技术领域
本发明属于植物检验检疫技术领域，更具体地说，本发明涉及一种快 速检测百合中南芥菜花叶病毒的方法。
背景技术
南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus ArMV)异名(Raspberry yellow dwarf virus，Rhabarber mosaic virus，Rhubarb mosaic virus)，英文名 (Arabis mosaic nepo virus)，属于豇豆花叶病毒科(Comoviridae)线 虫传多面体病毒属(Nepovirus)成员，是我国二类检疫性植物病毒，病毒粒 体为等径多面体，有三种沉降组分：外壳蛋白T(53S)、核蛋白M(93S)和 核蛋白B(126S)，直径约30nm，为+ssRNA二分体病毒，主要通过汁液摩擦 接种，种苗传播，也可通过介体线虫(Xiphinema diverslcan datum)传 播。ArMV主要分布在比利时，保加利亚，捷克，丹麦、法国、德国、匈亚利、 爱尔兰、意大利、卢森堡、荷兰、波兰、罗马尼亚、瑞典、瑞士、英国、新 西兰、法国、日本、南非、加拿大、澳大利亚和新西兰等国家，ArMV寄主范 围广泛，可以侵染约174属215种野生和栽培的单子叶、双子叶植物，主要属 包括甜菜属、荠属，藜属、草莓属、大豆属、莴苣属、野芝麻属、番茄属、 勿忘草属、碧冬茄属、车前属、早熟禾属、蓼属、大黄属、千里光属、繁缕 属等。主要为害的作物有：草霉、啤酒花、芍药属、悬钩子、大黄属、接骨 木、于甘菜、芹菜、水仙、欧洲女、辣根、三叶草、唐昌蒲属、辣椒、葛芭、 唐菖蒲、郁金香、烟草、香石竹、水仙、蔷薇、以及一些其它的栽培品种和 野生品种。在加上我国植被丰富，气候条件的多样性，使得适宜该病毒寄生 繁殖的寄主植物和环境较多，由于ArMV侵染许多经济作物，一旦传入我国并 定殖，将会给我国相关产业造成巨大的经济损失。ArMV主要表现为叶片斑驳、 花叶、黄化褪绿、点斑、畸形(包括耳突)、矮化甚至坏死等症状，不同寄 主上的症状表现不同，而且随株系、栽培品种、季节以及年份不同而变化。
目前，用于ArMV的检测和鉴定方法主要有生物学方法、血清学方法、电 镜观察，其中以ELISA技术应用最为广泛，但存在着假阳性或假阴性现象， 并且检测灵敏度不高，抗血清的制备比较困难，价钱昂贵，同时还需进行指 示植物鉴别及致病力检测。其步骤繁杂，时间冗长甚至超出苗木存活容许的 时间范畴等缺陷给检疫工作的顺利实施开展造成了一定的困难，已无法满足 口岸检疫的需要。这是一个迫切需要解决的技术难题。现有技术中尚未发现 相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，填补百合中南芥菜花叶病毒分子 水平检测方面的空白，提供一种快速检测百合中南芥菜花叶病毒的方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
本发明提供了一种快速检测百合中南芥菜花叶病毒的方法，该方法采用 以下步骤：
(1)利用NCBI中登录的南芥菜花叶病毒基因组序列，设计南芥菜花叶 病毒特异性引物F1/R1，F2/R2，其中，F1/R1为外引物，F2/R2为内引物， F2/R2扩增片段在F1/R1扩增片段内部，F1/R1和F2/R2是巢式引物；
(2)采用RT-PCR和巢式PCR扩增。
本发明的工作原理及过程：
随着分子生物学技术的不断发展，基于核酸水平的高灵敏度RT-PCR方法已越 来越广泛地应用于植物病毒的快速检测。但是，对于一些携带极其微量病毒的种 子，种球以及其它无性繁殖材料，ELASA技术和普通PCR方法还远远达不到其所要 求的检测灵敏度。巢式RT-PCR是建立在普通RT-PCR方法之上的具有更高灵敏度 的分子检测方法，其原理是设计两对引物，其中一对引物在另一对引物扩增产物 的片段上，通过第一轮RT-PCR一和第二轮PCR反应对某个基因进行检测。通常第 一次采用能扩增较大片段的引物，经过25～35次循环扩增后，将第一次扩增的 产物作为模板进行第二次扩增。本发明根据GenBank已公布的ArMV序列RNA2上编 码CP蛋白的基因保守序列设计引物，建立了百合ArMV的巢式RT-PCR检测方法。引 物序列为：F1：5′ACATTTCGCCACCCTAACTG3′，R1：5′TGCCAAACACCTGATGCTCC3′； F2：5′TGGCATAGTGGTTAGAGTTG3′，R2：5′GAAGGATGGCACAGTTAGAT3′。F1/R1扩增 产物长度930bp左右，F2/R2扩增产物长度260bp左右。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果。
本发明首次在云南省进口百合种球上在分子水平上检测到南芥菜花叶 病毒，建立了针对百合南芥菜花叶病毒的普通RT-PCR和巢式PCR检测方法， 与传统ELISA方法相比，本发明检测特异性好，其它病毒和健康植株检测 结果都是阴性，同时避免了假阳性或假阴性现象。检测灵敏度比较高，与 ELISA和普通RT-PCR相比，灵敏度提高了1000倍；检测时间短，整个检测 流程与ELISA相比所需时间大大缩短，只需6～8小时就可完成；经济实用， 抗血清的制备比较困难且价格昂贵，而本发明采用普通RT-PCR和巢式PCR 检测，只需几对特异引物和Taq酶体系。
附图说明
图1是上海华舜plant(leaves)RNA mini kit(50)提取试剂盒(离心柱型) 提取的两个百合品种百合Tiber和Siberia叶片RNA的琼脂糖凝胶电泳图；
图2是北京天根RNAprep plant kit植物总RNA提取试剂盒(离心柱 型)提取的两个百合品种百合Tiber和Siberia叶片RNA的琼脂糖凝胶电 泳图；
图3是F1/R1外引物RT-PCR扩增Tiber和Siberia带毒植株和健康植株 cDNA的琼脂糖凝胶电泳图，其中，1-2：Tiber上带毒植株和健康植株，3- 4：Siberia上带毒植株和健康植株；5-6，阳性对照和阴性对照；
图4是巢式PCR扩增的带毒植株和健康植株cDNA的琼脂糖凝胶电泳图，其 中，1-2：Tiber上带毒植株，3-4：Siberia上带毒植株，5-6：Tiber和 Siberia健康植株，7-8：阳性对照；
图5是带毒植株巢式PCR检测灵敏度图，其中，1：10-1倍稀释，2：20 倍稀释，3：50倍稀释，4：10-2倍稀释，5：200倍稀释，6：500倍稀释， 7：10-3倍稀释，8：10-4倍稀释。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质，下面结合实施例和附图对本发明作进 一步说明，但它们不是对本发明的限制。
实施例
用于研究的品种有西伯利亚(Siberia)、天霸(Tiber)等东方百合品 种。选取的为带南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus ArMV)的百合材 料，阳性对照为本研究室保存的带毒唐菖蒲叶片，阴性对照为两种百合品 种的健康植株，提取RNA部位为百合植株叶片。
1.RNA提取结果比较
图(1，2)中T3，T5表示DAS-ELISA中检测到的Tiber中的带毒植株的编 号，T健表示Tiber中的健康植株，S9表示DAS-ELISA中检测到的Siberia中的 带毒植株的编号，S健表示Siberia中的健康植株。结果：上海华舜 plant(leaves)RNA mini kit(50)提取试剂盒提取到纯度较高，完整性较好 的RNA。
2.RT-PCR和巢式PCR
F1/R1外引物的特异性扩增结果(图3)，F1/R1对DAS-ELISA检测到的阳 性带毒植株的总RNA反转录的cDNA进行RT-PCR扩增，扩增得到930bp左右的特 异性条带，F2/R2内引物的特异性扩增结果(图4)，取F1/R1外引物扩增的 PCR产物，用F2/R2内引物进行扩增，扩增得到260bp左右的特异性条带。
3.巢式PCR灵敏度的检测
为了检验巢式PCR的灵敏性，将F1/R1扩增的PCR产物稀释10-1，20，50， 10-2，200，500，10-3，10-4倍后作为模板用内引物F2/R2进行扩增(图5)， 结果表明巢式PCR灵敏度与普通RT-PCR相比高出了103倍。
4.PCR产物克隆及序列分析
用DNA Star软件分析巢式PCR扩增产物序列(KMS6547)，结果表明本实例 中的病毒分离物序列与GenBank中已经登录的ArMV序列AB279740，NC_006056， AB279739，AB279741，D10086，X55460，在核苷酸和氨基酸水平上的同源性 分别为95.2％，95.8％，96.4％，99.2％，98.1％，98.7％表明分离物为ArMV。