 L暹罗芽孢 杆菌A2025菌液接种到装有5mL的LB液体培养基试管中， 培养12h活化菌株。 向100mL LB液体 说明书 3/7 页 5 CN 109161497 A 5 培养基中接入活化的500 L菌液， 在37震荡培养48h， 菌液浓度为1.6108cfu/mL。 0046 实施例4暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素B1的降解 0047 1、 黄曲霉毒素B1的配置 0048 将1mg黄曲霉毒素B1(AFB1)标准品溶解于20mL色谱级甲醇中， 配置浓度为50ppm的 AFB1贮存溶液。 取0.5m。

22、L 50ppm的AFB1， 加入4.5mL色谱级甲醇， 配置浓度为5000ppb的AFB1工 作母液。 0049 2、 暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解 0050 取1.96mL的暹罗芽孢杆菌A2025菌液(菌液浓度1.6108cfu/mL)置于10mL样品管 中， 加入40 L 5000ppb的AFB1工作母液至其终浓度为100ppb， 颠倒混匀后37孵育72h， 然 后8000rpm离心5min获得上清， 记作试验组溶液； 以1 .96mL不接菌的培养基加入40 L5000ppb的AFB1工作母液作为对照组， 记作对照组溶液。 0051 3、 37条件下暹罗芽孢杆菌A2025对AFB。

23、1的降解能力分析 0052 首先加入甲醇到试验组溶液或对照组溶液分别进行萃取， 然后使用免疫亲和柱对 试验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取， 最后使用安装光化学衍生柱的 HPLC对净化提取得到的样品进行检测。 0053 HPLC检测条件为流动相甲醇： 水1:1(体积比)； 流速0.8mL/min； 色谱柱C18 (150mm4.6mm， 0.5 m)； 激发波长350nm， 检测波长450nm； 进样量20 L； 柱温30。 0054 AFB1降解率()(对照组AFB1含量试验组AFB1含量)/对照组AFB1含量100 0055 结果如图3所示。 图3中， A： 对照组； B试验。

24、组。 结果表明， 37条件下暹罗芽孢杆菌 A2025对AFB1降解效果较好， 降解率为97.1。 0056 实施例5不同孵育时间暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1的降解情况 0057 取1.96mL的暹罗芽孢杆菌A2025菌液(菌液浓度1.6108cfu/mL)置于10mL样品管 中， 加入40 L 5000ppb的AFB1工作母液至其终浓度为100ppb， 共12管， 每3管为一个平行； 颠 倒混匀后分别于37孵育12h、 24h、 48h、 72h， 检测不同孵育时间暹罗芽孢杆菌A2025对AFB1 的降解情况， 如图4所示： 0058 由图4可知， 随着孵育时间的增加， 黄曲霉毒素B1的降。

25、解率逐渐增加， 在孵育12h、 24h、 48h和72h时间， AFB1的降解率分别为16.3、 41.7、 73.2和97.1。 0059 实施例6暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素G1的降解 0060 1、 黄曲霉毒素G1的配置 0061 将1mg黄曲霉毒素G1(AFG1)标准品溶解于20mL色谱级甲醇中， 配置浓度为50ppm的 AFG1贮存溶液。 取0.5mL 50ppm的AFG1， 加入4.5mL色谱级甲醇， 配置浓度为5000ppb的AFG1工 作母液。 0062 2、 暹罗芽孢杆菌A2025对AFG1的降解 0063 取1.96mL的暹罗芽孢杆菌A2025菌液(菌液浓度1.610。

26、8cfu/mL)置于10mL样品管 中， 加入40 L 5000ppb的AFG1工作母液至其终浓度为100ppb， 颠倒混匀后37孵育72h， 然 后8000rpm离心5min获得上清， 记作试验组溶液； 以1 .96mL不接菌的培养基加入40 L5000ppb的AFG1工作母液作为对照组， 记作对照组溶液。 0064 3、 37条件下暹罗芽孢杆菌A2025对AFG1的降解能力分析 0065 首先加入甲醇到试验组溶液或对照组溶液分别进行萃取， 然后使用免疫亲和柱对 说明书 4/7 页 6 CN 109161497 A 6 试验组和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取， 最后使用安装光化学。

27、衍生柱的 HPLC对净化提取得到的样品进行检测。 0066 HPLC检测条件为流动相甲醇： 水1:1(体积比)； 流速0.8mL/min； 色谱柱C18 (150mm4.6mm， 0.5 m)； 激发波长350nm， 检测波长450nm； 进样量20 L； 柱温30。 0067 AFG1降解率()(对照组AFG1含量试验组AFG1含量)/对照组AFG1含量100 0068 结果如图5所示。 A： 试验组； B对照组。 结果表明， 37条件下暹罗芽孢杆菌A2025对 AFG1降解效果较好， 降解率为95.9。 0069 实施例7暹罗芽孢杆菌A2025降解黄曲霉毒素的机理 0070 取10mL实施。

28、例3中的暹罗芽孢杆菌A2025发酵菌液(菌液浓度1.6108cfu/mL)， 经 10000r/min离心10min后， 分离得到菌体和上清液(胞外代谢物)。 制备的菌体经无菌水洗涤 后离心， 加入无菌水补齐至10mL， 悬浮菌体获得暹罗芽孢杆菌A2025菌悬液。 暹罗芽孢杆菌 A2025菌悬液经低温超声破碎后， 10000r/min离心10min得到的液体经0.22 m滤膜过滤制备 暹罗芽孢杆菌A2025的胞内液(粗提物)。 将暹罗芽孢杆菌A2025上清液、 菌悬液、 胞内液三种 组分分别加入AFB1， 使AFB1终浓度为100 g/kg， 在37孵育72h后， 检测分析各组分的AFB1降 。

29、解率。 0071 比较暹罗芽孢杆菌A2025不同组分的降解能力， 发现其上清液、 菌悬液、 胞内液能 分别降解97.1、 16.6和9.3的AFB1(图6)。 这表明暹罗芽孢杆菌A2025降解AFB1是细菌 分泌至胞外的活性代谢物物质主导的生物降解作用， 而不是细菌细胞壁的吸附作用。 0072 实施例8暹罗芽孢杆菌A2025对黄曲霉毒素污染的花生的脱毒 0073 取50 L冻存暹罗芽孢杆菌A2025菌液接种到装有5mL的LB液体培养基试管中， 培养 12h活化菌株， 向100mL LB液体培养基中接入活化的500 L菌液， 在37震荡发酵培养48h， 菌液浓度为1.6108cfu/mL。 00。

30、74 取上述在LB液体培养基中37震荡培养48h的暹罗芽孢杆菌A2025发酵菌液(菌液 浓度为1.6108cfu/mL)， 经10000r/min离心10min后， 分离得到上清液。 0075 黄曲霉毒素污染的花生样品经研磨后分为2份， 每份1g， 编号分别为1号和2号。 1号 样品经121灭菌15min， 加入5mL灭过菌的LB培养基； 2号样品经121灭菌15min处理后降 温， 接入5mL暹罗芽孢杆菌A2025的发酵上清液， 两份样品都做37孵育处理72h。 0076 加入甲醇到1号或2号样品分别进行萃取， 然后使用免疫亲和柱对1号组和2号组溶 液萃取后样品的残留毒素进行净化提取， 最后。

31、使用安装光化学衍生柱的HPLC对净化提取得 到样品的AFB1进行检测。 0077 HPLC检测条件为流动相甲醇： 水1:1(体积比)； 流速0.8mL/min； 色谱柱C18 (150mm4.6mm， 0.5 m)； 激发波长350nm， 检测波长450nm； 进样量20 L； 柱温30。 0078 检测到经过脱毒处理后2号样品中AFB1浓度为7.8 g/kg， 而对照的1号样品中AFB1 浓度为43.5 g/kg， 由此可见， AFB1降解率为82.1， 结果表明暹罗芽孢杆菌A2025上清液可 显著降低污染花生中的黄曲霉毒素含量。 0079 以上所述， 仅是本发明的较佳实施例而已， 并非是对。

32、本发明作其它形式的限制， 任 何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等 效实施例。 但是凡是未脱离本发明技术方案内容， 依据本发明的技术实质对以上实施例所 作的任何简单修改、 等同变化与改型， 仍属于本发明技术方案的保护范围。 说明书 5/7 页 7 CN 109161497 A 7 0080 说明书 6/7 页 8 CN 109161497 A 8 0081 说明书 7/7 页 9 CN 109161497 A 9 序列表 山东省花生研究所 一种降解黄曲霉毒素的微生物制剂及应用 2018 1 SIPOSequenceListing 1.0 1 1508 D。

33、NA 16S rRNA(Bacillus siamensis) 1 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60 ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120 cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga 180 accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg ac。

34、ccgcggcg 240 cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300 ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360 gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420 cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480 gacggta。

35、cct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540 gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600 gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660 gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720 agtggcgaag gcgactctct ggtct。

36、gtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780 aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840 tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900 aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960 ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tct。

37、gacaatc ctagagatag 1020 gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080 agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140 tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200 atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat gggcagaaca aagggcag。

38、cg 1260 aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320 tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380 tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440 gaggtaacct ttatggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500 acaaggta 1508 序列表 1/1 页 10 CN 109161497 A 10 图1 图2 说明书附图 1/4 页 11 CN 109161497 A 11 图3 说明书附图 2/4 页 12 CN 109161497 A 12 图4 图5 说明书附图 3/4 页 13 CN 109161497 A 13 图6 说明书附图 4/4 页 14 CN 109161497 A 14 。