技术领域
本发明涉及一种鸡miRNA-1704基因的单核苷酸多态性，同时还涉及该单核苷酸多态性 的检测方法及其应用，属于分子遗传学领域。
背景技术
中国是世界上家禽饲养量最大的国家，同时养鸡历史悠久，是世界上驯化家禽最早、品 种资源最丰富的国家之一。随着社会经济的迅速发展，人们生活水平的提高，市场对肉质的 需求整体上从以前的数量要求转向了对质量风味的追求。生长性状、肉质性状和屠体性状是 当今家禽工业最关注的经济性状。大多数的经济性状属于数量性状，主要是由为数众多的微 效基因决定的，这些基因同时具有加性效应、显性效应和上位效应，复杂性状的遗传基础是 由影响该表型的遗传因素和环境因素以及它们之间的相互作用共同决定的。国内优质地方鸡 普遍存在生长速度缓慢的问题，从而影响了经济效益。因此，多年来，研究人员试图通过大 量的试验寻找与鸡的相关经济性状相关的候选基因，为家禽分子选种育种方面提供辅助标记 选择。
应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，应用分子标记育种 首先是在DNA水平上筛查和检测与鸡经济性状密切相关的遗传标记；其次是建立其基因多 态性的快速检测方法；然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。
单核苷酸多态（Single nucleotide polymorphism，SNP）是指在基因组水平上由于单个核苷 酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP可以在DNA，RNA和蛋白质水平影响基因的功能， 是人类可遗传变异最常见的一种，占已知多态性的90%以上。对基因产物有影响的SNP的功 能进行分析，意义十分重大。SNP多样性与经济性状的关联分析一直是畜禽遗传学研究的热 点。随着miRNA的发现及其研究的深入，研究者发现miRNA不仅参与了动物复杂性状表型 形成的分子调控过程，而且其SNP变化还可能导致miRNA功能异常，进而引起生物表型性 状的变异。miRNA相关多态的形成机制包括插入、缺失、易位、扩增以及碱基替换。miRNA 的多态性是影响miRNA调节功能的重要因素。单个miRNA表达异常时，可能影响数百种靶 基因的表达，当其中某些关键蛋白表达量降低时，会导致机体生理功能异常和疾病发生。研 究发现，发生在miRNA初级产物、前体及成熟体上的多态性会潜在的影响数以百计基因的 表达和通路，从而广泛影响miRNA的功能。
SNP多态性的检测方法，最常见的有单链构象多态技术（SSCP）、PCR-RFLP和直接测 序技术等。但SSCP操作繁琐、耗时长，影响因素较多，且实验过程中存在假阴性问题，所 以，并非理想的SNP检测手段；直接测序技术成本较高。许多研究运用了PCR-RFLP方法或 PCR与聚丙烯酰胺电泳检测相结合的方法，需要探索一种快速检测基因组DNA序列中几十 个核苷酸插入/缺失多态的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡miRNA-1704基因的单核苷酸多态性。
本发明的目的还在于提供一种鸡miRNA-1704基因的单核苷酸多态性的检测方法。
本发明的目的还在于提供一种鸡miRNA-1704基因的单核苷酸多态性的检测方法的应 用。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种鸡miRNA-1704基因的单核苷 酸多态性，所述单核苷酸多态性为在如SEQ ID NO.3所示的鸡miRNA-1704基因序列中，其 序列第148位为C或G。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种鸡miRNA-1704基因的单核苷酸多态性的检测 方法，包括以下步骤：
（1）以包含miRNA-1704基因的鸡全基因组DNA为模板，设计一对引物；
（2）以引物对P为引物，PCR扩增鸡miRNA-1704基因；
（3）用限制性内切酶EcoRⅠ消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电 泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡miRNA-1704基因序列中第148位的单核苷酸多态性： 当鸡miRNA-1704基因的第148位点为G时，酶切后电泳图谱为两条带，条带大小为184bp 和148bp，命名为GG基因型；当鸡miRNA-1704基因的第148位点为C时，酶切后电泳图 谱为一条带，条带大小为332bp，命名为CC基因型；当鸡miRNA-1704基因的第148位点为 杂合的个体时，酶切后电泳图谱为三条带，条带大小为332bp,184bp和148bp，命名为GC 基因型。所述的引物对P为：
正向引物：5’-AGCTCTGTTGGGTTGAAGGAGTAG-3’；
反向引物：5’-GTGCATCTCCCACAGCTGCCATAG-3’；
所述PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Master Mix12μL、10pmol/L的正、反向引物各 1μL、100ng/μL DNA模板0.5μL、灭菌超纯水10.5μL，总体积25μL。
所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60.2℃退火30s，72℃ 延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
所述琼脂糖凝胶电泳所用的琼脂的质量分数为1.5%。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种鸡miRNA-1704基因的单核苷酸多态性的检测 方法的应用，所述的检测方法可用于鸡的辅助选择和分子育种。
通过将基因型与鸡的生长性状进行关联性分析，确定基因与性状的对应关系，用于鸡的 分子育种。
本发明提供的鸡miRNA-1704基因的单核苷酸多态性，利用DNA池测序的方法筛查鸡 miRNA-1704基因的多态性位点，结果表明该基因第148位为C或G的碱基多态性，而且进 一步表明该基因与鸡的体重相关，多态性可作为辅助选择标记在及育种中应用，从而加快良 种选育速度和提高种群品质。
本发明提供的鸡miRNA-1704基因的单核苷酸多态性的检测方法，针对其多态性的特性， 设计了特定的PCR引物扩增，用限制性内切酶EcoRⅠ消化PCR扩增产物，再对酶切后的片 段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定SNP多态性，能够简单、快速、成本 低、精确的检测其单核苷酸的多态性。
本发明的检测方法是一种在DNA水平上筛查和检测与鸡生长性状密切相关的分子遗传 标记，以用于鸡的辅助选择和分子育种，对提高鸡的生长性状具有重要的作用。
附图说明
图1为本发明扩增产物中SNP位点多态性的示意图，其中方框中表示突变位点、带框线 为内切酶识别序列；
图2为本发明多态性检测的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱；
图3为本发明中鸡miRNA-1704基因第148位的EcoRⅠ-RFLP的三种基因型电泳结果；
图4为本发明中PCR克隆筛查到的鸡miRNA-1704第148位的SNP多态性测序结果图。
具体实施方式
动物材料：固始鸡、安卡鸡
固始鸡属于我国黄鸡类型的一种优良地方品种，它以固始县为中心，在非凡的生态环境 和饲养条件下，经过长期闭锁繁衍而自然形成。固始鸡是蛋肉兼用型鸡种，具有优良的性状： 一是耐粗饲，抗病力强，适宜野外放牧散养；二是肉质细嫩，肉味鲜美，汤汁醇厚，营养丰 富，具有较强的滋补功效；三是母鸡产蛋较多，蛋大，蛋清较稠，蛋黄色深，蛋壳厚，耐贮 运。
安卡肉鸡是当今世界优良的肉用鸡种之一，也是目前国内生长速度最快的红黄羽肉鸡， 具有适应性强，耐应激，长速快，饲料报酬高等特点。
实验动物的培育：
本发明所用固始鸡-安卡鸡资源群按F-2远缘半同胞设计方案组建，试验共建立7个家系， 其中正交系4个为反交系3个为F0代是从蛋肉兼用 型固始鸡和肉用型安卡鸡纯系中分别选取种鸡，按公母鸡1：6比例配组而成，要求所选公母 鸡具有本品种特征，产蛋量高，体重中等，血统纯正，以保证F1代个体在各个位点的杂合。 从每个家系的F1后代中选留一只公鸡，按公母1：9比例与其他家系母鸡交配产生F2代，要 求与配公母鸡之间没有亲缘关系，F1代的种用母鸡也尽量散布在各个家系中，选种时尽量选 择外貌表现丰富，呈现杂合的个体，保证F2代性状产生较大分离。该群体共包括F0代42只 鸡，F1代70只鸡，F2代860只鸡，资源群体中F2代有完整经济性状的772个个体。
具体饲养方法如下：
鸡群饲养于河南农业大学试验鸡场，后期试验在河南农业大学家禽遗传改良实验室完成。 鸡群饲养期营养水平：0～4周龄能量水平为12.40MJ/kg，蛋白质水平为20.1%；5～8周龄能 量水平为12.70MJ/kg，蛋白质水平为18.2%；9～12周龄能量水平为12.75MJ/kg，蛋白质水 平16.0%。各家系混群，笼养，自由采食，充足饮水。
实施例1、鸡基因组DNA的提取与检测
1、鸡基因组DNA的提取
以固始鸡-安卡鸡资源群体F2代共772只鸡为材料，抽取每只鸡的颈静脉血5mL，装入 离心管中，在室温下倾斜放置30min，待有血清析出后放入离心机中，以3000r/min的速度 离心30min，分离出血清后，置于-80℃冰箱中保存备用。
采用酚氯仿抽提法从F2代资源群体血液样本中提取基因组DNA，溶于TE中，4℃保存 备用，具体方法如下：
（1）80μL全血中加TE缓冲液500μL，蛋白酶K（10mg/mL）10μL，SDS裂解液2μL， 振荡10min混匀，55℃水浴过夜；
（2）加入600μL Tris饱和酚，振荡混匀，10,000rpm，离心10min；
（3）取上清，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合溶液（25:24:1）振荡混匀，10,000rpm，离 心10min；
（4）取上清，加等体积酚/氯仿混合溶液（24:1）振荡混匀，10,000rpm，离心10min；
（5）取上清，加入2倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA，10,000rpm离心10min；
（6）弃上清，加入500μL70%乙醇清洗沉淀，倒置室温下使乙醇挥发干净，加入适量的 TE（pH8.0）溶解DNA，4℃保存直至DNA完全溶解，1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃ 保存。
2、分光光度法检测基因组DNA浓度
用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和 OD260/OD280的比值。如果OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则 应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。
DNA浓度（ng）=50×OD260值×稀释倍数
DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至100ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。
实施例2、鸡miRNA-1704多态性的检测
1、DNA池的构建
随机选取70个浓度为100ng/μL DNA样品，从中取10μL DNA混合构建成DNA池。
2、扩增引物设计
以鸡miRNA-1704基因在Genbank中的基因组序列的同源保守区序列为参考（登录号： MI0007439），用Primer5.0设计鸡miRNA-1704的测序PCR引物对，扩增片段总长度为332bp。
其测序引物对序列如下：
正向引物：5’-AGCTCTGTTGGGTTGAAGGAGTAG-3’（SEQ ID NO.1）；
反向引物：5’-GTGCATCTCCCACAGCTGCCATAG-3’（SEQ ID NO.2）；
3、PCR克隆鸡的miRNA-1704的DNA序列
以DNA池为模版，用相应的引物对进行PCR扩增，PCR反应体系为25μL，见表1；
表1PCR反应体系
体系成分 体积（μL） 2Taq PCR Master Mix（MBI） 12 正向引物（10pmol/L） 1 反向引物（10pmol/L） 1 DNA模板（100ng/μL） 0.5 灭菌超纯水（ddH2O） 10.5 总体积 25.0
PCR反应程序，94℃预变性5min；94℃变性30s，60.2℃退火30s，72℃延伸30s，35个 循环；72℃延伸10min。
4、PCR产物测序
PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外 灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯 化试剂盒（北京天根生物公司）纯化PCR产物，具体操作按照试剂盒说明书进行。
将PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序，测序结果如SEQ ID NO.3所示。
对测序峰图进行分析和序列比对分析，其中在同一位点有套叠峰，即认为该位点为单核 苷酸多态性位点；比较发现，鸡miRNA-1704基因的存在G>C的SNP多态性，为miRNA-1704 序列表SEQ ID No.1第148位为C或G的碱基多态性。
5、鸡miRNA-1704基因第148位点的单核苷酸多态性的PCR-RFLP检测
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。图2结果显示，其扩增片 段与理论设计大小一致，因此可以证明成功扩增出鸡miRNA-1704基因。
当鸡miRNA-1704基因第148位点是G时，PCR扩增后形成一个EcoRⅠ限制性内切酶 识别序列GAATTC，见图1。当第148位点发生G>C时，原来的EcoRⅠ限制性内切酶识别 序列GAATTC也相应地变成CAACC，从而破坏了EcoRⅠ限制性内切酶识别序列。
PCR产物酶切及电泳检测：对PCR扩增产物首先分别进行EcoRⅠ酶切，然后根据琼脂 糖凝胶电泳结果判定其SNP多态性，结果如图3。
10μL的EcoRⅠ酶切体系为：6μL PCR产物，10×Buffer（含BSA）1.0μL，EcoRⅠ（10U/μL） 0.2μL，2.8μL灭菌双蒸水。将样品混匀后离心，37℃恒温箱中12小时，1.5%的琼脂糖凝胶， 120V电压电泳1.5小时，EB染色检测酶切结果，用Kodak DC120凝胶成像分析系统照相分 析，并判型、记录其基因型。
图3结果显示当鸡miRNA-1704基因的第148位点为G时，酶切后电泳图谱为两条带， 条带大小为184bp和148bp，命名为GG基因型；当鸡miRNA-1704基因的第148位点为C 时，酶切后电泳图谱为一条带，条带大小为332bp，命名为CC基因型；当鸡miRNA-1704 基因的第148位点为杂合的个体时，酶切后电泳图谱为三条带，条带大小为332bp,184bp和 148bp，命名为GC基因型。
选取不同基因型个体的PCR扩增产物进行测序，结果见图4。
鸡miRNA-1704基因的第148位点的多态性频率统计分析
等位基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率，取值在0-1之间。
Pi＝[2（ii）＋（ij1）＋（ij2）＋………＋（ijn）]/2N
Pi：第i个等位基因频率；
i：为纯合复等位基因；
j1、j2、………jn：与i共显的第1到第n个等位基因。
基因型频率是指一个群体中某一性状的各种基因型之间的相对比率。
基因型频率＝基因型个体数/测定群体总数
对F2资源群体中miRNA-1704的位点G>C的基因型频率统计分析结果见表2。表2结果 显示，在F2资源群体中176只为CC基因型，95只为GG基因型，456只为GC基因型。CC、 GG和GC基因型频率分别为0.242、0.131和0.627。C和G等位基因的频率分别为0.556和 0..444（如表2）。
表2miRNA-1704基因在F2代资源群中基因型频率和基因频率
鸡miRNA-1704基因第148位点的多态性与鸡生长性状的关联分析
关联分析模型：利用SPSS（17.0）软件分析基因位点与体重性状的相关性。确保每个性 状数据呈正态分布，再利用最小二乘法分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型 分析基因型效应和benferroni多重比较法比较各基因型间的差异，结果见表3。模型I为该位 点多态与生长性状和肉质性状的关联分析模型，
Model I：yijklm=μ+Gi+Sj+Hk+fl+eijklm;
其中：yijklm为个体表型值；μ为总体均值；Gi为基因型固定效应；Sj为种性别效应；Hk为批次效应；fl为家系效应作为随机效应；eijklmn为随机误差。
表3miRNA-1704多态位点与鸡体重之间的方差分析
注：具有相同字母表示差异不显著（P>0.05），字母不同表示差异显著（P<0.05）。
由表3可知，miRNA-1704的位点G>C与不同初生重、6周龄体重、8周龄体重、10周 龄体重和12周龄体重显著关联，并且均表现为CC型的体重高于GG型所对应的体重。表明 C等位基因有利于鸡体重的增加，G等位基因不利于鸡的体重增加。鸡miRNA-1704基因第 148位的单核苷酸多态性中的CC基因型作为鸡体重性状的标记辅助选择育种中提高鸡体重 的分子遗传标记。