本申请在美国的临时申请号为60/670437，于2005年4月12日提 交。
政府的权利声明
本发明是在美国政府资助下完成，其授予能源部的合同号为No.04- 03-CA-70224。政府具有该发明的某些权利。
技术领域
提供了一个系统，包括处理生物质(biomass)的设备，其包括预处 理和糖化。同样提供了利用本系统对在生物质混合物里的高干重生物质 的预处理和糖化的方法。另外，还提供了优化生物质处理的方法。
背景技术
纤维和木质纤维的原料和废弃物，例如农业废物、木材、林业废物、 造纸的淤渣和市政及工业的固体废物，为化工、塑料、燃料和饲料生产 提供了大量的潜在的可再生的生物原料。纤维和木质纤维的原料和废弃 物，其成分为碳水化合物聚合体，包含纤维素、半纤维素、葡聚糖和木 质素。这些物质起初通常用各种化学的、机械的和酶的方法处理以主要 释放己糖和戊糖，从而可随后发酵为有用的产品。这些处理在复杂性和 效率方面有差异。而且，还有许多的方法正在实施，以识别新的健康的 商业化的工艺使已知的从纤维和木质纤维的原料中产生有用的有发酵 力的产品的工艺最优化。
为了使通过可再生的生物资源生产发酵糖成为一种经济的、有竞争 力的、可商业化的方法，要求木质纤维生物质中的碳水化合物的水解能 利用低剂量的化学试剂，高效率地产出高浓度的糖，以提供一个可发酵 糖的来源，以便用对于可发酵生物低毒的方法，将那些糖转化为有附加 值的化学制剂和燃料。
为了执行这些工艺，各种各样的设备已经使用于不同类型的生物 质，进行不同的处理，包括小规模的工艺开发和一些大规模生产设备。 一些设备的品种已经使用，包括间歇搅拌反应器(Gusakov and Sinitsyn， (1985)Enz.Microb.Technol.7：346-352)、连续流搅拌反应器 (US4257818)、研磨反应器(Ryu和Lee(1983)Biotechnol.Bioeng. 25：53-65)、挤压反应器(US6176176)、NREL收缩床(shrinking bed)反 应器(Lee等人，(2001)Appl.Biochem.Biotech.91-93：331-340)、和 电磁场感应加强搅动的反应器(Gusakov等人，(1996)Appl Biochem. Biotechnol.56：141-153)。
特别地，需要能够提供如下功能的反应器：能够高效率地预处理和 /或糖化高干重的在混合物中的生物质。
还有对于简单而高效的设备也有需求，其可用于小规模的生物质处 理工艺，以测试在模仿大工业规模化生产中的工艺参数，况且。还有未 满足的需求：利用健康的商业化工艺和设备来实施包括对在生物质混合 物中高干重的生物质进行糖化的工艺。
发明概述
在一实施方案中，本发明提供包括成批处理生物质的设备的系统， 包括：
a)设备，其包括：
i)至少有一端是开口的圆柱形反应容器；
ii)一个或多个附着于上述容器内部的挡板；
iii)包含自由漂浮在该反应容器内部的丸粒状的研磨介质；
iv)用于所述容器开口端的盖子，其包含一个或多个端口；和
v)注射喷枪(lance)，包含输送加工反应剂的装置，其中上
述装置是注射喷枪，其沿该反应容器长度延伸并与iv)中的盖子的 第一端口相连；和
b)用于旋转容器挡板的装置。
在另一个实施方案中，本发明提供用于生物质处理的工艺，包含：
a)将生物质导入到如权利要求1所述的反应容器；
b)将加工反应剂导入到该反应容器；和
c)通过旋转所述反应容器的挡板使挡板升起和下降研磨介质，以使 上述加工反应剂进入上述生物质同化(assimilate)。
在本发明另一个实施方案中，提供用于处理生物质的工艺，包含：
a)预处理在如权利要求1设备的反应容器中的生物质，产生预处 理的生物质；
b)在反应容器中调整a)的预处理的生物质的温度和pH；和
c)在所述反应容器里糖化在b)中已经调整的预处理生物质。
在另一个实施方案中，本发明提供了优化处理工艺的方法，包含：
a)将生物质导入到权利要求1所述的设备的反应容器中；
b)改变该反应容器中的处理条件；
c)在上述变化的处理条件下，通过上述一个或多个端口将处理过 的生物质取样；和
d)测试上述样品以为生物质处理工艺决定最佳处理条件。
附图说明
图1是生物质处理系统的一个实施方案的略图
附图2A是显示生物质处理系统的一个实施方案的详图。2B是显示 所述反应容器盖子的图。
发明的详细说明
申请人已明确地将引用的参考文献公开的全部内容包含在本发明 中。而且，当数量、浓度或者其他的数值或者参数，即便是被当做一个 范围、优选范围、或者一高于优选值和低于优选值的列表时，这些将被 明确地理解为已被本发明由任何一对上限限定或者优选值和任何下限 或者优选值形成所有区域明确地公开，而不管所述范围是否是被单独地 披露。在这里列举的数值范围除非另有说明，包括在所述范围内部的端 点，连同其他一切整数和分数。本发明的范围不限于特殊的值列举时的 定义范围。
本发明提供一个包括用于生物质处理工艺设备的系统，和用于生物 质处理的工艺以及在所述设备中进行的用于优化处理的方法。所述系统 的设计通过当反应剂被导入或者所述反应器运转时使该反应剂散布在 生物质上，来提供反应剂的大范围分布。所述系统具有如下功能，能大 范围的将反应剂导入生物质以提高处理工艺。这些特征允许处理在生物 质混合物中高干重的生物质。
定义：
在本申请中，使用了许多术语。以下是定义：
术语“可发酵糖”指那些能被微生物在发酵过程中作为碳源使用的 低聚糖和单糖。
术语“木质纤维的”指包含木质素和纤维素的组分。木质纤维材料 可能还包含半纤维素。
术语“纤维的”指包含纤维素的组分。
生物质的“干重”是指除去全部或基所述上全部水的生物质重量。 典型的测量干重的方法是按照美国测试和材料学会(ASTM)标准E1756- 01(测定生物质中总固体物质的标准测试方法)或者Technical Association of the Pulp and Paper Industry，Inc.(TAPPI)标准T-412om- 02(纸浆、纸和纸板的湿气)。
术语“糖化”指从聚糖中生产可发酵糖。
术语“预处理的生物质”是指在糖化作用前已经预处理的生物质。
“生物质(biomass)”指任何纤维的或者木质纤维的材料并包括包 含纤维素的和选择性的包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖 的材料。生物质可同时包含另外的组分，例如蛋白质和/或脂质。按照本 发明，生物质可能是由单一来源得来或者可以包含超过一个来源的混合 物；例如，生物质可以包含玉米芯和玉米秸的化合物，或草和叶的混合 物。生物质包含但不限于生物质能源作物、农业废物、城市固体废物、 工业固体废物、造纸淤渣、庭院废物、木材和林业废物。生物质的例子 包括但是不限于，玉米颗粒、玉米芯、作物残体例如玉米外皮、玉米秸、 草、小麦、麦秸、大麦、大麦秸、干草、稻草、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、 高粱、大豆，从加工颗粒、树、枝、根、叶子、木材碎片、锯屑、灌木 和丛生灌木、蔬菜果实、花和牲畜粪过程中获得的组分。在一个实施方 案中，对本发明有用的生物质包括那些相对密集的和/或相对便于收 集、运输、贮藏和/或搬运的有比较高的碳水化合物值的生物质。在本 发明的一个实施方案中，有用的生物质包括玉米芯、玉米秸和甘蔗渣。
“含氨水溶液”指如下物质的水溶液：氨气(NH3)、含铵离子(NH4+) 的化合物例如氢氧化铵或者硫酸铵、那些在降解过程中释放氨的化合物 例如尿素、及其在水性介质中的组合。
术语“处理”指反应剂作用于材料的过程，在此过程中材料的物理 的和/或化学的性质被改变。
术语“反应剂”指在处理工艺的条件下能改变目标材料物理的和/ 或化学性质的组分。
用于糖的“联合酶(enzyme consortium)”是酶的组合，其能作用 于生物质混合物以制造可发酵糖。代表性地，糖化联合酶可以包含一个 或多个糖苷酶；所述糖苷酶可选自纤维素水解糖苷酶、半纤维素水解糖 苷酶、和淀粉水解糖苷酶。其他的糖化作用联合酶可以包括多肽、脂肪 酶、木质素和阿魏酯酶。
生物质处理系统
本发明生物质处理系统的最佳方案是参考图1制造，其显示了所述 系统的一个实施方案。所述系统的设备包含圆柱形的反应容器(10)，其 具备一个封闭端(11)，和一个开口端(12)。活动盖(13)装配在开口端，并 且可以是可靠地固定在所述容器开口端上。在盖子里至少存在一个端 口。注射喷枪(14)贯穿盖子(15)中心的端口进入反应容器。注射喷枪是一 个沿圆柱形反应容器的纵向中心从端口延伸的管子。注射喷枪的末端即 距离端口的远端(16)是密封的。注射喷枪沿着它的长度有V形排列的孔 (17)。这些孔允许逃逸的内容物从注射喷枪内部沿大约10点钟和2点钟 方向向上进入反应容器。另外，真空源可以通过和喷枪通连的端口应 用，由此在容器内部建造一个真空。附着于所述反应容器内表面的是挡 板(18)，其扩展到容器中开放的空间，并且没有接触所述注射喷枪。在 反应容器的内部是自由漂浮的研磨介质(19)。所述设备被水平地安置在 辊(20)上，该辊用来在所述生物质处理系统中旋转反应容器。
在生物质处理期间，所述设备维持在水平位置，并施加用于反应容 器的挡板沿容器纵轴的方向旋转的装置，以形成生物质处理系统。所述 挡板可以是附着于反应容器内表面，而在这样情况下容器整体是旋转 的。另外，挡板可以是附着于在反应容器之内一个套筒的表面，而在这 样情况下当套筒旋转时，容器本身是固定的。旋转容器或者套筒可以是 用可以提供自转的任何方法完成。例如，旋转容器可以是放置在外部的 辊、带、轮子、枢轴或者其他的滚动感应平台上。设备可以是罩在使得 所述容器旋转的反应器中，或者旋转装置可以与所述设备结合使用。可 以有一个贯穿容器的驱动轴，它连接容器壁或者套筒用于施加旋转。转 速是可变的，由使用的特殊的处理工艺和设备的尺寸来决定。转速足够 推动级联的研磨介质，如下文所记载，并且可以被所述领域技术人员决 定。
反应容器的开口端的盖子可以用本领域已知的方法技术固定到容 器上，例如用螺旋、夹具、栅、担夹(dog)或者其他的紧固件。反应 容器可以是两端开口的，每端各有一个盖子。在所述盖子(或者两个盖 子，如果每端都有一个的话)里的端口是开放的用于通向反应容器的内 部。端口可以是用于连接内部的设备例如喷枪、和/或外部设备例如真 空装置或者注气设备的位置。外部设备的连接可以是暂时的(仅当在处 理工艺期间必要时)，或者是永久的。因此端口可以有连接器，而且当 闲置时盖子可封闭所述端口。使用将端口连接在盖子里的传统的连接 器，包括分枝的连接器和回转接头。端口可能同时是盖子内提供通向内 部的开口，例如取样或者释放压力，同时它们自己可以有盖子。对于生 物质处理，设备的温度是要求的温度并且是受控的。控制器设备温度可 以用能加热的任何方法，例如施加一个加热夹套、通过注射喷枪或者另 一个端口注入热气、燃烧可燃气体、或者使用汽锅的烟道废气热来完 成。另外设备可以安装在那些为该设备提供热的烘箱、油浴、或者其他 类型的反应器里。所述设备内部的温度可以用穿过连接注射喷枪盖子里 的端口并下至注射喷枪插入温度测量装置测定，例如热电偶。通过将温 度测量装置向下插入注射喷枪至一半处，可以测量反应容器接近中心的 温度。可利用如下方法冷却容器：使用冰或者在冷却套中的另一冷却 剂、使冷却气体通过注射喷枪、将反应器放置在冷却浴中、或者冷却(冷 冻)其内有反应容器的外箱。这可以由另外的装置或者所述设备的装置 来完成。
所述注射喷枪提供用于沿着反应容器的长度导入并且分配溶液或 者气体的装置。例如，氮、二氧化碳、蒸汽、加工反应剂、和pH调整 溶液可以通过该注射喷枪导入。那些通过注射喷枪导入的加工反应剂可 以使用本领域熟知的任何方法在注射前预热。例如，可以使加工反应剂 通过一个热线圈来加热反应剂，该热线圈通过在盖子里的端口的中心连 接在注射喷枪上。加热线圈浸在维持在加热加工反应剂需要的温度的加 热水浴中。
真空可以通过盖子里的端口施加到所述设备的反应容器里。真空源 可以连接到盖子里的端口上，典型地是那些连接在注射喷枪的端口。分 支连接器或者回转接头提供对于真空和用于反应剂的通道到注射器喷 枪上的连接。真空可能用来帮助在反应器容器里加工反应剂向生物质的 渗透。通过向含有生物质的容器施加真空，可以将空气从生物质中抽 出，以使加入的加工反应剂渗透得更好。同时反应器中的空气可以替换 为惰性气氛例如N2或者氩。真空可以应用于帮助冷却反应容器里的内 容物，当工艺需要使用蒸发制冷时。在生物质处理工艺过程中生成的气 体可以通过施加真空和使用排气冷凝器回收。真空源和排气冷凝器可以 附着于盖子的端口，因此蒸气透过所述端口进入到冷凝器。浓缩的、回 收的加工反应剂(例如氨)可以在后面的的生物质处理工艺中再利用。 当用于预处理工艺时，除去氨降低预处理生物质的pH从而节省需要的 化学制剂，该化学制剂用于将预处理生物质的pH中和至酶的糖化作用 和生物催化剂发酵所需的最佳pH。通过降低和微生物接触的盐量，降 低的化学制剂的使用同样改善了后续发酵，因此提高产率和生产力。
所述设备的反应容器也可以通过盖子中的端口的注射来加压。例 如，二氧化碳源可以连接到连接了注射喷枪的盖子中的端口，从而将二 氧化碳注入以，例如，将反应容器内部的真空加压、降低pH和/或以 别的方式推动生物质处理工艺。连接器分支可以通过同一端口将二氧化 碳源、真空源和反应剂通道连接到注射喷枪。
附着于所述反应容器内表面的挡板可以是推动在研磨介质(在下面 描述)中加工反应剂同化进入生物质的任何形式、数量和排列。当挡板沿 容器的底部旋转时，研磨介质和生物质被挡板升起，当挡板沿容器的顶 端旋转时，它们滑下。挡板可以沿垂直的或者是成角度的方向延伸到内 表面，其角度允许介质被升起并随后下滑，或者级联(cascading)。挡 板可以连续的运行反应器的整个长度，或者部分反应器长度的挡板可以 排列成直线，或者彼此倾斜相对。挡板扩展到容器内部形成表面，其宽 度足够升起研磨介质，当挡板向容器的顶端移动时，其宽度足够狭窄能 使那些研磨介质容易地滑下。本领域技术人员知晓，当挡板旋转以推动 加工反应剂与生物质混合时，各种各样的挡板的形式、位置和数量应使 研磨介质和生物质有效地级联，而且在不同尺寸反应容器中有不同的最 优排列。
所述设备一般由抗腐蚀材料制成，其能经受压力、温度和生物质处 理工艺中通常使用的加工反应剂。抗蚀材料的例子包括不锈钢、 Hastelloy(耐盐酸镍基合金)、陶瓷、Inconel(铬镍铁合金)、二联 不锈钢、锆和碳钢。不同的生物质处理工艺的实施温度介于-10℃与大约 220℃，典型的温度介于4℃和170℃之间。同时生物质处理工艺可以是 在温度介于室温(大约25℃)和大约170℃范围之间实施。生物质处理工 艺使用的压力一般介于大气压和大约1200kPa范围之间，典型的压力介 于大气压和大约310kPa范围之间，并且进一步优选的压力值在大约大 气压和138kPa之间。在一个特定的实施方案中，设备使用的材料是那 些本领域技术人员众所周知的经得起生物质特殊处理工艺条件的材 料。在实施方案中，独特的适合用于所述反应容器的材料是10号钢厚 度(schedule 10 thickness)的不锈钢，其可以在压力介于大气压和大约 310kPa，温度最高到大约145℃使用。另外，所述设备可以是由其他的 材料制成，只要经得起较高的温度和压力，以及腐蚀性很强的加工反应 剂例如强酸性物。更严酷的生物质处理条件包括温度最高到大约220 ℃，压力最高到大约1216kPa，和强酸性反应剂例如硫酸。当使用这 些加工条件时，材料例如Hastelloy和锆将是有效的。
所述反应容器的直径是足够大的，使得所述容器可以包围注射喷枪 和挡板，而且当挡板旋转时有空间为研磨介质自由地级联。反应容器的 内径可以为大约10厘米，典型的内径是至少大约15cm，其可以按比例 增大，包括工业化的尺寸。
研磨介质被导入设备而在反应容器中自由漂浮。研磨介质添加量使 得小于反应容器容积的约10％被研磨介质占据。典型地，研磨介质用量 占所述反应容器容积的大约3％到大约7％之间。研磨介质可以是不同的 形状和尺寸并以不同的数目使用，其取决于反应容器的尺寸。所述设备 的具体实施方案中使用的研磨介质的尺寸、形状、数目和成分，可由本 领域技术人员决定。尤其有用的是丸粒(pellets)例如由重的、密致材料制 造的柱体(cylinder)，有由抗蚀材料构成的坚固的无孔的，防腐剂-抗 破碎表面。研磨介质可以从商业渠道获得，例如从E.R.Advanced Ceramics(East Palestine，OH)。当挡板旋转时，研磨介质被挡板提起并倒 在生物质上。挡板转动的速度被调整至介质经历级联运动，而不至于因 为速度太低滑在容器壁上或者因为速度过高而保持与容器壁邻接。不受 理论约束的，认为研磨介质落在生物质上提供挤注压力，导致渗出包括 加工反应剂和溶液化生物质组分的混合物的液体。大量液体随后取代已 使用的渗出液体。所述生物质的研磨介质的提升重量，应考虑到当挡板 旋转时，加工反应剂混合物渗入生物质的附加量。反复地从加工反应剂 混合物上榨取和渗入生物质形成抽吸作用。从反应剂混合物抽吸进出生 物质是特殊种类的机械混合工艺，其推动反应剂同化(assimilation)进 入生物质，并由此加强了生物质处理工艺。液体的这种交换使得更高浓 度的反应剂能够在气孔中被交换，以放空所述生物质气孔中已经反应过 的液体。
以下对一个实施方案的设备的描述并不意味着局限，只是提供一个 特别适用的设备结构。在实施方案中，如图2所示，设备的反应容器(10) 容量有大约9L，51厘米长，内径15厘米。它用304不锈钢管和附件 制造。容器的开口端(11)直径为10厘米，具有4个等距的盖子附着位 点(12)，各从开口向外伸展2.54厘米。盖(13)是圆盘，直径为15.2厘米。 盖子有两个端口，第一端口在中央(14)和第二端口在中心和边缘(15)之 间，直径各为1.9厘米。注射喷枪(16)贯穿盖子的中心端口并与回转接 头(17)连接。有分支连接器(18)附着于所述回转接头。注射喷枪用直径 0.64厘米的不锈钢管制成。喷枪(19)上的孔直径为0.165厘米，排列成 2.54厘米间隔的V形图案。每排孔间的角度大约120度。有两排孔，每 排单一线上的孔相隔5.1厘米，2条线上的孔偏移2.54厘米，如是实际 上在喷枪的交互侧面上每2.54厘米有一个孔。盖子上的第二端口提供取 样和加入试剂的通道而无需移动盖子。有四个挡板(20)，每个的每次行 程为反应容器壁的长度(他们与该容器壁连接)，并自从容器内壁伸出 3.8厘米并垂直于该容器内壁的表面。22个研磨介质柱体(21)尺寸为3.2 cm×3.2cm，由氧化锆或者矾土制成(购买自E.R.Advanced Ceramics， East Palestine，OH)，被添加到反应容器中，占用大约5.5％的容器容 积。设备安置在滚动支座(22；Bellco Cell Production Roller Apparatus， Bellco Technology，Vineland N.J.USA)上，由此在处理工艺期间以大约 19rpm旋转，以形成生物质处理系统。滚动支座和设备被安置在恒温箱 室(23)的内部以进行温度控制。
在下文的实施例中，外部设备附属于图2的设备形成系统。为了导 入预处理反应剂，高效液相色谱泵连接在盖子上的分支注射喷枪旋转端 口连接器上，其流量为在10342kPa精确压力下，大约800ml/min。所 述高效液相色谱泵通过加热线圈连接，加热线圈用0.32厘米不锈钢管材 建造，其沉浸在8L的Parr反应容器中的水中。Parr反应器的加热控制 器设置在高于在Golden，CO中的水的沸点温度(大约93℃)，以输入功 率为3KW的加热器维持快速的沸腾。真空源连接至在盖子上的分支注 射喷枪端口的旋转连接器。真空源可以连接到排气冷凝器上，该排气冷 凝器连接至在大约1.5℃运行的冷却水浴。排气冷凝器包括涂有聚四氟 乙烯TM的沉浸在冰浴中的2L水瓶，并且连接在被抽空到大约85kPa 的真空歧管上。二氧化碳源可同时连接至所述分支注射喷枪端口的旋转 连接器。
应该理解，包括所述设备的系统设备可以是以上述描述的特征和原 则为基础按比例增大。设备的反应容器直径大约3-4米，长度大约15-18 米，特别适于工业规模的生物质处理。具有在图2中描述范围内的反应 容器尺寸的设备和具有工业规模尺寸的设备都是本发明实施方案。
生物质处理中使用设备的方法
本发明的系统设计成生物质的处理，包括使用不同工艺的不同处理 类型。在实施方案中所述系统用于生物质预处理工艺。在另实施方案中 所述系统用于生物质糖化工艺。这两种生物质处理可以是在相同的生物 质样品上先后实施，或者在不同的生物质样品上单独地实施。生物质样 品可以在另一设备中预处理而在本发明的设备中糖化，或者可以是在本 发明的设备预处理然后在另一单独的设备中糖化。
包括所述设备的本发明系统特别适于处理生物质设备，且特别适于 在生物质反应混合物中的高干重的生物质的糖化作用。最初的生物质干 重可以是至多占生物质反应混合物大约80％的重量。更为合适的，生物 质干重可以是至多占生物质反应混合物大约60％的重量。优选最初的生 物质浓度占生物质反应混合物重量的比例为大约15％和大约50％之 间。通过注射喷枪导入反应剂和研磨介质，且研磨介质和挡板的功能提 供反应剂至生物质的同化，由此有效地在高生物质浓度下进行加工。在 糖化作用的过程中，其中例如纤维素酶和半纤维素酶的酶水解生物质以 产生可发酵糖，通过所述容器挡板的旋转，酶通过生物质和研磨介质的 级联被同化入生物质。在生物质上级联介质的效果可以成功地处理在生 物质混合物里的高固体干重的生物质。
在预处理工艺中，生物质通过反应容器的开口端被导入本发明的设 备。在生物质导入到所述设备之前，可以应用能源将生物质减少尺寸和 /或增加暴露表面面积，例如通过压碎、磨、研磨、切细、切碎、圆盘 精炼、超声和微波。导入生物质的量取决于反应容器的尺寸和将使用的 特定处理工艺，并且可以由本领域的技术人员决定。设备可以预热到要 求的加工温度。
加工反应剂通过固定容器盖子中的端口注入，并通过注射喷枪进入 到反应容器。在一个实施方案中，反应剂被预热并且，当挡板旋转时， 通过在注射喷枪上表面的孔喷雾导入，因此当生物质通过喷雾上方时与 反应剂接触。所述加工反应剂可以是那些用于生物质预处理工艺的任何 成分，只要它们与所述设备构造的材料不矛盾。典型的预处理反应剂包 括氧化剂、变性剂、清洁剂、有机溶剂和碱，其列举于US2004/0231060， 以及酸。一些适宜的反应剂包括过乙酸(Teixeira等，(1999)Appl.Biochem. and Biotech.77-79：19-34)、过氧化氢(Gould(1983)Biotech.and Bioeng. 26：46-52)、氢氧化钠和过氧化氢(Curreli等(2002)Process Biochem. 37：937-941)、氨水(KimLee(2005)Bioresource Tech.)96：2007-2013)、 和无水氨液体(Teymouri等(2005)Bioresource Tech.96：2014-2018)。用 于本发明中生物质预处理的特别适合的加工反应剂是氨水。最优选的是 含氨的水溶液，其用于生物质-氨水混合物，在其中氨浓度至少足够维持 生物质-氨水混合物的pH的碱性，但是氨含量应小于生物质干重的约 12％，如未决申请CL2825所述。
加工反应剂的添加量，以及由此的生物质浓度，可以依据使用的预 处理工艺变化。本发明的设备特别适宜预处理高浓度的生物质，其中干 重生物质的起始浓度至少占生物质-氨水混合物重量的大约15％(重量 比)。高生物质浓度减少预处理材料的量，使工艺更经济。另外，用高 生物质浓度，使得后续在发酵作用中，糖化作用的需要的糖的浓度的滴 定量减至最少。如上所述的所述方明设备机混合的压榨和过滤方式，特 别适于在所述生物质混合物中的高干重生物质的处理工艺。
在将生物质装填至本发明设备之前，反应容器的气氛可以用氮或者 任何其他选择的气体冲洗。例如，抽真空然后用氮气通过端口导入以替 换空气。当需要充分地置换空气时，上述方法可以重复多次。
如上所述，对设备包含生物质和预处理反应剂的设备进行温度控 制。如上所述，反应容器的挡板是旋转的。预处理工艺允许的时间取决 于具体使用的工艺，典型地时间为大约5分钟到大约8小时。当反应进 行时，样品可以从设备盖子中的端口取出。可以对这些样品进行分析以 评估预处理反应的完全性。可以使用各种分析方法，取决于所使用的预 处理方法，例如，近红外的(NIR)光谱学、化学全分析或者通过在样品上 实施小的糖化作用。
当使在预处理条件下形成蒸气的反应剂时，反应剂蒸气可以用连接 至如前所述的排气冷凝器的真空装置收集。典型地，在预处理工艺结束 之后，反应剂蒸气被收集和浓缩以便再利用。实例之一是当使用液氨作 为反应剂时的氨蒸汽的收集。收集的氨蒸汽可以被液化，用于加工反应 剂以预处理其他的生物质。
预处理过的生物质可以从设备中移除，或者可以进行第二类型的生 物质处理、糖化，而无需移走所述。或者，样品已经在单独的设备中预 先处理的生物质可以被导入到用于糖化的本发明设备中。糖化反应剂的 添加量，以及由此的生物质浓度，可以依据使用的糖化工艺变化。糖化 反应剂典型地使用本发明设备的注射喷枪被直接注入到反应容器中。通 过注射喷枪对糖化反应剂的导入、以及研磨介质和挡板的功能促进反应 剂同化进入生物质，使得在高生物质浓度中的糖化是有效的。糖化反应 剂可以以干燥的形式通过盖子的端口或者打开的盖子导入。
在糖化期间，生物质干重可以占生物质-反应混合物重量的至多大约 80％。更为合适的，生物质干重可以占生物质-反应混合物重量的至多大 约60％。优选最初的生物质浓度占生物质-反应混合物重量的大约15％ 和大约40％之间。高的生物质浓度减少糖化材料的总量，使工艺更经 济。这表明在高生物质含量下的糖化作用酶联合依然是有效的，其中杂 质、初始酶解物和产品的含量没有被稀释，并且其中不同的抑制和去活 过程可能发生。在低的生物质浓度下，如糖化作用中通常使用的，由于 高的稀释因子，潜在的抑制和去活过程显著地减少或者不存在。另外， 用高的生物质浓度，对后续在发酵作用中，糖化作用的需要的糖的浓度 的滴定量减至最少。本方明设备如上所述的机混合的压榨和过滤方式， 特别适于在所述生物质混合物中的高干重生物质的糖化作用。
糖化加工反应剂包含的酶能水解预先处理过的生物质以释放寡糖 和/或单糖。糖化作用酶及其用糖化作用酶处理生物质的方法在Lynd， L.R.，等(Microbiol.MoI.Biol.Rev.(2002)66：506-577)中概述。
典型地，所用的糖化作用联合酶包含但不限于主要从″糖苷″基团中 选择的一种或多种酶，它水解二-、寡-和聚糖的醚键，并且在可参见酶 分类中在通用“水解酶”(EC3.)中的EC 3.2.1.x(Enzyme Nomenclature1992，Academic Press San Diego，CA with Supplement (1993)，Supplement 2(1994)，Supplement 3(1995)，Supplement 4 (1997)和Supplement 5[分别地在Eur J.Biochem.(1994)223：1-5，Eur. J.Biochem.(1995)232：1-6，Eur.J.Biochem.(1996)237：1-5，Eur.J. Biochem.(1997)250：1-6，和Eur.J.Biochem.(1999)264：610-650中])。 对本发明有用的糖苷酶可以通过生物质水解成分分类。对本发明有用的 糖苷酶包括纤维-水解糖苷酶(例如，维素酶、内葡聚糖酶、外葡聚糖酶、 纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)、β-葡糖苷酶)、半纤维素-水解糖 苷酶(例如，木聚糖酶、内木聚糖酶、外木聚糖酶、β-木聚糖酶、阿 拉伯糖基木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、胶质酶、葡萄糖苷酸 酶)、以及淀粉-水解糖苷酶(例如，淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、 葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、异淀粉酶)。另外，将其他的活性成分添 加到糖化联合酶也可能有用处，例如多肽(EC 3.4.x.y)、脂肪酶(EC 3.1.1.x和3.1.4.x)、木质素(EC 1.11.1.x)和阿魏酯酶(EC 3.1.1.73)，以 帮助从生物质的其他组分释放聚糖。本领域公知的是，制造聚糖-水解酶 的微生物经常显示例如纤维素降解的活性，其通过数个酶或者一群有不 同的酶解专一性的酶催化。因此从微生物获得的″纤维素酶″可以包含一 群酶，它们所有的都可以贡献纤维素-降解活性。商业的或者非商业酶制 剂，例如纤维素酶，可以包含许多的酶，取决于使用的提纯获得酶的方 案。因此本发明工艺的糖化作用联合酶可以包含酶活性，例如″纤维素 酶″，然而要认识到其活性可以被超过一种的酶催化。糖化酶可以商业 地获得，例如SpezymeCP纤维素酶(Genencor International， Rochester，NY)和Multifect木聚糖酶(Genencor)。
本领域技术人员懂得如何决定在联合中的酶的有效量以及调整条 件以使酶活性最优。本领域技术人员同样懂得如何优化联合酶的活性成 分的种类以获得在选定条件下的对预处理过的生物质的最优糖化。
本发明中，当预处理并然后糖化的生物质时，在糖化作用处理之 前，预处理过的生物质的pH以及温度被调节到对糖化作用酶的活性有 利的状态。当用酸或者碱预处理时，预处理过的生物质的pH可以通过 向反应容器导入pH调整溶液或者固体来提高或者降低。为了获得pH 调整溶液在预处理过的生物质中的良好分布，当反应容器中的挡板旋转 时，通过喷枪将pH调整溶液注入到预处理生物质中。溶液可以预热， 典型地预热到与糖化联合酶相容的温度，例如大约50℃。另外，pH调 整溶液可以通过盖子的端口导入。容器的挡板可以旋转以促进pH调整 溶液同化进入由研磨介质和挡板提供的生物质，通过样品端口移开样 品，生物质被周期地测试pH直到达到要求的pH。pH目标可以是在大 约2和11之间，取决于糖化作用所使用的酶，因为如同本领域技术人 员所知，不同的酶会显示不同的最优的pH。更典型地，所需pH在大约 4和10之间，而pH大约5.5是最典型的。
糖化作用的温度一般地在大约15℃到大约100℃之间，同样取决于 糖化作用所使用的酶，因为如同本领域技术人员所知，不同的酶显示不 同的最适温度。典型的温度在大约20℃到大约100℃之间。糖化作用是 当反应容器的挡板旋转时进行的。使反应剂同化进入设备中的反应剂的 压榨和过滤的方式，如上所述，增强了糖化作用反应剂到生物质的通 道，由此提供高效率的糖化作用工艺。该工艺持续的时间从大约几分钟 到大约120小时，优选从大约几小时到大约72小时。反应时间取决于 酶浓度和具体的活性，和使用的酶解物和环境条件，例如温度和pH。 对于使用的特定的生物质和糖化作用联合酶，本领域技术人员可以容易 地决定最优温度、pH和时间条件。
本发明设备对最优化生物质处理工艺特别有用。有许多的处理条 件，其可能在生物质处理工艺方面有差异，无论它是预处理或者糖化作 用工艺。可变的条件包括但是不局限于，pH、温度、加工反应剂种类和 加工反应剂浓度、生物质反应混合物中生物质干重百分比、添加反应剂 的进料策略、压力、惰性气氛种类、使用的生物质形式和类型和形态、 以及加工时间。本发明的设备可以构造成小型的，如在此前一个实施方 案中描述的(见图2)，其特别适合于优化处理工艺。可利用试验统计的 方法，独立或者关联地变化试验条件，并且当加工进行时，从样品端口 取样。在糖化作用工艺或者联合的预处理/糖化作用工艺中，样品中的糖 可以直接地分析。在单独的预处理工艺中，样品被糖化并接着分析糖化 作用的产品含糖量及其他所关心的组分，例如乙酸、糠醛和盐。其他的 方法同时可以用来分析，例如分析半纤维素。最佳化可以是以许多标准 为基础的，包括单体产率、总排放量糖产率、低的酶用量、低的乙酸、 低的fufurals、低的杂质形成，或者以它们中的多个为基础的全局优化。 例如，葡萄糖和木糖的百分比理论上由处理过程中释放的初始生物质来 决定。糖单体产率接近或超过50％表明优良的结果，而更高的产率被优 选。包括释放的低聚物的总糖产率达到至少70％表明优良的产率。分析 糖的方法为本领域技术人员所熟知，例如由高效液相色谱法。另外，其 他处理过的生物质样品组分(例如乙酸、糠醛或者乳酸)也可以分析， 同样由高效液相色谱法测定产品的质量。
从生物质释放的可发酵糖能被适宜的微生物(其为生物催化剂)使 用，以制造目标化学制剂，如未决美国专利申请CL3435和CL3436所 描述。
实施例
通用方法和材料
以下使用的缩写：
″HPLC″是指高效液相色谱，″C″是摄氏温度，″kPa″是千帕斯 卡，″m″是米，″mm″是毫米，″kW″是千瓦，″μm″是微米，″μL” 是微升，″mL″是毫升，″L″是升，″min″是分钟，″mM″是毫摩尔， ″cm″是厘米，″g″是克，″kg″是千克，″wt″是重量，″hr″是小 时，″temp″或者″T″是温度，″theoret”是理论的，″pretreat″是预 处理，″DWB″是生物质的干重。硫酸、氢氧化铵、乙酸、乙酰胺、 酵母提取物、2-吗啉并乙烷磺酸(MES)、磷酸钾、葡萄糖、木糖、胰胨、 氯化钠和柠檬酸从Sigma-Aldrich(St.Louis MO)获得。
预处理和酶水解反应器(PEHR)
生物质处理器的尺寸和特征如图2所示并且在以上描述和下文实施 例中被称作PEH反应器。简要地，9L PEH反应器(在NREL，Golden， CO建造)有大约15厘米×51厘米的不锈钢反应容器，其有能导入加工 反应剂的注射喷枪。注射喷枪在容器的一端上利用回转接头连通到盖子 的端口，该容器具有其他的端口用于联通容器。四个挡板穿过容器壁的 长度，并且被垂直地连接到器壁。挡板和22号陶瓷的研磨介质柱体 (cylinder)(3.2cm×3.2cm)(E.R.Advanced Ceramics，East Palestine OH)在容器里自由漂浮，当容器旋转时，提供生物质和反应剂的机械混 合，以促进反应剂进入生物质的同化。PEH反应器安装在Bellco Cell- Production Roller Apparatus(Bellco Technology，Vineland，NJ)上，其 提供旋转机制，并且有辊的反应器安装在能加热的温度受控的腔中。温 度受控的腔由铝制框架组成以支撑围绕Bellco Cell Production Apparatus 的软木隔离垫，加热器连接在上面，且该加热器通过插入PEHR反应器 中的注射喷枪中心的热电偶控制。真空和压力可以通过连接在盖子端口 的喷枪的外部附加的来源应用于所述反应容器。
蒸汽枪反应器间歇蒸煮(digestion)系统
4升蒸汽枪反应器(Autoclave Engineers，Erie，PA)是蒸汽-夹套反 应器，由102毫米长80 Hastelloy的管道组成，两端由球阀封闭。另外 的电加热器被安装在完全暴露的无夹套的反应器表面，并被控制到预处 理设定温度。使用直接蒸汽注入以将生物质快速地升温至预处理温度。 蒸汽压被调整和控制以维持在要求的预处理温度。反应器的底部收缩到 51mm。所有预处理过的材料通过在反应器底部的可替换的模具取出， 并被收集在支撑于厚壁的、带夹套的、且冷却的槽内的0.21m3尼龙袋 (Hotfill)中。
分析方法
糖、乙酰胺、乳酸和醋酸含量的测量
糖化液中的可溶糖(葡萄糖、纤维二糖、木糖、半乳糖、树胶醛糖 和甘露糖)、乙酰胺、乳酸和醋酸用高效液相色谱(Agilent Model 1100， Agilent Technologies，Palo Alto，CA)，使用有适当保护柱的Bio-Rad HPX-87P和Bio-Rad HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules， CA)分析测量。测量样品的pH，如有必要，用硫酸调节到5-6。然后样 品通过0.2微米针筒式滤器直接地注入到高效液相色谱小瓶中。高效液 相色谱跑柱条件如下：
HPX-87P(对于碳水化合物)：
注射容积：10-50微升，取决于浓度和探测器的限制
流动相：高效液相色谱级水，0.2微米，过滤并脱气的
流速：0.6毫升/分钟
柱温：80-85℃，保护柱温度＜60℃
检测器温度：尽可能接近主柱温
检测器：折射指数
运行时间：35分钟数据收集，外加15分钟后运转(带有为了后面洗 脱化合物，可能的校正时间)
Biorad Aminex HPX-87H(适于碳水化合物、乙酰胺、乳酸和乙酸)
注射容积：5-10微升，取决于浓度和检测器限制
流动相：0.01N硫酸，0.2微米过滤且脱气的
流速：0.6ml/分钟
柱温：55℃
检测器温度：尽可能接近于柱温
检测器：折射指数
运行时间：25-75分钟数据收集
在跑柱之后，从每种化合物的标准曲线确定样品浓度。
实施例1
在PEH反应器中的高生物质浓度的甘蔗渣糖化作用：
对照低浓度糖化作用
所述PEH反应器(按通常方法描述)，没有研磨介质，填充碾压的 1.27cm甘蔗渣(370g，干重基础)。从H65-7052甘蔗获取的甘蔗渣是 NIST参考材料RM8491，最初从Hawaii Sugar Planters Association， Kunia分会，Oahu，HI.获得。其在Wiley厂碾压成型以通过2mm筛， 其中细粒(+74目)被筛除。反应容器旋转地与在外表面上的冰接触而冷 却到4℃。真空装置被用于所述反应容器，且预先在冷藏室冷却到4℃ 的稀释氢氧化铵溶液，通过浸于冰水浴中的管道注入，以得到4g/100g 干重生物质的氨浓度，以及45g/100g总生物质-氨水溶液混合物的干重 生物质浓度。通过施加冰到旋转反应容器的表面，使装有氨和甘蔗渣的 反应容器冷却到4℃，并且在4℃旋转30分钟。在这时候内容物被转入 通用方法中描述的蒸汽枪反应器。一旦氨-甘蔗渣混合物被装入蒸汽枪反 应器，温度就增至145℃并且混合物在该温度下保持20分钟。在预处 理时间完毕时，甘蔗渣从蒸汽枪反应器卸料，通过2.54厘米的圆模头进 入闪蒸罐(flash tank)。预先处理过的甘蔗渣样品随后在摇瓶里被糖化 并且另一样品(大约163g干重)在PEH反应器里被糖化。占预先处理过 的生物质-糖化作用联合酶混合物总重量的5％干重的生物质在摇瓶中被 糖化，而占预先处理过的生物质-糖化作用联合酶混合物总重量30％干 重的生物质在PEH反应器中被糖化。通过加入50mM柠檬酸盐缓冲液 将糖化期间的pH控制在5.5，并且将温度维持在50℃。
对于PEH反应器糖化，大约476g(～163g干重)的预处理过的生物质 和22号陶瓷的研磨柱体加入反应容器。用固体柠檬酸将pH调节到5.0- 5.5。反应容器保持于控制在50℃的恒温箱室内部，并且以19rpm转速 轴向地旋转。未经预处理的甘蔗渣，也在摇瓶里以相对于预先处理过的 生物质-糖化作用联合酶混合物总重量的5％生物质干重糖化。所有糖化 作用在50℃和pH5.5的条件下由28.4mg/g纤维素Spezyme CP纤维素 酶和28.4mg/g纤维素Multifect木聚糖酶处理96hr。在下面表1中的 产率是释放的量占理论产率的百分值。
表1：甘蔗渣的预处理和糖化作用后的产率。
未预处理的 5％糖化 预处理过的 5％DWB糖化 预处理过的 30％DWB糖化 单体葡萄糖 0.5％ 16.6％ 23.3％ 葡萄糖总量 ND ND 36.4％ 单体木糖 1.3％ 15.6％ 17.2％ 木糖总量 ND ND 37.4％
ND：未测定
结果表明，同未经预处理的对照物比较起来，由很低含量的氨预处 理甘蔗渣使得能够完成显著的糖释放，并且于PEH反应器中在高含固 量浓度下的糖化作用对于释放糖很有效。
实施例2
在PEH反应器中的高生物质浓度的黄杨木锯屑的糖化作用：
对照低浓度糖化作用
无研磨介质的PEH反应器里以黄杨木锯屑(596g基于干重；从 Sawmiller Inc.，Haydenville，OH购买)装料。真空施加于所述反应容器， 注入稀释的氢氧化铵溶液，以得到氨浓度为6g/100g干重生物质，并 且使干重生物质浓度为44g/100g总生物质-氨水混合物。装有氨和黄杨 木锯屑的反应容器按照实施例1所述被冷却到4℃，并且在4℃旋转 30min。在这时候内容物被转入蒸汽枪反应器。一旦氨-杨木混合物被装 载入蒸汽枪反应器，温度就增至145℃，并且混合物在该温度下保持20 分钟。在预处理时间结尾时，黄杨木锯屑离开蒸汽枪反应器，通过2.54 厘米的圆模头进入闪蒸罐。预先处理过的黄杨木锯屑样品后来在摇瓶里 被糖化，如实施例1所述，并且另一样品在PEH反应器里糖化。相对于 预先处理生物质-糖化作用联合酶混合物总重量的5％干重的生物质在摇 瓶中被糖化，而相对于预先处理过的生物质-糖化作用联合酶混合物总重 量的30％干重的生物质在PEH反应器中被糖化(使用～279g干重预处理 过的锯屑)。未经预处理的黄杨木锯屑，同样以占预先处理生物质-糖化 作用联合酶混合物总重量的5％的干重生物质在摇瓶里同样地被糖化。 所有糖化作用在50℃和pH5.5的条件下用28.4mg/g的纤维素的 Spezyme CP纤维素酶和28.4mg/g纤维素的Multifect木聚糖酶处理96 hr。在下面表2中的产率是释放的量占理论产率的百分值。
表2：黄杨木锯屑的预处理并且糖化后的产率。
成份 未预处理的 5％DWB糖化 预处理过的 5％DWB糖化 预处理过的 30％DWB糖化 单体葡萄糖 2.7％ 11.1％ 20.6％ 葡萄糖总量 ND ND 30.0％ 单体木糖 0％ 17.9％ 18.9％ 木糖总量 ND ND 40.2％
ND：未测定
结果表明，实际释放的糖中，同未经预处理的对照物比较起来，由 很低含量的氨预处理甘蔗渣使得能够完成显著的糖释放，并且在PEH 反应器里的高干重生物质的糖化在糖释放方面比在摇瓶里更有效。
实施例3
在PEH反应器里预处理并且糖化更高干生物质浓度的玉米穗轴
所有的玉米穗轴用颚间隔大约0.95cm的颚式破碎机(2.2kW马达) 加工，然后用破块机(1.5kW马达，Franklin Miller Inc Livingston，NJ) 处理。继之以装备着1.9cm U.S.标准筛的Sweco筛子筛选。大约805g 破碎的物质被装入PEH反应器。玉米穗轴的水分含量大约7％。在装填 之前反应容器的气氛用氮冲洗5次。没有研磨介质不旋转的反应器在所 述实验开始以前被预热到75℃。当反应容器内部温度稳定在75℃时， 打开恒温箱里的旋转装置并且把转速调节到19rpm。然后，将适量的氢 氧化铵稀释溶液(其将氨浓度调节为占生物质干重6％和将干重生物质 的固含量调节为占生物质-氨混合物总重量50％)泵入反应器。占生物 质干重1重量％的乙醇同样地添加到溶液。氨溶液经由在约75℃水浴里 的加热线圈泵出，利用2-gal Parr反应器制造。已加热的稀释氢氧化铵 溶液通过注射喷枪注入反应容器并且喷涂在反应器里旋转并且滚动的 破碎的玉米穗轴上。反应器保持在75℃下，以19rpm的转速工作2小 时。在结束时，将真空(大约85kPa)施加于反应容器30分钟以除去氨 并且将反应器内容物的温度降到大约50℃。然后将二氧化碳注入到反应 器以替换真空，同时反应器被加压到103kPa并保持在该压力和50℃下 30分钟。
接着，反应器被减压、打开并且被添加研磨介质。利用注射喷枪将 内容物的pH通过注入1M pH4.8的柠檬酸缓冲液调节到大约5.5，加入 柠檬酸一水合物以增加柠檬酸缓冲液浓度到～75mM。柠檬酸缓冲液被 注入到反应器，接着加热到50℃，然后内容物在50℃19rpm的反应器 里培养1小时至平衡。当反应器旋转时利用注射喷枪注射柠檬酸缓冲 液，让缓冲液更均匀的喷射并且分布在预处理过的玉米穗轴颗粒上。反 应器从恒温箱处移走、打开，然后测定样品的pH。如果pH高于5.5， 则添加额外的固体柠檬酸一水合物，反应器通过在50℃下再混合一小时 而培养。该步骤被重复直到pH为大约5.5。一旦pH达到要求，浓度为 12.9mg/g纤维素Spezyme CP(Genencor)和每克中有5mg活性蛋白的纤维 素联合酶被输入所述反应器，其中纤维素联合酶组成为□-右旋葡糖苷 酶、木聚糖酶、□-右旋木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖酶。反应器在恒温箱中 以温度50℃、转数19rpm保持72小时。该预处理和糖化之后的单体葡 萄糖产率是62.0％，单体木糖产率是31.0％。总葡萄糖产率是75.2％， 总木糖产率是80.3％。
实施例4
玉米穗轴在更高的生物质浓度中用很低的氨和交替的条件预处理
整个的玉米穗轴用锤磨机(10英寸锤磨机，Glen Mills Inc.， Clifton，NH)加工到能透过1.27厘米筛。大约805g磨碎的玉米穗轴加 入到PEH反应器。玉米穗轴水分含量为大约7％。22号陶瓷的研磨柱 体(3.2cm直径×3.2cm长；E.R.Advanced Ceramics，East Palestine，OH) 同样被加到反应器。实验开始以前，反应器被预热到95℃，不旋转。开 始以前，反应容器抽真空(大约85kPa)，容器是密封的。当反应容器内 部温度稳定在95℃时，恒温箱里旋转装置被打开，调至转速19rpm。然 后，将适量氢氧化铵稀释溶液(其将氨浓度调节为占生物质干重6％和 将干重生物质的固含量调节为占生物质-氨混合物总重量50％)泵入反 应器。氨溶液经由在沸水浴里的加热线圈泵出，利用2-gal Parr反应器 制造。加热的稀释氢氧化铵溶液通过注射喷枪注入到反应容器，喷射在 反应器里旋转和滚动的破碎玉米穗轴上。反应器在95℃保温2小时，转 速保持在19rpm。结束时，反应容器抽真空(大约85kPa)30分钟，以除 去氨并且降低反应器的内容物的温度到大约50℃。把二氧化碳注入到反 应器以替换真空，反应器加压到103kPa表压并保持压力和50℃温度30 分钟。
接着反应器被减压、打开，通过注入1MpH4.8的柠檬酸缓冲液， 将内容物的pH调节到大约5.5，向该缓冲液中加入了柠檬酸一水合物并 溶解。加热到50℃后，反应器中注入柠檬酸缓冲液，被然后借助反应器 在50℃恒温、转速为19rpm保持1小时使得内容物平衡。反应器从恒 温箱处移走、打开，测定样品的pH。如果pH高于5.5，则添加额外的 固体柠檬酸一水合物，反应器通过在50℃下再混合一小时而培养。该步 骤被重复直到pH大约达到5.5。一旦pH达到要求，12.9mg/g纤维素 spezyme CP(Genencor)和每克中有5mg活性蛋白的纤维素联合酶被输 入所述反应器，其中纤维素联合酶组成为□-右旋葡糖苷酶、木聚糖酶、 □-右旋木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖酶。反应器于50℃和19rpm下在恒温箱 中保持72小时。该预处理和糖化之后，单体葡萄糖产率是50.7％，单体 木糖产率是35.7％。总葡萄糖和木糖产率分别是71.7％和89.8％。
实施例5
用少量的氨和另外的碱预处理玉米穗轴
所有的玉米穗轴用颚间隔大约0.95cm的颚式破碎机(2.2kW马达) 加工，然后用破块机(1.5kW马达，Franklin Miller Inc Livingston，NJ) 处理。继之以装备着1.9cm U.S.标准筛的Sweco筛子筛选。大约460g 破碎的玉米穗轴被装入PEH反应器。玉米穗轴的水分含量为大约7％。 不旋转的反应器在实验开始以前被预热到95℃。实验开始前，反应容器 抽真空(大约85kPa)，容器是密封的。当反应容器内部温度再稳定在95 ℃时，恒温箱里旋转装置被打开并且把转速调节到19rpm。然后，将适 量的氢氧化铵溶液(其提供氨浓度为3.2g氨/100g干重生物质)和NaOH (其提供浓度为1.9NaOH/100g干重生物质，维持固含量为30g干重生 物质/100g总重量生物质-氨混合物)泵入反应器。氨和额外的碱性溶液 经由在沸水浴里的加热线圈泵送，利用2-gal Parr反应器制造。已加热 的稀释氢氧化铵溶液通过注射喷枪注入反应容器并且喷涂在反应器里 旋转并且滚动的破碎的玉米穗轴上。接着，容器的真空被释放至大气压 力。反应器恒温保持在95℃30分钟，然后降温到85℃，保持4小时。 结束时，反应容器抽真空(大约85kPa)30分钟以除去氨和降低反应器内 容的温度到大约50℃。然后将二氧化碳注入到反应器以替换真空，反应 器加压到103kPa表压，在50℃保持压力30分钟。
接着，反应器减压、打开，通过注入大约75ml的1M、pH4.8的 柠檬酸缓冲液，调节内容物的pH至大约5.5，向该缓冲液中加入了柠 檬酸一水合物并溶解。加热到50℃后，柠檬酸缓冲液被注入到反应器， 且利用反应器在50℃和19rpm下培养1小时使得内容物平衡。当反应 器旋转时，利用注射喷枪注射柠檬酸缓冲液，让缓冲液更均匀的喷射并 且分布在预先处理玉米穗轴粒子上。反应器从恒温箱处移走、打开，然 后测定样品的pH。如果pH高于5.5，添加额外的固体柠檬酸一水合物， 反应器通过在50℃下混合再培养一小时。该步骤被重复直到pH大约 5.5。一旦pH达到要求，28.4mg/g纤维素的Spezyme CP(Genencor) 和28.4mg/g纤维素的Multifect，被输入所述反应器。反应器保持在恒 温箱中72小时，温度50℃、转速19rpm。该预处理和糖化之后，单体 葡萄糖产率是56.1％，单体木糖产率是39.5％。总葡萄糖产率和木糖产 率分别是82.8％和84.2％。这些值是两次实验的平均数。
实施例6
在室温下用PEH反应器预处理并且糖化高的干生物质浓度的玉米穗轴
整个的玉米穗轴用有颚间隔大约0.95厘米的颚式破碎机(2.2kW 马达)破碎，然后用破块机(1.5kW马达，Franklin Miller Inc)处理。继 之以装备着1.9cm U.S.标准筛的Sweco筛子筛选。大约460g破碎的玉 米穗轴被装入PEH反应器。玉米穗轴的水分含量大约7％。22号陶瓷研 磨柱体(3.2厘米直径×3.2厘米长；E.R.Advanced Ceramics，East Palestine， OH)同样被加到反应器。实验开始前，反应容器抽真空(大约85)，容器 是密封的。当反应器内部温度再稳定在室温下(22-26℃)时，恒温箱里 旋转装置被打开并且把转速调节到19rpm。然后，将适量的稀释氢氧化 铵溶液(其提供氨浓度为4g氨/100g干重生物质，并且维持固含量 为30g干重生物质/总重量生物质-氨混合物)泵入反应器。氢氧化铵稀 释溶液通过注射喷枪注入到反应容器并且喷射到反应器里旋转并且滚 动的破碎的玉米穗轴上。接着，各容器的真空被加压到大气压力。反应 器维持在室温(22-26℃)24小时。结束时，反应容器抽真空(大约81kPa) 维持30分钟以除去氨。然后二氧化碳注入到反应器以替换真空并且由 CO2加压反应器到103kPa表压，并且在室温下保持压力30分钟。
接着反应器被减压、打开，并且通过添加柠檬酸一水合物调节内容 物的pH至大约5.5。加热到50℃后，然后利用反应器在50℃和19rpm 下培养1小时使其平衡。反应器从恒温箱处移走、打开，测定样品的pH。 如果pH高于5.5，则添加额外的固体柠檬酸一水合物并且通过混合在50 ℃下培养反应器。该步骤被重复直到pH达到大约5.5。一旦pH达到要 求，将12.9mg/g纤维素的Spezyme CP(Genencor)和每克含5mg活性 蛋白的纤维素联合酶输入反应器，纤维素联合酶组成为□-右旋葡糖苷 酶、木聚糖酶、□-右旋木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖酶。反应器在恒温箱里 于50℃和19rpm下保持72小时。该预处理并且糖化之后，单体葡萄糖 产率是41.7％，单体木糖产率是25.4％。总葡萄糖和木糖产率分别是 50.1％和53.2％。该值是两次实验的平均数。
实施例7
在PEH反应器里预处理和糖化包含玉米穗轴和
其他废弃谷物样品混合物
废弃谷物样品选自：
1.#2黄色凹痕全玉米穗轴颗粒(从Agway购买)。
2.玉米穗轴颗粒去细菌的方法是快速胚芽法，开发者：Illinois大学 (Singh和Eckoff(1996)Cereal Chem.74：462-466)。原材料从Illinois 大学的Vijay Singh获得。
3..玉米穗轴颗粒通过快速纤维工艺处理以除去细菌和壳纤维 (US6254914)。原材料从Illinois大学的Vijay Singh获得。
4.啤酒用麦芽(brewers’grit)是从Cargill(Minneapolis，MN)获得。
废弃谷物指粮食处理后的剩余的固形物，其中淀粉转化为糖。废弃 谷物主要地通过基本的威士忌酒处理工艺制造。不同的原材料用淀粉降 解酶处理，以产生糖，制得的麦芽浆过滤，以回收滤饼固形物或者废弃 谷物。
原材料在Foss(North American HQ：Eden Prarie，MN) Cyclotec1093样品磨(上述的原材料1和2)中研磨成250微米或者在混合 器里(上述的原材料3和4)，然后在2L带夹套的搅拌玻璃反应容器里与 水和200mM CaCl2*H2O混合。混合物的pH由1N NaOH调节到6.5， 并占总量一半的α-淀粉酶(Spezyme HPA，Genencor International， Palo Alto，CA)。反应容器被加热到95℃，20分钟过后添加其余的α -淀粉酶。在95℃保持规定时间之后，容器冷却到70℃，用1M HCI 调节混合物的pH到4.5。添加葡糖淀粉酶(Gzyme 480，Genencor)，并 且降低温度到50℃，保持一整夜。此时，反应器冷却到低于40℃，内 容物通过孔径大小为10微米的涤纶滤布过滤。滤饼用水洗，最终滤渣 或者废弃谷物在105℃干燥整夜，并在室温下贮藏直到用于预处理实 验。每种原材料具体的反应条件列于表3中。
表3.废弃谷物样品的加工
原材料 原材料 添加量 (g) 水添 加量 (g) α淀粉酶 添加量 (ml) 95℃下 总时间 葡萄糖淀粉 酶添加量 (ml) 50℃下 总时间 (hr) 1 375 1095 3 150 3 17 2 505 1095 3 150 3 23 3 1180 500 6 120 3 17.5 4 1160 500 6 120 3 18
整玉米穗轴用颚间隔大约0.95cm的颚式破碎机(2.2kW马达)处 理，然后用破块机(1.5kW马达，Franklin Miller Inc)处理。继之以装备 着1.9cm U.S.标准筛的Sweco筛子筛选。破碎的玉米穗轴混入一种如表 3所列的废弃谷物，装入PEH反应器。废弃谷物大约是在反应器里的干 重生物质总数的10％。装入的总干生物质大约是473g。实验开始以前 每个装料的反应器在柱体恒温箱里被预热到95℃，不旋转。反应容器抽 真空(大约85kPa)，且所述容器密封。当每个容器内部温度稳定在95℃ 时，开始以19rpm转速旋转。添加氢氧化铵稀释溶液以提供氨浓度为4 g氨/100g干重生物质和固含量为30g干重的生物质/100g生物质总重 量-氨混合物。接着容器的真空被解除到大气压力。反应器在95℃保持 30分钟，然后温度降低到85℃，保持4小时并旋转。结束时，反应容 器抽真空(大约85kPa表压)30分钟以除去氨并且降低每个反应器的 内容物的温度到大约50℃。然后注入二氧化碳到每个反应器以解除真空 并将反应器加压到138kPa的CO2表压，然后在此压力下于50℃旋转30 分钟。
接着，反应器被减压、打开，通过注入75ml 1M、pH4.8柠檬酸缓 冲液，调节内容物的pH到大约5.5，向该缓冲液中加入了柠檬酸一水合 物并溶解。加热到50℃后，柠檬酸缓冲液被注入到反应器，且利用反应 器在50℃和19rpm下培养1小时使得内容物平衡。反应器从恒温箱移 走、打开，然后测定样品的pH。如果pH高于5.5，则添加额外的固体 柠檬酸一水合物，且反应器在50℃下旋转来再培养一小时。如有必要， 该过程被重复直到pH大约5.5。一旦pH达到要求，将28.4mg/g纤 维素的SpezymeCP纤维素酶(Genencor)和10.1mg活性蛋白/g纤维素 的Diversa D2鸡尾酒加入反应器，Diversa D2鸡尾酒含有β-葡糖苷酶、 木聚糖酶、β-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖酶。反应器在恒温箱中以温度 50℃、19rpm下保持72小时。该预处理和糖化之后，糖产率按通用方 法中所述测定，葡萄糖和木糖产率，以葡聚糖和木聚糖总数为基础，显 示于表4。玉米穗轴加上废弃谷物联合生物质样品的产率与玉米穗轴单 独的产率相似。
表4.预处理和糖化结合的生物质材料后的糖产率
单体葡萄糖 葡萄糖 总产率 单体木糖 产率 木糖总产率 仅有玉米穗 68.2％ 85.6％ 41.8％ 88.9％
轴(2次的 均值) 玉米穗轴+ 快速胚芽废 弃物颗粒 67.9％ 86.5％ 49.0％ 86.5％ 玉米穗轴+ 快速纤维废 弃物颗粒 69.5％ 88.3％ 54.6％ 87.3％ 玉米穗轴+ 啤酒用麦芽 废弃物颗粒 65.6％ 79.5％ 48.3％ 83.2％
实施例8
在PEH反应器里预处理和糖化结合的生物质
(包含玉米穗轴、废弃谷物和其他的组分)
破碎的玉米穗轴和威士忌酒废弃物颗粒，用实施例7所述方法制 备，象实施例7那样在PEH反应器里混和。另外，加入其他谷类物的组 分。在一个样品中，以5g/100g总干重生物质比例添加淀粉(Sigma S4126，lot#093K0033)。在另一样品里，添加玉米油(Sysco Classic玉 米油，lot#_4119095)，其含量水平为大约2g/100g总干生物质。样 品被预先处理并且糖化，如例7所述。结果显示于表4。该结果也与表3 所示仅有玉米穗轴相当。
表4.预处理和糖化玉米穗轴、废弃物颗粒和另外的谷物成分的糖产率
单体葡萄糖 葡萄糖 总产率 单体木糖 产率 木糖总产率 玉米穗轴+威 士忌废弃物颗 粒+淀粉 70.4％ 90.2％ 48.4％ 96.1％ 玉米穗轴+威 士忌废弃物颗 粒+油 79.2％ 87.5％ 54.9％ 101.4％
实施例9
在PEH反应器里预处理和糖化包含玉米穗轴和玉米纤维的混合生物质
破碎的玉米穗轴和Cargill Bran 80(Cargill，Minnetonka，MN)， 玉米纤维被混合，使得纤维大约是总的生物质干重的10％。结合的生物 质被预处理并且糖化，如实施例7所述。所得产率如表5所示。玉米穗 轴加玉米纤维结合生物质的产率与单独的玉米穗轴样品的产率相似。
表5：预处理与玉米纤维结合的玉米穗轴所得的糖产率。
单体葡萄 糖 葡萄糖 总产率 单体木糖 产率 木糖总产率 玉米穗轴+ Cargill Bran 80 66.4％ 82.3％ 47.0％ 83.5％