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1、(10)授权公告号 CN 101429187 B (45)授权公告日 2012.01.25 CN 101429187 B *CN101429187B* (21)申请号 200810233399.2 (22)申请日 2008.12.18 C07D 311/86(2006.01) A61K 31/352(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 31/12(2006.01) (73)专利权人 重庆理工大学 地址 400054 重庆市巴南区李家沱红光大道 69 号 (72)发明人 胥秀英 傅善权 郑一敏 周惠 (74)专利代理机构 重庆博凯知识产权代理有限 公司 50212 。
2、代理人 张先芸 CN 1650927 A,2005.08.10, 说明书第 1 页 . CN 1391928 A,2003.01.22, 说明书第 3 页 . 张有理 . 川东獐牙菜 ( 口山 ) 酮的研究 . 中 国优秀博硕士学位论文全文数据库 ( 硕士 ) .2007,( 第 2007/05 期 ), 绪论第 3 页， 第三章 3.2 节和 3.5.1 节 . 徐康平等 . 高效液相色谱法测定川东獐牙菜 中多种成分的含量 .药物分析杂志 .2005, 第 25 卷 ( 第 1 期 ),14-16. (54) 发明名称 一种酮化合物及其制备方法和用途 (57) 摘要 本发明公开了一种酮化合物。
3、， 它是以传 统中草药川东獐牙菜 (Swertia davidi Franch) 为原料， 经过超临界CO2萃取技术， 色谱制备分离， 获得去甲基雏菊叶龙胆酮。经抗乙型肝炎病毒和 保肝实验表明， 该化合物抗乙型肝炎病毒抑制作 用明显， 对 CCl4和 D- 氨基半乳糖所致急性或慢性 肝损伤有明显保护作用， 在制备抗乙型肝炎病毒 药物中将得到良好的应用。本发明制备方法的超 临界CO2萃取技术与传统溶剂提取方法相比， 具有 工艺稳定性和重现性较好的特点， 而且总酮 提取率高， 效率高、 生产周期短， 生产成本较低。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 徐奇 (19)中华人民共和国国家。
4、知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 CN 101429187 B1/1 页 2 1. 一种酮化合物的制备方法， 其特征在于， 所述化合物化学名为 1， 3， 5， 8-tetrahydroxyxanthone， 又名去甲基雏菊叶龙胆酮， 化学结构如下 ： 所述化合物的制备方法包括如下步骤 ： (1) 取川东獐牙菜 (Swertia davidi Franch) 全草， 在 60-80下烘干， 粉碎成 100 目 得到粉状药材 ； (2) 将步骤 (1) 获得的粉状药材按萃取压力 20-35MPa， 萃取温度 30-45， 萃取时间为 60-120min， 夹带剂为。
5、体积分数为95的乙醇， 进行超临界CO2萃取， 获得去甲基雏菊叶龙胆 酮 ； 其中， 所述 95的乙醇与粉状药材之比为 1-1.2L 1kg ； (3) 采用十八烷基硅烷键合硅胶柱， 流动相甲醇 - 水之比为 35-65 65-35， 检测波长 254nm， 室温条件下对步骤 (2) 获得的去甲基雏菊叶龙胆酮进行样品制备， 收集样品溶液 ； (4) 对步骤 (3) 获得的样品溶液进行减压浓缩 ； (5) 然后， 对步骤 (3) 的减压浓缩， 在 60-80条件下， 干燥 3-5 小时 ； (6) 最后， 获得去甲基雏菊叶龙胆酮含量为 90的酮化合物。 权 利 要 求 书 CN 10142918。
6、7 B1/6 页 3 一种酮化合物及其制备方法和用途 技术领域 0001 本发明涉及医药技术领域， 具体是一种富含去甲基雏菊叶龙胆酮的酮化合物 的制备方法， 以及酮化合物用于抗病毒的作用。 背景技术 0002 现有技术中， 多份文献公开了从川东獐牙菜 (Swertia davidi Franch， 俗称水黄 连、 鱼胆草或水灵芝等 ) 中分离得到一系列酮的方法， 以及所述酮的用途。例如， CN1650927 公开的 “一种含有酮有效成分的药物” ， 可以用于制备抗菌和治疗动脉粥样 硬化的药物等。但去甲基雏菊叶龙胆酮的酮化合物用于抗乙肝病毒作用、 保肝作用、 抗 疱疹病毒和流感病毒， 以及抗氧化。
7、作用的研究却未见报道。注 ： 本文中的 “” 为左右部首 构成的一个字。 0003 乙型病毒性肝炎， 特别是慢性乙型肝炎 (Chronic Viral Hepatitis B) 为一种严 重危害人类健康的常见病， 已经成为全球性重要公共卫生问题之一， 引起世界各国的关注。 我国是乙型病毒性肝炎疾病高发区， 平均年发病率为 120-140 万， 乙型肝炎病毒感染率高 达 57.63， 即全国至少有 6 亿人感染过， 乙型肝炎表抗原阳性率 9.75， 约有 1.2 亿人， 占 全球的1/3， 其中约1/4将发展为慢性肝病， 部分患者可发展为肝硬化， 甚至演变为肝癌。 目 前有症慢性乙肝患者2000。
8、多万人， 每年有23.7万人死于乙型肝炎相关的疾病， 其中有15.6 万人死于肝癌， 全球每年有 100 万以上的人死于 HBV 感染及其相关疾病。乙型肝炎不仅严 重危害人们的健康， 而且还为国家带来严重的社会经济负担。 据统计， 我国每年用于治疗慢 性肝炎、 肝硬化、 肝癌的直接医疗耗费约 300 亿元人民币， 每年因乙肝造成的直接经济损失 达 500 亿元。乙型肝炎已经成为全球性的重大公共健康问题之一。 0004 一般地， 乙型病毒性肝炎治疗主要包括抗病毒治疗、 免疫调节治疗和保肝抗炎治 疗， 其中抗病毒治疗是关键。药物类别有化学药物、 生物药物和中药， 从结构方面看， 也分 三类大类， 。
9、一类为肽类药物， 如干扰素、 胸腺素 ； 另一类为核苷类药物， 如拉米夫定、 阿德福 韦酯、 恩替卡韦等 ； 第三类为多糖类药物， 如猪苓多糖、 紫芝多糖和灵芝多糖等。干扰素临 床疗效不佳， 不良反应较多， 耐受性差。核苷类药物是近年来抗病毒药物研究的热点， 进展 很快， 该类药物在人体内， 通过磷酸化， 成为三磷酸核苷类似物后， 具有抗病毒作用， 可以抑 制病毒的 DNA 多聚酶和逆转录酶的活性， 并与核苷竞争性掺入病毒的 DNA 链， 终止 DNA 链 的延长和合成， 使病毒的复制受到抑制而发挥抗病毒作用， 代表药物如拉咪呋啶， 泛昔洛韦 (Famciclovir)、 阿地福韦 (Adef。
10、ovir)、 恩他卡韦 (Entacavir)、 单磷酸阿糖腺苷 (Ara-Amp) 和膦甲酸钠 (phosphonoformate) 等， 能迅速抑制病毒复制， 耐受性好。但服用时间较长， 部 分病例产生病毒变异， 停药后复发率较高。具有免疫调节作用的胸腺素和多糖类药物缺乏 针对性， 疗效还不够满意， 尚有待进一步研究。 0005 自上世纪 70 年代之后， 应用中药治疗慢性乙肝的报道日益增多， 且取得一定疗 效。其优越性表现在能够明显改善患者症状及生活质量， 且能通过多靶点作用发挥保肝和 免疫调节作用， 但物质基础不清楚， 作用机理不明确， 疗效不稳定。 说 明 书 CN 10142918。
11、7 B2/6 页 4 0006 综上可见， 乙型肝炎治疗仍缺乏理想的治疗药物， 在现有抗病毒药物结构中也未 见本发明涉及的酮类化合物。 发明内容 0007 本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足， 为开发治疗乙型肝炎药物提供 一种新的先导酮化合物及其制备方法 ； 同时， 提供酮化合物用于抗乙肝病毒作用和 保肝作用、 抗疱疹病毒和流感病毒， 以及抗氧化的药物。 0008 本发明的目的是这样实现的 ： 一种酮化合物， 其特征在于该化合物化学名为 1， 3， 5， 8-tetrahydroxyxanthone， 又名去甲基雏菊叶龙胆酮， 化学结构如下 ： 0009 0010 其中， 去甲基雏菊叶。
12、龙胆酮含量不低于 90。 0011 进一步的特征是， 将该化合物用于抗乙型肝炎病毒药物。 0012 进一步的特征是， 将该化合物用于制备化学物质引起的急性和慢性肝损伤药物。 0013 进一步的特征是， 将该化合物用于抗疱疹病毒和流感病毒药物。 0014 进一步的特征是， 将该化合物用于抗氧化药物。 0015 一种制备权利要求 1 所述酮化合物的方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： 0016 (1)取川东獐牙菜(Swertia davidi Franch)全草， 在60-80下烘干， 粉碎成100 目得到粉状药材 ； 0017 (2) 将步骤 (1) 获得的粉状药材按萃取压力 20-35MPa。
13、， 萃取温度 30-45， 萃取时 间为 60-120min， 夹带剂为体积分数为 95的乙醇， 进行超临界 CO2萃取， 获得去甲基雏菊 叶龙胆酮 ； 其中， 所述 95的乙醇与粉状药材之比为 1-1.2L 1kg ； 0018 (3) 采用十八烷基硅烷键合硅胶柱， 流动相甲醇 - 水之比为 35-65 65-35， 检测 波长 254nm， 室温条件下对步骤 (2) 获得的去甲基雏菊叶龙胆酮进行样品制备， 收集样品溶 液 ； 0019 (4) 对步骤 (3) 获得的样品溶液进行减压浓缩 ； 0020 (5) 然后， 对步骤 (3) 的减压浓缩， 在 60-80条件下， 干燥 3-5 小时 。
14、； 0021 (6) 最后， 获得去甲基雏菊叶龙胆酮含量不低于 90的酮化合物。 0022 相比现有技术， 本发明具有如下优点 ： 0023 (1) 本发明提供一种从传统的中草药川东獐牙菜 (Swertia davidi Franch) 中， 采用超临界 CO2萃取和色谱技术制备获得去甲基雏菊叶龙胆酮， 化学名为 1， 3， 5， 8-tetrahydroxyxanthone。去甲基雏菊叶龙胆酮含量不低于 90。 0024 (2) 采用的 CO2为超临界流体技术的一种溶剂， 乙醇为夹带剂， 主要起增加有效成 分的溶出， 使提取更完全的作用， 提高提取率 ； 采用二氧化碳作溶剂， 因其临界温度为。
15、常温， 且无毒、 无嗅、 无污染、 安全和价廉。本发明制备方法的超临界 CO2萃取技术与传统溶剂提 说 明 书 CN 101429187 B3/6 页 5 取方法相比， 具有工艺稳定性和重现性较好的特点。 0025 (3) 本发明总酮提取率高， 效率高、 生产周期短， 生产成本较低， 无三废排出。 0026 (4) 本发明的化学成分去甲基雏菊叶龙胆酮， 经过理化性质测定， 紫外、 红外、 质谱 和核磁共振波谱解析， 最终确证其结构 ； 该化合物抗乙型肝炎病毒抑制作用明显， 对CCl4和 D- 氨基半乳糖所致急性或慢性肝损伤有明显保护作用， 有望在制备具有治疗乙型病毒性肝 炎作用、 保肝作用、 。
16、抗疱疹病毒和流感病毒， 以及抗氧化作用的药物中得到应用。 具体实施方式 0027 为表明本发明的制备法和用途， 通过以下实施例对本发明进行更进一步说明。但 应该理解的是， 本发明实验例只是用于说明而不是限制本发明。 0028 实施例 1 ： 一种酮化合物， 制备方法如下 ： 0029 步骤 1 ： 将中草药川东獐牙菜干燥， 粉碎至 100 目细粉， 取 10kg 加入萃取釜中 ； 0030 步骤 2 ： 按萃取压力 30MPa， 萃取温度 35， 夹带剂为体积分数 95乙醇 ( 用量为 1.2L/kg 药材 )， 萃取时间 90min， 获总酮化合物 ； 0031 步骤3 ： 采用十八烷基硅烷。
17、键合硅胶柱， 流动相甲醇-水之比为35-6565-35， 检 测波长 254nm， 室温条件下， 对步骤 2 获得的总酮化合物进行样品制备， 收集样品溶液 ； 0032 步骤 4 ： 对上述收集样品溶液进行减压浓缩 ； 0033 步骤 5 ： 在 60-80温度条件下， 对经减压浓缩的样品， 进行干燥 3-5 小时 ； 0034 步骤 6 ： 最后获得不低于 90的去甲基雏菊叶龙胆酮。 0035 为表明本发明制备方法超临界 CO2萃取技术优势， 对本发明制法超临界 CO2萃取 技术与传统溶剂提取方法进行比较， 结果表明超临界 CO2萃取工艺稳定性和重现性较好， 总 酮提取率高， 效率高、 生产。
18、周期短、 生产成本低及无三废排出， 说明本发明制法优势十分 明显 ( 见表 1)。 0036 表 1 超临界 CO2萃取技术与传统溶剂提取方法比较 0037 0038 * DB 为去甲基雏菊叶龙胆酮， *DB 提取率 DB 质量 / 药材质量 0039 为表明本发明的效果及用途， 对本发明在治疗乙型肝炎作用进行了体内外活性评 价 ( 见表 2)。 0040 表 2 去甲基雏菊叶龙胆酮在 2.2.15 细胞培养中对 HBsAg 和 HBeAg 表达作用 0041 说 明 书 CN 101429187 B4/6 页 6 0042 * ： 为拉米呋定 0043 从表 2 可以看出， 去甲基雏菊叶龙胆。
19、酮能显著抑制肝炎病毒 HBsAg 和 HBeAg 表达， 在0.32-50g.mL-1范围内， 对HBsAg抑制率达54.5-64.2， HBeAg抑制率达65.7-69.2， 对照化学药物拉米呋定 10.0-20.0g.mL-1范围内， HBsAg 和 HBeAg 抑制率达分别是 30.2-37.9和 28.3-35.4。 0044 表 3 去甲基雏菊叶龙胆酮对小鼠 CCl4所致小鼠急性肝损伤的影响 (XS) 0045 0046 注 ： 与模型组比较 *p 0.01，*p 0.05 0047 表3数据表明， 去甲基雏菊叶龙胆酮对CCl4所致小鼠急性肝损伤有明显降低ALT、 AST 的作用。结。
20、果提示， 去甲基雏菊叶龙胆酮对 CCl4所致小鼠急性肝损伤有一定保护作用。 0048 表 4 去甲基雏菊叶龙胆酮对 D- 氨基半乳糖所致小鼠急性肝损伤的影响 (XS) 0049 0050 注 ： 与模型组比较 *p 0.01，*p 0.05 0051 表 4 结果表明， 与模型对照组比较， 去甲基雏菊叶龙胆酮对 D- 氨基半乳糖所致小 鼠急性肝损伤有明显降低 ALT、 AST 的作用。结果提示， 去甲基雏菊叶龙胆酮对 D- 氨基半乳 说 明 书 CN 101429187 B5/6 页 7 糖小鼠所致急性肝损伤有保护作用。 0052 表 5 去甲基雏菊叶龙胆酮对 CCl4所致大鼠慢性肝损伤的影响。
21、 (XS) 0053 0054 注 ： 与模型组比较 *p 0.01，*p 0.05 0055 表 5 结果表明， 去甲基雏菊叶龙胆酮对 CCl4所致大鼠慢性肝损伤与模型组比较， 血清 ALT 有一定的降低作用， AST 有显著降低作用 P 0.05， 对 AKP 的降低有显著性 P 0.01-0.05。 0056 表 6 去甲基雏菊叶龙胆酮对 CCl4所致慢性肝损伤大鼠存活率的影响 0057 0058 表 6 结果表明， 去甲基雏菊叶龙胆酮对 CCl4所致大鼠慢性肝损伤对大鼠死亡只数 有明显减少作用。 0059 本发明是在申请人承担的重庆市教委科研项目， 在研究过程中， 经过反复实验发 现所。
22、研究的传统中草药川东獐牙菜中含有的去甲基雏菊叶龙胆酮具有抑制乙型肝炎病毒 和保肝作用。 0060 本发明的另一个重要用途是去甲基雏菊叶龙胆酮具有抗疱疹病毒和流感病毒作 用。不同加药方式下， 去甲基雏菊叶龙胆酮与阿昔洛韦均对 HSV-I Sm44 表现出综合抑制作 用并能抑制病毒吸附后的复制增殖过程， 随药物浓度升高而增强， 在浓度 1.0mg.ml-1以上 对HSV-I具强的直接杀伤作用， 最高有效率达97.8。 在不同药物处理时间下， 去甲基雏菊 叶龙胆酮及阿昔洛韦组病毒的感染性均较平行设置的病毒对照组减弱， 且去甲基雏菊叶龙 胆酮组的感染力较阳性药物组更弱。 0061 去甲基雏菊叶龙胆酮对。
23、甲型人流感病毒具明显的抑制复制增殖作用， 半数有效 浓度分别为 0.38mg.ml-1。随作用时间延长， 低浓度抗病毒有效率呈减小趋势， 高浓度时 (0.7mg.ml-1) 其抗病毒能力基本不变。小鼠试验可减少死亡率， 并能延长其平均存活时间。 组织病理学检查表明10， 20及30mg/kg的去甲基雏菊叶龙胆酮对小鼠肺部感染均有一定的 说 明 书 CN 101429187 B6/6 页 8 疗效， 30mgkg-1的去甲基雏菊叶龙胆酮治疗作用与利巴韦林 15mgkg-1相似， 提示去甲基 雏菊叶龙胆酮体内外抗甲型人流感病毒作用明显。 0062 本发明的另一个重要作用是去甲基雏菊叶龙胆酮抗氧化作。
24、用。 用比色法测定总抗 氧化能力 (TAOC) 及一氧化氮 (NO)， 用硫代巴比妥酸法测定丙二醛 (MDA)。去甲基雏菊叶龙 胆酮高、 中和低剂量组抗氧化能力显著高于对照组 ( 表 7)。 0063 表 7 去甲基雏菊叶龙胆酮抗氧化作用 (XS) 0064 0065 注 ： 与模型组比较 *P 001，*P 0.05。 0066 本发明所述药物是指用所述化合物， 结合已知药物制剂工艺及药学水平上可接受 的赋形剂或载体物质， 采用通常的粉碎、 混合、 溶解、 制片、 装胶囊等制剂工艺生产制成固态 或液态制剂， 如片剂、 胶囊剂、 颗粒剂和软胶囊等。 0067 本发明所述的药学上可接受的载体是指不影响各活性部分且对人体无毒副作用 的药用载体， 包括所有的溶剂、 分散介质、 包衣等这些介质和试剂对药学上的活性物质的用 途是本领域所熟知的。 0068 本发明提供了传统中药中一种有效成分酮化合物制备方法， 通过动物试验表 明该化合物抗乙型肝炎病毒抑制作用明显， 对 CCl4和 D- 氨基半乳糖所致急性或慢性肝损 伤有明显保护作用， 同时还具有抗疱疹病毒、 流感病毒和氧化作用。目前， 乙型肝炎病毒病 治疗一直缺乏有效药物， 对该化合物开发必将给乙型肝炎病毒病患者带来福音， 本发明工 业应用前景十分看好。 说 明 书 。