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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611201775.0 (22)申请日 2016.12.23 (71)申请人 苏州中联化学制药有限公司 地址 215212 江苏省苏州市吴江区黎里镇 交通东路9号 申请人 苏州第三制药厂有限责任公司 (72)发明人 周自金罗新祖陈锋黄军豪 张波刘要武 (74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有 限公司 32103 代理人 孙仿卫汪青 (51)Int.Cl. C12P 35/04(2006.01) (54)发明名称 一种酶法合成头孢羟氨苄的方法 (57)摘要 本发明涉及一。
2、种酶法合成头孢羟氨苄的方 法， 以7-ADCA为起始原料， 与D-对羟基苯甘氨酸 甲酯或D-对羟基苯甘氨酸乙酯。 在青霉素酰化酶 存在条件下， 在水中直接固体投料， 控温1025 反应， 反应结束后经分离得到头孢羟氨苄粗品 和酶反应母液。 头孢羟氨苄粗品经过进一步提纯 得到白色头孢羟氨苄产品。 酶反应母液中加入 -萘酚或2,7-二羟基萘反应得到头孢羟氨苄复 合物。 头孢羟氨苄复合物可经过进一步处理回收 头孢羟氨苄， 提高头孢羟氨苄的回收率。 本发明 方法得到的产品收率高， 纯度高， 产品外观呈白 色， 不需要化学法的多步反应以及使用多种溶剂 和辅料， 实现了头孢羟氨苄的绿色合成。 权利要求书1。
3、页 说明书4页 CN 107058447 A 2017.08.18 CN 107058447 A 1.一种酶法合成头孢羟氨苄的方法， 其特征在于， 所述方法包括以下步骤： （1） 向反应器中加入7-ADCA、 D-对羟基苯甘氨酸甲酯或D-对羟基苯甘氨酸乙酯、 水和青 霉素酰化酶， 在温度1025下进行反应， 反应经HPLC测定7-ADCA残留在3mg/mL以下， 结 束反应， 然后经分离得到青霉素酰化酶和头孢羟氨苄粗品混合液， 所述头孢羟氨苄粗品混 合液经分离得到头孢羟氨苄粗品和母液， 母液经多次洗涤青霉素酰化酶后分离得到青霉素 酰化酶和酶反应母液； （2） 将步骤 （1） 得到的所述头孢羟氨。
4、苄粗品溶解在水中得到粗品溶解液， 控制温度为5 15， 用酸调整体系的pH值为0.30.9， 脱色， 过滤， 用碱调整体系的pH值为3.44.5， 重 结晶析出头孢羟氨苄， 过滤得到重结晶母液和湿头孢羟氨苄， 干燥得到白色头孢羟氨苄； （3） 在步骤 （1） 得到的酶反应母液加入 -萘酚或2,7-二羟基萘， 控制温度为1025， 搅拌反应2.0h5.0h， 过滤， 得到头孢羟氨苄复合物。 2.根据权利要求1所述的酶法合成头孢羟氨苄的方法， 其特征在于， 所述方法还包括回 收头孢羟氨苄复合物的步骤， 其具体实施为： 将所述头孢羟氨苄复合物、 水、 乙酸乙酯加入 反应器， 控制温度为1525， 用。
5、酸调体系pH为0.30.9， 分层， 得到水相层， 水相层用碱调 pH值为3.44.5， 重结晶析出头孢羟氨苄， 过滤， 干燥得到白色头孢羟氨苄， 或将水相层加入 步骤 （2） 的粗品溶解液中。 3.根据权利要求2所述的酶法合成头孢羟氨苄的方法， 其特征在于： 所述回收头孢羟氨 苄复合物的步骤中， 所述水的用量为所述头孢羟氨苄复合物的质量的210倍， 所述乙酸乙 酯的用量为所述头孢羟氨苄复合物的质量的210倍。 4.根据权利要求1或2所述的酶法合成头孢羟氨苄的方法， 其特征在于： 所述碱为氨水、 Na2CO3、 NaHCO3中的一种或多种的组合。 5.根据权利要求1所述的酶法合成头孢羟氨苄的方。
6、法， 其特征在于： 所述方法还包括对 步骤 （2） 得到的重结晶母液进行处理的步骤， 其具体实施为： 将所述重结晶母液加入步骤 （3） 的酶反应母液中。 6.根据权利要求1所述的酶法合成头孢羟氨苄的方法， 其特征在于： 步骤 （1） 中， 所述7- ADCA、 D-对羟基苯甘氨酸甲酯或D-对羟基苯甘氨酸乙酯的投料摩尔比为1:1.051.25， 所述 青霉素酰化酶的添加量为所述7-ADCA的质量的0.81.5倍， 所述的水的添加量为每1g 7- ADCA添加515mL所述的水。 7.根据权利要求1所述的酶法合成头孢羟氨苄的方法， 其特征在于： 步骤 （1） 中， 青霉素 酰化酶的分离采用1001。
7、20目筛网进行分离青霉素酰化酶。 8.根据权利要求1所述的酶法合成头孢羟氨苄的方法， 其特征在于： 步骤 （1） 中， 将分离 得到的青霉素酰化酶加入水中， 用氨水调体系pH为7.08.0， 控制温度1025， 活化1 4h， 活化后的青霉素酰化酶可重复使用。 9.根据权利要求1所述的酶法合成头孢羟氨苄的方法， 其特征在于： 步骤 （2） 中， 所述水 的添加量为所述头孢羟氨苄粗品的质量的2.08.0倍。 10.根据权利要求1所述的酶法合成头孢羟氨苄的方法， 其特征在于： 步骤 （3） 中， 所述 -萘酚或2， 7-二羟基萘的添加量为所述7-ADCA的质量0.20.6倍。 权利要求书 1/1 。
8、页 2 CN 107058447 A 2 一种酶法合成头孢羟氨苄的方法 技术领域 0001 本发明属于原药技术领域， 具体涉及一种酶法合成头孢羟氨苄的方法。 背景技术 0002 头孢羟氨苄 （Cefadroxil） 是第一代口服头孢类抗生素， 具有活性强， 抗菌谱广， 口 服吸收良好， 副作用低以及体内稳定的特点。 在临床上广泛用于各种感染的治疗。 头孢羟氨 苄在2010年之前合成的方法主要是化学法的合成， 一般通过母核7-ADCA为起始原料， 在二 氯甲烷中， 硅烷化保护后与D-对羟基苯甘氨酸邓盐和氯甲酸乙酯形成的混酐在低温深冷的 条件下进行缩合， 继而形成DMF复合物， 再水中转晶得到头孢。
9、羟氨苄。 其制备工艺所用原料 以及辅料较多， 要使用大量的溶剂如二氯甲烷、 DMF、 丙酮以及其它辅料如六甲基二硅烷胺、 氯甲酸乙酯或氯甲酸甲酯、 四甲基胍等， 反应条件较苛刻， 需要低至-50以下的深冷， 成本 高， 污染大。 随着生物技术的发展和酶基因改造技术的突破。 用生物合成技术代替传统化学 法逐渐成为一种新的药物合成的发展趋势。 生物酶法合成具有污染少， 仅以水为媒介， 合成 成本低， 比化学法副反应少， 质量高的特点。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足， 提供一种酶法合成头孢羟氨 苄的方法。 0004 为解决以上技术问题， 本发明采用如下技术方案： 。
10、一种酶法合成头孢羟氨苄的方法， 所述方法包括以下步骤： （1） 向反应器中加入7-ADCA、 D-对羟基苯甘氨酸甲酯或D-对羟基苯甘氨酸乙酯、 水和青 霉素酰化酶， 在温度1025下进行反应， 反应经HPLC测定7-ADCA残留在3mg/mL以下， 结 束反应， 然后经分离得到青霉素酰化酶和头孢羟氨苄粗品混合液， 所述头孢羟氨苄粗品混 合液经分离得到头孢羟氨苄粗品和母液， 母液经多次洗涤青霉素酰化酶后分离得到青霉素 酰化酶和酶反应母液； （2） 将步骤 （1） 得到的所述头孢羟氨苄粗品溶解在水中得到粗品溶解液， 控制温度为5 15， 用酸调整体系的pH值为0.30.9， 脱色， 过滤， 用碱调。
11、整体系的pH值为3.44.5， 重 结晶析出头孢羟氨苄， 过滤得到重结晶母液和湿头孢羟氨苄， 干燥得到白色头孢羟氨苄； （3） 在步骤 （1） 得到的酶反应母液加入 -萘酚或2,7-二羟基萘， 控制温度为1025， 搅拌反应2.0h5.0h， 过滤， 得到头孢羟氨苄复合物。 0005 根据本发明的进一步实施方案： 所述方法还包括回收头孢羟氨苄复合物的步骤， 其具体实施为： 将所述头孢羟氨苄复 合物、 水、 乙酸乙酯加入反应器， 控制温度为1525， 用酸调体系pH为0.30.9， 分层， 得 到水相层， 水相层用碱调pH值为3.44.5， 重结晶析出头孢羟氨苄， 过滤， 干燥得到白色头孢 羟氨。
12、苄， 或将水相层加入步骤 （2） 的粗品溶解液中。 0006 优选地， 所述回收头孢羟氨苄复合物的步骤中， 所述水的用量为所述头孢羟氨苄 说明书 1/4 页 3 CN 107058447 A 3 复合物的质量的210倍， 所述乙酸乙酯的用量为所述头孢羟氨苄复合物的质量的210倍。 0007 所述碱为氨水、 Na2CO3、 NaHCO3中的一种或多种的组合。 0008 所述方法还包括对步骤 （2） 得到的重结晶母液进行处理的步骤， 其具体实施为： 将 所述重结晶母液加入步骤 （3） 的酶反应母液中。 0009 步骤 （1） 中， 所述7-ADCA、 D-对羟基苯甘氨酸甲酯或D-对羟基苯甘氨酸乙酯。
13、的投料 摩尔比为1:1.051.25， 所述青霉素酰化酶的添加量为所述7-ADCA的质量的0.81.5倍， 所 述的水的添加量为每1g 7-ADCA添加515mL所述的水。 0010 步骤 （1） 中， 青霉素酰化酶的分离采用100120目筛网进行分离青霉素酰化酶。 0011 步骤 （1） 中， 将分离得到的青霉素酰化酶加入水中， 用氨水调体系pH为7.08.0， 控 制温度1025， 活化14h， 活化后的青霉素酰化酶可重复使用， 其中， 水的用量为青霉素 酰化酶重量的210倍。 0012 步骤 （1） 中， 所述反应的反应时间为1.56h。 0013 步骤 （2） 中， 所述水的添加量为所。
14、述头孢羟氨苄粗品的质量的2.08.0倍。 0014 步骤 （2） 中， 所述脱色采用活性炭脱色， 活性炭的添加量为所述7-ADCA质量的0.03 0.1， 脱色时间为0.51h。 0015 步骤 （2） 中， 所述重结晶时间为25h。 0016 步骤 （2） 中， 所述干燥的干燥温度为4565。 0017 步骤 （3） 中， 所述 -萘酚或2， 7-二羟基萘的添加量为所述7-ADCA的质量0.20.6 倍。 0018 本发明中的青霉素酰化酶购自湖南福来格生物技术有限公司， 本发明中的其它原 料均可市购获得。 0019 由于上述技术方案的实施， 本发明与现有技术相比具有如下优点： 本发明通过对制。
15、备方法的改进， 在水中直接合成、 分离、 提纯、 重结晶得到头孢羟氨苄， 母液经回收复合物， 进一步提高收率。 所得产品收率高， 纯度高， 产品外观呈白色， 不需要化 学法的多步反应以及使用多种溶剂和辅料， 实现了头孢羟氨苄的绿色合成。 0020 本申请的发明方法可直接加入水中， 不需要文献报道的酸碱溶解。 能够进行固液 反应， 操作更为简便。 本发明的制备方法简单易行， 条件温和， 安全环保， 更适宜于工业化生 产。 具体实施方式 0021 下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。 0022 实施例中青霉素酰化酶购自湖南福来格生物技术有限公司， 型号SIPA-IV。 0023 实施例1 在酶。
16、反应器中， 投入5 kg 7-ADCA， D-对羟基苯甘氨酸甲酯5 kg， 纯化水30 kg， 青霉素 酰化酶4 kg， 控温1520反应， 4h后取样测7-ADCA残留， 应小于3mg/mL， 合格后， 经100目 筛网分离得到青霉素酰化酶和头孢羟氨苄粗品混合液， 头孢羟氨苄粗品混合液经离心分 离， 离心分离后得到离心母液和头孢羟氨苄粗品， 离心母液循环回反应器中洗涤酶， 多次循 环分离、 离心直至洗涤液清澈为止， 得到青霉素酰化酶和酶反应母液。 酶反应母液转入100L 釜内待回收复合物。 说明书 2/4 页 4 CN 107058447 A 4 0024 所得头孢羟氨苄粗品， 加入另一10。
17、0L釜内， 加入40L纯化水， 用浓盐酸调pH值至 0.5， 溶清， 控温1015， 加入活性炭0.5 kg， 脱色1h后过滤， 滤液用10% Na2CO3溶液调pH 值至3.53.8， 养晶4h后过滤， 得到结晶母液和头孢羟氨苄湿品， 头孢羟氨苄湿品少量水洗 涤， 转入旋蒸中， 55真空干燥至水分合格， 得6.8 kg白色头孢羟氨苄， 收率76.3%， 纯度 99.6%， 外观呈白色。 0025 结晶母液转入上述酶反应母液中， 加入2， 7-二羟基萘1.5 kg， 控温1520， 搅 拌反应4h， 分离， 水洗， 干燥， 得头孢羟氨苄2， 7-二羟基萘复合物2.2 kg。 0026 分离得到。
18、的青霉素酰化酶中加入酶质量的210倍纯化水， 用氨水调pH值7.08.0， 控温1025， 活化14h， 滤干， 洗涤， 活化后的青霉素酰化酶可重复使用。 0027 实施例2 在酶反应器中， 投入5kg7-ADCA， D-对羟基苯甘氨酸乙酯5.5kg， 纯化水30kg， 青霉素酰 化酶4kg， 控温1520反应， 5h取样测7-ADCA残留， 应小于3mg/mL， 合格后， 经120目筛网 分离得到青霉素酰化酶和头孢羟氨苄粗品混合液， 头孢羟氨苄粗品混合液经离心分离后得 到离心母液和头孢羟氨苄粗品， 离心母液循环回反应器中洗涤酶， 多次循环分离、 离心直至 洗涤液清澈为止， 得到青霉素酰化酶和。
19、酶反应母液。 0028 所得头孢羟氨苄粗品， 加入另一100L釜内， 加入40L纯化水， 用浓盐酸调pH值至 0.5， 溶清， 控温1015， 得到头孢羟氨苄粗品溶解液。 0029 在100L反应器内加入实施例1得到的头孢羟氨苄2， 7-二羟基萘复合物2.2 kg， 水 10L， 5L乙酸乙酯， 滴加浓盐酸溶解， 控温1015， pH值0.30.5溶清， 分出乙酸乙酯， 溶清 液加入上述头孢羟氨苄粗品溶解液中， 加入活性炭0.5kg， 脱色1h后过滤， 滤液用5%氨水溶 液调pH值至3.53.8， 养晶4h后过滤， 得到结晶母液和头孢羟氨苄湿品， 头孢羟氨苄湿品少 量水洗涤， 湿头孢羟氨苄转入。
20、旋蒸中， 55真空干燥至水份合格， 得头孢羟氨苄产品 7.85kg， 收率88.1%， 纯度99.5%， 外观呈白色。 0030 结晶母液转入酶反应母液中， 然后加入 -萘酚1.4kg， 控温1520， 搅拌反应 4h， 分离， 水洗， 干燥， 得头孢羟氨苄 -萘酚复合物2.0kg。 0031 实施例3 在酶反应器中， 投入5kg7-ADCA， D-对羟基苯甘氨酸乙酯5.5kg， 纯化水30kg， 青霉素酰 化酶5kg， 控温1520反应， 5h取样测7-ADCA残留， 应小于3mg/mL， 合格后， 经120目筛网 分离得到青霉素酰化酶和头孢羟氨苄粗品混合液， 头孢羟氨苄粗品混合液经离心分离。
21、后得 到离心母液和头孢羟氨苄粗品， 离心母液循环回反应器中洗涤酶， 多次循环分离、 离心直至 洗涤液清澈为止， 得到青霉素酰化酶和酶反应母液。 0032 所得头孢羟氨苄粗品， 加入另一100L釜内， 加入40L纯化水， 用浓盐酸调pH值至 0.5， 溶清， 控温1015， 得到头孢羟氨苄粗品溶解液。 0033 酶反应母液中加入 -萘酚2kg， 控温1520， 搅拌反应4h， 分离， 水洗， 干燥， 得 头孢羟氨苄 -萘酚复合物2.5kg。 0034 在100L反应器内加入上步所得头孢羟氨苄 -萘酚复合物2.5kg， 水10L， 5L乙酸乙 酯， 滴加浓盐酸溶解， 控温1015， pH值0.30。
22、.5溶清， 分出乙酸乙酯， 溶清液加入上述头 孢羟氨苄粗品溶解液中， 加入活性炭0.5kg， 脱色1h后过滤， 滤液用5%碳酸氢钠溶液调pH值 至3.53.8， 养晶4h后过滤， 少量水洗涤， 转入旋蒸中， 55真空干燥至水份合格， 得头孢羟 说明书 3/4 页 5 CN 107058447 A 5 氨苄产品7.7kg， 收率86.4%， 纯度99.6%， 外观呈白色。 0035 对比例1 在酶反应器中， 投入5 kg 7-ADCA， D-对羟基苯甘氨酸甲酯5 kg， 纯化水30 kg， 青霉素 酰化酶1kg， 控温58反应， 6h后取样测7-ADCA残留， 应小于3mg/mL， 合格后， 经。
23、100目筛 网分离得到青霉素酰化酶和头孢羟氨苄粗品混合液， 头孢羟氨苄粗品混合液经离心分离， 离心分离后得到离心母液和头孢羟氨苄粗品。 0036 所得头孢羟氨苄粗品， 加入另一100L釜内， 加入40L纯化水， 用浓盐酸调pH值至 0.5， 溶清， 控温1015， 用5% Na2CO3溶液调pH值至3.53.8， 养晶4h后过滤， 得到结晶母 液和头孢羟氨苄湿品， 头孢羟氨苄湿品少量水洗涤， 转入旋蒸中， 55真空干燥至水份合 格， 得6.5kg白色头孢羟氨苄， 收率72.9%， 纯度98.7%， 外观呈白色。 0037 以上对本发明做了详尽的描述， 其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本 发明的内容并加以实施， 并不能以此限制本发明的保护范围， 且本发明不限于上述的实施 例， 凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 说明书 4/4 页 6 CN 107058447 A 6 。