技术领域
本发明关于一种多胜肽及其用途，尤其是关于一种可与胰岛素受体结合且具有降血糖、降低糖化血红素及/或减少糖尿病肝肾病变等功效的多胜肽及其用途。
背景技术
糖尿病为慢性的代谢异常的疾病，主要原因是由于体内胰岛素缺乏或功能不全，或者是因先天的基因加上后天环境造成周边组织的胰岛素抗性，以致于对糖类的利用能力减低，甚至完全无法利用，进而造成体内血糖过高及蛋白质与脂肪代谢的异常。此外，糖尿病会衍生慢性并发症，包括：眼底病变、神经病变(包含运动神经、感觉神经、及自主神经)、肝肾病变、糖尿病足、以及大血管病变(包含脑血管障碍、冠状动脉病变、及周边血管阻塞)等。
根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)的相关统计显示，糖尿病患者的总数一直呈现惊人的成长，从1985年到2000年，全球糖尿病患者的总数已由三千万人增加到超过一亿七千一百万人。WHO更进一步指出，预估到2030年时，全球罹患糖尿病的总人口将突破三亿四千六百万人。且根据统计，美国于糖尿病及其并发症所耗的医疗保健费用，由1997年的四百四十亿美金至2007年攀升到一千七百四十亿美金。由此可知，糖尿病是一影响全球人类健康甚巨的疾病，是故，研发可有效调整血糖的物质或药剂乃是维系人类健康的一重要课题。
有关糖尿病的治疗，自1922年以后，主要是利用胰岛素来进行，然而，胰岛素的缺乏仅是胰脏功能异常的部分现象，并非糖尿病的完整病因。因此，仅使用胰岛素来治疗糖尿病，所达成的疗效有限。
除胰岛素之外，根据药物的作用机制，现有降血糖药物可分为五大类：一、磺酰尿素(sulfonylureas，SU)类，可促进胰脏分泌胰岛素及增加组织细胞的胰岛素的接受器；二、安息香酸衍生物，可刺激胰岛素的分泌；三、双胍(biguanides)类，可抑制胃肠吸收糖分、抑制肝脏制造糖分、及促进组织利用糖分；四、α-葡萄糖酶抑制剂(α-glucosidase inhibitors)，可抑制双糖分解为肠道可吸收的单糖；五、胰岛素敏感剂，可降低周边组织与肝脏细胞对胰岛素的阻抗性。然而，上述药物各具不同副作用。举例而言，磺酰尿素类药物会使病患发生皮疹及低血糖的现象；安息香酸衍生物会导致低血糖；双胍类药物会造成胃肠不适及乳酸中毒；α-葡萄糖酶抑制剂会使病患胃肠不适；而胰岛素敏感剂则会导致肝功能异常及肝细胞伤害。综上所述，开发具降血糖疗效且低副作用的药物是急迫需要的。
与一般化合物相较，多胜肽因具较佳的生物可代谢性及生物可接受性，故较可符合低副作用的需求。是以，近数十年来，全世界已研究许多不同的多胜肽，并运用于临床治疗中。例如中国台湾专利第I283684号，公开类升糖素胜肽-1(Glucagon Like Peptide-1)的类似物具有降血糖的疗效；美国专利第7,393,919号，则教导利用人类胰岛胜肽(Human proIslet Peptide，HIP)作为降血糖的药物，其中，HIP为胰脏炎相关蛋白前驱物(pancreatitis-associated protein precursor)的活性片段。
经发现，具降血糖活性的多胜肽可自植物萃取物中取得。例如，美国专利第6,127,338号，公开自苦瓜中取得具降血糖活性的多胜肽。根据该专利文献，具有降血糖活性的多胜肽其氨基酸序列为KTNMKHMAGAAAAGAVVG，且分子量小于10千道尔顿。
尽管已有多种调节血糖的药物，至今对于可成功地治疗不同致病机制的糖尿病的单一或组合的治疗方式或医药组合物，仍存在迫切的需求。
本发明是针对上述需求所为的研究，提供一种新的多胜肽，其可与胰岛素受体结合，并具有降血糖、降低糖化血红素及减少糖尿病肝肾病变等功效，尤其可用于治疗糖尿病。
发明内容
本发明的一目的在于提供一种多胜肽，其具有一选自下列群组的SEQ ID NO：1的片段氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、及SEQ ID NO：6。
本发明的另外一目的在于提供一种多胜肽，其具有一下列SEQ ID NO：7氨基酸序列或该序列进行单一氨基酸的取代所衍生的同源性氨基酸序列：IVARPPTIG(SEQ ID NO：7)；其中，该同源性氨基酸序列具有选自由SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：178所组成的群组中的任一氨基酸序列。
本发明的又一目的在于提供一种多胜肽，其具有一选自下列群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、及SEQ ID NO：188。
本发明的再一目的在于提供一种多胜肽，其具有一下列氨基酸序列或该进行单一氨基酸的取代所衍生的同源性氨基酸序列：RYKYQX1X2YI(SEQ ID NO：189)；其中，X1为胱胺酸或色胺酸，X2为苯丙胺酸或色胺酸。
本发明的再一目的在于提供一种分离的核酸分子，其编码上述多胜肽。
本发明的再一目的在于提供一种可与胰岛素受体结合，并用于降血糖、降低糖化血红素及减少糖尿病肝肾病变等的医药组合物，其包含上述多胜肽及一医药上可接受的载剂。
本发明的详细技术及较佳实施方式，将描述于以下内容中，以供本发明所属领域具通常知识者据以明了本发明的特征。
附图说明
图1所示为IRBP-1-68与胰岛素受体的分子嵌合模式图；
图2所示为IRBP-1-68促进胰岛素受体自体磷酸化的免疫墨点分析图；
图3所示为IRBP-1-68促进与胰岛素信息路径相关的基因的蛋白质表现的西方墨点分析图；以及
图4所示为IRBP-1-68促进3T3-L1脂肪细胞表现葡萄糖转运蛋白4的免疫组织染色图。
具体实施方式
以下将具体地描述根据本发明的部分具体实施例；惟，在不背离本发明的精神下，本发明还可以多种不同形式的实施例来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所陈述的内容。此外，除非文中有另外说明，于本申请文件中所使用的“一”、“该”及类似用语应理解为包含单数及复数形式。
本文所述的“同源性氨基酸序列”，除非特别说明，否则是指于一多胜肽的氨基酸序列中，进行单一或多个氨基酸的取代所衍生的氨基酸序列。此外，本文所述的“同源性多胜肽”，除非特别说明，否则是指于一多胜肽的氨基酸序列中，进行单一或多个氨基酸的取代所衍生的多胜肽同源物(homologues)。
已知于细胞中，当如胰岛素的配体(ligand)与胰岛素受体结合后，会引发胰岛素受体自体磷酸化，进而启动下游信息传导反应，引发相关基因的转录及转译作用，并使细胞启动葡萄糖转运效应，从而降低细胞外或血液中的葡萄糖浓度，据以达成降血糖的效果。
本发明人研究发现，将具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列(共68个氨基酸)的多胜肽分割成不同片段，或进一步通过单点或多点突变技术，可提供各种多胜肽。这些多胜肽可与胰岛素受体结合，且可降低血糖值、降低糖化血红素及/或减少糖尿病肝肾病变。于不受理论限制下，本发明多胜肽通过与胰岛素受体结合后，引发胰岛素受体自体磷酸化的机制而达成上述功效。
因此，本发明提供一种第一多胜肽，其是自SEQ ID NO：1所示氨基酸序列(共68个氨基酸)的多胜肽分割而得，具有一选自下列群组的SEQ ID NO：I的片段氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、及SEQ ID NO：6。较佳地，该第一多胜肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6。其中，SEQ ID NO：2为SEQ ID NO：I所示氨基酸序列的第1至19个氨基酸的片段氨基酸序列；SEQ ID NO：3为SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第17至35个氨基酸的片段氨基酸序列；SEQ ID NO：4为SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第34至52个氨基酸的片段氨基酸序列；SEQ ID NO：5为SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第45至68个氨基酸的片段氨基酸序列；而SEQ ID NO：6为SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第55至68个氨基酸的片段氨基酸序列。
于下文中，将本发明多胜肽称为“胰岛素受体结合蛋白(insulin receptor-binding protein)”，或简称为“IRBP”。例如，本发明具有SEQ ID NO：1所示68个氨基酸构成的氨基酸序列的多胜肽，简称为“IRBP-1-68”，而具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列(即，SEQ ID NO：1中第1至19个氨基酸的片段氨基酸序列)的多胜肽则简称为“IRBP-1-19”。
本发明另外提供一种第二多胜肽，其具有下列SEQ ID NO：7氨基酸序列或具有SEQ ID NO：7的同源性氨基酸序列：
IVARPPTIG(SEQ ID NO：7)；
其中，该SEQ ID NO：7氨基酸序列为SEQ ID NO：1中第60至68个氨基酸的片段氨基酸序列(即，IRBP-60-68)，自SEQ ID NO：1所示氨基酸序列分割而得；该同源性氨基酸序列则是通过以不同氨基酸对SEQ ID NO：7氨基酸序列施以单点突变技术而提供，且具有选自由SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：178所组成的群组中的任一种氨基酸序列。较佳地，该第二多胜肽具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：21的氨基酸序列。
此外，本发明另外提供一种第三多胜肽，其分别以不同氨基酸对IRBP-60-68中各个氨基酸进行三至六点突变/取代(即，置换三至六个氨基酸)而获得，具有一选自下列群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、及SEQ ID NO：188。较佳地，该第三多胜肽具有一选自下列群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、以及SEQ ID NO：186。
本发明还提供一种第四多胜肽，其具有下列氨基酸序列或其进行单一氨基酸的取代所衍生的同源性氨基酸序列：
RYKYQX1X2YI(SEQ ID NO：189)；
其中，X1为胱胺酸或色胺酸，X2为苯丙胺酸或色胺酸。本发明的第四多胜肽是针对IRBP-60-68中九个氨基酸都进行置换而获得，其也可与胰岛素受体结合而降低血糖量。于本发明的一实施例中，该第四多胜肽具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列，且较佳地，X1为胱胺酸，X2为苯丙胺酸或色胺酸。于本发明的另外一实施例中，该第四多胜肽具有RYKYQCFYI(SEQ ID NO：191)的氨基酸序列(即，X1为胱胺酸，X2为苯丙胺酸)，或具有对SEQ ID NO：191的氨基酸序列进行单点突变/取代所提供的同源性氨基酸序列，且该同源性氨基酸序列为SEQ ID NO：194至SEQ ID NO：364之一。
本发明第一种至第四种多胜肽，都可与胰岛素受体结合，并具降血糖活性，故可用于治疗糖尿病(包括第一型糖尿病与第二型糖尿病)，且可改善糖尿病患者的后续病程(例如，降低糖化血红素、治疗由糖尿病所引起的肝肾病变等)。
相较于临床上用于治疗糖尿病的胰岛素及台湾专利第I342781号与日本专利第4772884号中所公开的IRBP-1-68多胜肽，本发明多胜肽具有以下优点：一、本发明多胜肽的氨基酸序列长度较短且具优异降血糖活性，故可降低制造降血糖多胜肽的成本，同时提供相似程度的药效，从而减轻患者的经济负担；二、本发明多胜肽的氨基酸序列长度较短而具较低分子量，其经投予至糖尿病患者后较易于吸收，故可提升生体可用率(bioavailability)，而更有利于临床治疗；以及三、本发明多胜肽具不同长度及氨基酸组成，故可依据病患的差异性(如性别、年龄、病状、严重程度、及对药物的反应性等)而提供更具弹性的治疗手段。
本发明多胜肽可自植物萃取而得，或通过人工合成方式或通过生物体的基因重组方式取得，或者通过前述操作的结合而获得。所谓人工合成方式，视所欲的多胜肽，通过人工方式使氨基酸依序连接，包括化学合成法或通过利用化学合成原理的胜肽合成仪所进行的合成。人工合成法通常具有以下优点：可方便地于合成过程中改变多胜肽的一级结构、加入特殊的氨基酸、以及对多胜肽的末端进行修饰等。
可用以合成本发明多胜肽的化学合成法，可分为固相合成法及液相合成法。一般而言，液相合成法必须于完成每一氨基酸的连接后，进行萃取操作。此外，由于萃取所得的多胜肽中间物通常为混合物，因此，尚须进行层析纯化步骤。换言之，以液相合成法进行多胜肽的合成，通常须涉及繁琐的萃取及层析纯化步骤，才能得到高纯度的产物。相对于此，固相合成法是于溶剂中，在固体聚合物颗粒(或聚合支撑物)上进行胜肽的键结反应。于此方法中，是先将所欲多胜肽的N端氨基酸共价键结至聚合物颗粒上，其后再通过专一性键结的方式将后续氨基酸依序连接上，最后合成该多胜肽。由于该聚合物颗粒并不溶于溶剂中，故仅需于反应终了通过清洗及过滤操作，即可将该聚合物颗粒(以及连接在该聚合物颗粒上的所欲的多胜肽)与反应试剂及副产物分开。此即，相较于液相合成法，固相合成法只需于整个合成过程中的最终步骤进行纯化操作，不仅相对方便，且可大幅缩短反应时间，于长链多胜肽的合成上也较具优势。
目前，业已开发出多种可自动合成多胜肽的装置，例如：固相胜肽合成仪、液相胜肽合成仪、及微波胜肽合成仪等，都可视需要选用以合成本发明多胜肽。
也可以“基因重组”方式合成本发明多胜肽。于此，是通过将包含编码该多胜肽的核酸的表达载体转形至宿主细胞中，并使该核酸表达的方式制得。其中，该宿主细胞可为大肠杆菌或酵母菌，且该表达载体可选自市面上常见的载体，例如：pQStrep2、pQStrep4、pGEX-6p1、或pQTEV等。
此外，也可自植物萃取液中取得本发明多胜肽。经发现，可自葫芦科植物萃取液中得到可调整血糖的多种多胜肽，例如：苦瓜、山苦瓜、胡瓜、南瓜、葫芦、西瓜、栝蒌仁、天花粉、及其组合。其中，先前研究已以蛋白质电泳证实，葫芦科植物的萃取液中所含可调整血糖的多胜肽，属同源性蛋白质。然而，本发明的多胜肽也可自葫芦科植物以外的植物取得，例如：百日菊(Zinnia elegans)、苜蓿(Medicago truncatula)、葡萄、葡萄柚、迷迭香(Sambucus nigra)、阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)、稻、及其组合。此即，本发明多胜肽的来源并不局限于葫芦科植物。
以苦瓜为例，可先以如下步骤取得植物萃取液，再自萃取液纯化(例如：以蛋白质电泳纯化法或层析纯化步骤)取得本发明多胜肽。首先，于溶剂中将苦瓜离解(maceration)以得到一粗悬浮液，该溶剂可为磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、或水等，且可利用搅拌器或研磨器以离解苦瓜。接着，以12,000转数/分钟(revolution per minute，rpm)至15,000转数/分钟的离心转速，将粗悬浮液中的颗粒自液相中移除，并以孔径为0.1微米至0.5微米的滤材来过滤上清液。然后，将所得的滤液通过30千道尔顿的滤膜，并取其滤液部分，即可获得含有本发明的多胜肽的水溶性苦瓜萃取液。其中，该滤膜可选自现有滤材产品，例如：Amicon滤膜及Millipore滤膜等。其后，再以如蛋白质电泳或层析纯化方法，以分离出所欲的多胜肽，或者，可进一步视需要以特定蛋白酶分解所得的多胜肽，以切割出所欲的多胜肽片段。于此，该蛋白酶并无特殊限制，其可为例如(但不限于)丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶等。最后，可视需要添加防腐剂(例如：苯甲酸钠或水杨酸等)，并于-80℃下保存该多胜肽。
有关上述通过蛋白质电泳分离纯化法以取得本发明多胜肽的操作，包含可利用如二维凝胶电泳分离出蛋白质的方式。首先，将上述的水溶性苦瓜萃取液进行蛋白质沉淀，将收集的蛋白质沉淀物进行一维等电点聚焦(iso-electric focusing，IEF)。第二天，配置十二基硫酸钠-聚丙烯酰胺胶体电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)的胶体，再将该胶体注入一胶槽中，并以乙醇压平该胶体。20分钟后，将乙醇倒出。接着，将经等电点聚焦的胶条与蛋白质分子量标准(marker)样品分别注入样品槽，并以110伏特的电流进行电泳。待染剂移动至该胶体底部后，结束电泳，并将胶体取出并予以染色。接着，以清洗液(wash buffer)清洗染色剂，并以褪染剂(destain buffer)进行脱色。最后，将该胶体上的等电点为9至10且分子量约为7千道尔顿至1万道尔顿的蛋白质色带切出后，即可取得本发明多胜肽。
此外，也可以上述手段的组合来取得本发明多胜肽。举例而言，可以基因重组或植物萃取的方式取得所欲多胜肽的片段，或以人工合成的方式得到完整的多胜肽。
基于本发明多胜肽的降血糖活性，本发明另外提供一种可结合到胰岛素受体，且具有降血糖、降低糖化血红素及/或减少糖尿病肝肾病变等功效的医药组合物，其包含有效量的本发明多胜肽及一医药上可接受的载剂。该医药组合物可使用于兽医与人类医药上，且可呈任何形式，并以任何合宜的方式施用。举例言之，但不以此为限，为避免多胜肽被消化道中的酶分解，可选用皮下或静脉注射方式进行本发明医药组合物的投药，以通过血液直接将药物带至释放处。当以口服的方式进行投药时，则可于医药组合物中包含吸收延迟剂，以克服胃中强酸及小肠前半部的酶的破坏，以将药物顺利带至释放处。
以制备适于皮下或静脉注射的药剂形式为例，可于本发明医药组合物中含有一或多种例如等张溶液、盐类缓冲液(如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液)、增溶剂、乳化剂、以及其他载剂等成分，以制成如静脉输注液、乳剂静脉输注液、干粉注射剂、悬液注射剂、或干粉悬液注射剂等。
至于制备适于口服投药的药剂形式，则可于本发明医药组合物中含有不会对本发明的多胜肽活性产生不利影响的医药可接受载剂，例如：溶剂、油性溶剂、稀释剂、安定剂、吸收延迟剂、崩散剂、乳化剂、抗氧化剂、黏合剂、润滑剂、吸湿剂等。可利用任何合宜的方法，将该组合物制成适于口服投药的形式，例如：锭剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、流浸膏剂、溶液剂、糖浆剂、悬液剂、乳剂、及酊剂等等。
本发明医药组合物可视需要另外含有调味剂、调色剂、着色剂等添加剂，以提高所得药剂服用时的口适感及视觉感受；另外可添加合理用量的保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等，以改善所得药剂的储存性。视需要地，可于本发明医药组合物中并含一种或多种其他活性成分，进一步加强本发明医药组合物的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度。举例言之，可于本发明医药组合物含有一种或多种如下活性成分：胰岛素、α-葡萄糖酶抑制剂、胰岛素敏感剂、以及其他活性成分等，只要该其他活性成分对本发明多胜肽的效益没有不利的影响即可。
当使用含本发明多胜肽的医药组合物以降低人类或动物血糖时，可以一日一次、一日多次、或数日一次等不同投药频率施用本发明医药组合物，视投予对象的需求和投予的方式而异。举例言之，当以口服投药于人体以治疗糖尿病时，药剂的用量，以本发明的多胜肽的用量计，可为每天约10毫克/千克体重至约50毫克/千克体重；若以注射的方式投药，则其调整血糖的有效剂量可为每日注射约1奈莫耳/千克体重至约5奈莫耳/千克体重。其中，该单位“毫克/千克体重”或“奈莫耳/千克体重”是指每千克体重所需的投药量。但是，对于急性病患而言，其用量可视实际需要而酌增至数倍或数十倍。
本发明另外提供一种分离的核酸分子，其编码本发明的多胜肽。其中，该核酸分子可以现有的选殖方式获得。举例言之，可自植物细胞中取得基因组去氧核糖核酸(genomic deoxyribonucleic acid)后，以其作为聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，PCR)的模板，并于PCR反应结束后，纯化所得的产物，以提供本发明的分离的核酸分子。
兹以下列具体实施例以进一步例示说明本发明。其中，这些实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明的范畴。
[实施例]
[制备实施例]
(A)多胜肽的制备：以固相合成法制备以下实施例的多胜肽，这些多胜肽具有如后附序列表所示的SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：364的氨基酸序列。
(B)实验小鼠：使用BALB/c(血糖代谢正常)、STZ-induced(链佐霉素诱发第一型糖尿病)、及ob/ob(自发性第二型糖尿病)的三种品系的小鼠进行实验，这些小鼠均由国家实验动物中心(National Laboratory Animal Center)所提供。
[实施例1]分子嵌合分析
以下列方法进行分子嵌合(molecular docking)分析：由Protein Data Bank网站获得胰岛素受体(PDB码为2DTG)与胰岛素受体结合蛋白(即，具SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的IRBP-1-68多胜肽，PDB码为1VBW)的PDB档案，接着使用分子嵌合软体(AutoDock，3.05及4.0版本)与基于网格的嵌合程式(grid-based docking programs)进行分子嵌合分析，评估配体(即，IRBP-1-68多胜肽)与胰岛素受体间的分子间交互作用能量(包括范德华力、排斥能、氢键交互作用能量、库伦静电能量、内部空间能量(steric energy))。结果显示于图1，此试验结果显示IRBP-1-68(图1的中央块状部分)可结合至胰岛素受体。
[实施例2]胰岛素受体自体磷酸化试验
已知于细胞中，如胰岛素的配体与胰岛素受体结合后，会引发胰岛素受体自体磷酸化，进而启动下游信息传导反应，引发相关基因转录及转译作用，接着使细胞启动葡萄糖转运效应，而降低细胞外或血液中的葡萄糖浓度。因此，本实施例以胰岛素受体自体磷酸化试验来分析IRBP-1-68多胜肽是否可引发胰岛素受体自体磷酸化，以观察其是否与胰岛素受体结合。
试验方法如下：将人类淋巴癌细胞株(IM-9)在无血清的培养液(RPMI培养液，包含0.1％小牛血清蛋白)中培养16小时，接着在37℃下以IRBP-1-68刺激15分钟，以冰冷PBS缓冲液冲洗后纯化约250毫克的总蛋白，再以抗胰岛素受体的多株抗体(C-19)进行免疫沉淀。接着在4℃下以蛋白质G洋菜胶磁珠(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)吸附所得蛋白质2小时后，以SDS-PAGE电泳分析并转渍至Immobilon-P转印膜后，在4℃下以抗磷酸酪氨酸抗体(4G10)孵育(incubate)至隔天，进行免疫墨点(immunoblotting)分析，结果显示于图2。
于图2中，免疫墨点分析的条带越宽，表示所观察的蛋白质的量愈高；此外，图2中所示的磷酸化胰岛素受体与胰岛素受体比率随着IRBP-1-68浓度的增加而变大。
如图2所示，IRBP-1-68可引发胰岛素受体的自体磷酸化，说明其可结合至胰岛素受体。
[实施例3]受体结合试验：IRBP-1-68
进行全细胞受体结合试验，以进一步确认IRBP-1-68是否可与胰岛素受体结合。
首先，将1.2×106个人类淋巴癌细胞株(IM-9)与溶于1毫升PBS缓冲液(含有0.1％小牛血清蛋白)的胰岛素(对照组)或IRBP-1-68的多胜肽于室温下混合培养15分钟，以进行竞争性试验。接着添加经碘-125(125I)标定的胰岛素(20,000每分钟计数(cpm)/毫升)，于16℃下培养90分钟后，将细胞冷却并于4℃下以2000转/分钟的转速离心10分钟，取沉淀物以冰冷清洗缓冲液(10毫莫耳浓度/公升Tris及150毫莫耳浓度/公升NaCl，pH 7.6)清洗二次后，以伽玛计数器(Gamma Counter)计数。每一多胜肽至少重复进行三次上述试验。多胜肽促进碘-125结合至胰岛素受体的浓度(EC50)显示于表1，其中，EC50代表可促进50％的经碘-125标定的胰岛素与胰岛素受体结合的多胜肽的浓度，EC50值愈低，则促进结合的效果愈强。
表1
如表1所示，胰岛素与IRBP-1-68都可有效促进经碘-125标定的胰岛素结合至胰岛素受体，其中，IRBP-1-68的EC50值为4.15±1.77奈莫耳浓度，较胰岛素为低，显示IRBP-1-68确实可与胰岛素受体结合，且具有更优异的促进胰岛素结合至胰岛素受体的效果。
[实施例4]葡萄糖摄取试验
由于脂肪组织可自血液中摄取葡萄糖，使血中糖量降低，此为血糖调控的关键步骤，因此，于此实施例中进一步以3T3-L1脂肪细胞作为试验平台，以进行葡萄糖摄取试验。以24孔培养盘培养3T3-L1脂肪细胞，经过4.5小时的饥饿期间(starvation period)后，以不含胰岛素(负向控制组)、含1奈莫耳浓度胰岛素(控制组)、及含1奈莫耳浓度胰岛素与IRBP-1-68(实验组)的KRB缓冲液(Krebs ringer bicarbonate buffer；118毫莫耳浓度NaCl、4.7毫莫耳浓度KCl、1.3毫莫耳浓度CaCl2、1.2毫莫耳浓度MgSO4、1.2毫莫耳浓度Na2HPO4、2％小牛血清蛋白、0.5毫莫耳浓度葡萄糖、25毫莫耳浓度NaHCO3，pH 7.4)孵育30分钟，接着添加[3H]-2-去氧-D-葡萄糖(0.1微居里/试验)孵育10分钟，以冰冷PBS清洗细胞三次并回溶于0.1％SDS，以闪烁计数器(scintillation counter)分析细胞内的放射性，结果显示于表2。
表2
名称 比率 胰岛素 2.9 IRBP-1-68 1.79±0.49
表2中胰岛素的放射比率参照Life Sciences 2004；75：2653-64，该文献全文并于此处以供参考。如表2所示，胰岛素与IRBP-1-68都可有效促进3T3-L1脂肪细胞进行葡萄糖摄取。此试验说明IRBP-1-68可通过促进脂肪细胞摄取葡萄糖而达成降血糖功效。
[实施例5]微阵列晶片分析
以微阵列晶片进行全基因体扫描，探讨IRBP-1-68促进3T3-L1脂肪细胞进行葡萄糖摄取的可能机转。
使用RNeasy Mini kit(Qiagen，Valencia，加州，美国)萃取经IRBP-1-68处理或未经处理的3T3-L1脂肪细胞的总RNAs，并以Agilent 2100 bioanalyzer(Agilent Technologies，Santa Clara，加州，美国)进行评估，选择RNA完整度数值大于8.0的RNA样品，接着进行微阵列晶片分析(可参见Cheng，W.Y.等人，2009，Comprehensive evaluation of a novel nuclear factor-κB inhibitor，quinoclamine，by transcriptomic analysis.Brit.J.Pharmacol.157(5)：746-756；Cheng，H.M.等人，2010，Application of bioactivity database of Chinese herbal medicine on the therapeutic prediction，drug development，and safety evaluation.J.Ethnopharmacol.132(2)：429-437；以及Hsiang，C.Y.等人，2009，Nuclear factor-κB bioluminescence imaging-guided transcriptomic analysis for the assessment of hoist-biomaterial interaction in vivo.Biomaterials 30(17)：3042-3049，这些文献全文并于此处以供参考)，统计出表现量增加或减少达2倍以上的与胰岛素信息路径或脂肪细胞因子(Adipocytokine)信息路径相关的基因的数量，结果显示于表3。
表3
如表3所示，IRBP-1-68在3T3-L1脂肪细胞中可通过调控与胰岛素信息路径相关的基因的表达量，而促进脂肪细胞摄取葡萄糖，进而达成降血糖功效。
[实施例6]西方墨点分析
利用西方墨点法分析与胰岛素信息路径相关的基因的蛋白质表现量。在37℃下培养3T3-L1脂肪细胞24小时，以IRBP-1-68处理16小时，收集并以冰冷PBS清洗细胞，以300微升样品缓冲液(62.5毫莫耳浓度Tris-HCl，pH 6.8、2％SDS、10％甘油、50毫莫耳浓度二硫苏糖醇、0.1％溴酚蓝)打破细胞，并以Bradford方法(Bio-Rad，Hercules，加州，美国)测定蛋白质浓度。取10微克蛋白质进行SDS-PAGE电泳分析，并转渍至硝化纤维膜(Amersham Pharmacia Biotech公司，Piscataway，纽泽西，美国)，以封锁缓冲液(20毫莫耳浓度Tris-HCl，pH 7.6、140毫莫耳浓度NaCl、0.1％Tween-20、5％脱脂牛奶粉末)进行封锁，并与抗-Akt、抗-磷酸化-Akt(Ser 473)、抗-磷酸化-Akt(Thr 308)、抗-磷酸化-第10号染色体同源删除磷酸酶及张力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on Chromosome ten，PTEN)(Ser 380)、抗-磷酸化-糖原合成酶激酶-3β(glycogensynthasekinase-3β，GSK-3β)(Ser 9)、抗-磷酸化-Raf(Ser 259)、抗-磷酸化-磷酸肌醇依赖性激酶1(phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1)(Ser 241)的抗体(Cell Signaling Technology，Beverly，麻萨诸塞州，美国)进行反应，结果显示于图3，其中，图3中所示的数值为西方墨点法分析的条带的强度，数值愈大表示所观察的蛋白质的量愈高。
如图3所示，IRBP-1-68在3T3-L1脂肪细胞中可增加PDK-1、磷酸化-AKt(Thr 308)、磷酸化-AKt(Ser 473)、葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)等与胰岛素信息路径相关的基因的蛋白质表现量。此试验显示IRBP-1-68在3T3-L1脂肪细胞中可通过调控与胰岛素信息路径相关的基因的表现量，而具有降血糖效果。
[实施例7]免疫组织分析
以下列方法进行免疫组织染色：将3T3-L1脂肪细胞培养并固定于盖玻片上，接着使细胞与1∶50稀释倍数的抗葡萄糖转运蛋白4的单株抗体(Millipore，Billerica，麻萨诸塞州，美国)孵育至隔天，于室温下以生物素化二级抗体(Zymed Laboratories，South San Francisco，加州，美国)孵育20分钟，接着以抗生物素蛋白-生物素复合试剂孵育，并以3，3-二氨基联苯胺(-Plus Kit，Zymed Laboratories，South San Francisco，加州，美国)进行染色，结果显示于图4。
如图4所示，3T3-L1脂肪细胞的免疫组织染色结果也显示IRBP-1-68可以促进3T3-L1脂肪细胞表现葡萄糖转运蛋白4。已知葡萄糖转运蛋白4为脂肪细胞中具有转运葡萄糖功能的蛋白质，因此，上述试验结果说明IRBP-1-68可通过提升葡萄糖转运蛋白4的表现量，而促进脂肪细胞转运葡萄糖，进而达成降血糖效果。
实施例1至7的试验显示IRBP-1-68可与胰岛素受体结合，且可促进脂肪细胞摄取葡萄糖，而达成降血糖功效。
[实施例8]受体结合试验：IRBP-1-68的片段氨基酸序列
以与实施例2相同的实验方法，针对具表4所示的片段氨基酸序列(SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5SEQ ID NO：6、及SEQ ID NO：7)的多胜肽进行受体结合试验。这些多胜肽促进经碘-125标定的胰岛素结合至胰岛素受体的浓度(EC50)显示于表4。
表4
如表4的结果所示，本发明的具有IRBP-1-68的片段氨基酸序列(即，SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：7)的多胜肽都具有促进胰岛素结合至胰岛素受体的功效，其中，IRBP-1-19、IRBP-50-68、及IRBP-60-68具有较佳的促进效果。此试验说明将IRBP-1-68裁剪至19个氨基酸(即，IRBP-1-19与IRBP-50-68)、甚至9个氨基酸后仍具有结合至胰岛素受体的效果。以下针对IRBP-60-68做进一步的实验分析。
[实施例9]分子嵌合分析：IRBP-60-68进行单一氨基酸的取代所衍生的同源性多胜肽
如表5所示，以固相合成法制备具有针对IRBP-60-68进行单一氨基酸的取代所衍生的同源性氨基酸序列(SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：178)的多胜肽，并以实施例1所述的方法进行这些多胜肽的分子嵌合试验，评估其与胰岛素受体间的分子间交互作用能量(包括范德华力、排斥能、氢键交互作用能量、库伦静电能量、内部空间能量)。其中，以评分7000至8000标记为「+」；评分8000至9000标记为「++」；评分9000至10000标记为「+++」。于此，评分愈高者表示多胜肽与受体间的分子间交互作用能量愈大，且结合作用愈强。
表5
如表5所示，具有针对IRBP-60-68进行单一氨基酸的取代所衍生的同源性氨基酸序列(SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：178)的多胜肽都具有不同程度的结合到胰岛素受体的能力。
[实施例10]受体结合试验：IRBP-60-68进行单一氨基酸的取代所衍生的同源性多胜肽
以如实施例3所述的方法，对表5所示的具SEQ ID NO：21的氨基酸序列的多胜肽(即，将IRBP-60-68的氨基酸序列中的苏氨酸取代为丙氨酸所产生的同源性多胜肽；下文简称为“IRBP-MC”)进行受体结合试验，结果显示于表6。
表6
如表6的结果所示，IRBP-60-68进行单一氨基酸的取代所衍生的IRBP-MC多胜肽促进经碘-125标定的胰岛素与胰岛素受体结合的浓度为0.86±0.05(奈莫耳浓度)，显示IRBP-60-68进行单一氨基酸取代后所衍生的同源性多胜肽仍具有与胰岛素受体结合的能力。
此外，如下表7所示，进一步将IRBP-60-68进行单一氨基酸的取代所衍生的同源性多胜肽进行受体结合试验，于此，以胰岛素受体酪氨酸激酶(insulin receptor tyrosine kinase)活性作为多胜肽与胰岛素受体结合的活性指标，胰岛素受体酪氨酸激酶活性愈高，代表多胜肽与胰岛素受体结合的能力愈强。以胰岛素受体酪氨酸激酶活性评估多胜肽的受体结合能力的实验流程为：将多胜肽与胰岛素受体置于冰浴上作用30分钟，然后加入等体积的2倍激酶缓冲液(50毫莫耳浓度HEPES，pH7.6；50毫莫耳浓度MgCl2；200微莫耳浓度ATP；200微莫耳浓度钒酸钠；5毫克/公升麸氨酸与酪氨酸聚合物(poly(Glu，Tyr))；50微居里[γ-32p]ATP/毫升)，置于30℃水浴槽中反应10分钟，接着加入TCA使受质poly(Glu，Tyr)沉淀于滤纸上，再将滤纸放入贝他射线侦测器，然后由放射强度换算胰岛素受体酪氨酸激酶活性。
于表7中，每组多胜肽为IRBP-60-68进行一特定氨基酸取代后所得的多胜肽混合物。例如，IRBP-60-68-1@代表IRBP-60-68的第一个氨基酸分别以精氨酸(Arg，R)、丙氨酸(Ala，A)、缬氨酸(Val，V)、苯基丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸(Pro，P)、甲硫氨酸(Met，M)、异白氨酸(Ile，I)、白氨酸(Leu，L)、天门冬氨酸(Asp，D)、麸氨酸(Glu，E)、离氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、酪氨酸(Tyr，Y)、组氨酸(His，H)、胱胺酸(Cys，C)、天门冬酰氨酸(Asn，N)、麸酰氨酸(Gln，Q)、或色氨酸(Trp，W)进行取代后所得的多胜肽混合物(包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO134、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：170的多胜肽)。
表7
多胜肽名称 序列 活性单位/毫升 IRBP-60-68-1@ @VARPPTIG 53.23±0.10 IRBP-60-68-2@ I@ARPPTIG 54.65±0.37 IRBP-60-68-3@ IV@RPPTIG 52.66±0.05 IRBP-60-68-4@ IVA@PPTIG 52.86±0.30 IRBP-60-68-5@ IVAR@PTIG 83.43±0.43 IRBP-60-68-6@ IVARP@TIG 53.28±0.55 IRBP-60-68-7@ IVARPP@IG 53.80±0.57 IRBP-60-68-8@ IVARPPT@G 53.19±0.16 IRBP-60-68-9@ IVARPPTI@ 53.04±0.09
如表7的结果所示，IRBP-60-68进行一特定氨基酸取代后所得的多胜肽混合物具有与胰岛素受体结合的活性。
[实施例11]受体结合试验：IRBP-60-68进行多点突变所衍生的同源性多胜肽
如表8所示，进一步以固相合成法制备具有IRBP-60-68进行多点突变/取代(置换3至6个氨基酸)后所衍生的同源性氨基酸序列的多胜肽，并以如实施例3所述的方法进行受体结合试验。这些同源性多胜肽的名称、序列、及试验结果显示于表8。
表8
如表8的结果所示，具有SEQ ID NO：179至SEQ ID NO：188的氨基酸序列的多胜肽具有促进胰岛素结合至胰岛素受体的功效，此显示由IRBP-60-68进行3至6个氨基酸的取代后所衍生的同源性多胜肽仍具有促进胰岛素结合至胰岛素受体的功效，其中，IRBP-MT、IRBP-CM、IRBP-VV-1、及IRBP-CP具有较佳的促进功效。
[实施例12]受体结合试验：IRBP-60-68进行多点突变所衍生的同源性多胜肽
以如实施例1所示的方式，通过分子嵌合软体进行分子嵌合分析，筛选出如表9所示的四种具有9个氨基酸长度、与胰岛素受体结合能力较佳的多胜肽(氨基酸序列为SEQ ID NO：190至SEQ ID NO：193；于本说明书中简称为IRBP-9A至IRBP-9D)。这些多胜肽具有RYKYQX1X2YI(SEQ ID NO：189)的通式序列，其中，X1为胱胺酸或色氨酸，X2为苯丙氨酸或色氨酸。将这些多胜肽以实施例10所述的方法进行受体结合试验，并以胰岛素受体酪氨酸激酶活性作为多胜肽与胰岛素受体结合的能力的指标，结果显示于表9。
表9
多胜肽名称 SEQ ID NO 序列 活性单位/毫升 胰岛素 - - 61.28±0.53 IRBP-9A SEQ ID NO：190 RYKYQWFYI 40.34±1.94 IRBP-9B SEQ ID NO：191 RYKYQCFYI 79.76±5.64 IRBP-9C SEQ ID NO：192 RYKYQWWYI 44.18±3.61 IRBP-9D SEQ ID NO：193 RYKYQCWYI 65.95±1.74
表9结果显示，IRBP-9A至IRBP-9D(SEQ ID NO：190至SEQ ID NO：193)多胜肽可与胰岛素受体结合，其中，以IRBP-9B为例，磷酸酶活性可高达79.76±5.64(活性单位/毫升)。
[实施例13]分子嵌合分析：IRBP-9B进行单一氨基酸的取代所衍生的同源性多胜肽
如表10所示，以固相合成法制备具有针对IRBP-9B进行单一氨基酸的取代所衍生的同源性氨基酸序列(SEQ ID NO：194至SEQ ID NO：364)的多胜肽，并以实施例1所述的方法进行这些多胜肽的分子嵌合试验，评估多胜肽配体与胰岛素受体间的分子间交互作用能量(包括范德华力、排斥能、氢键交互作用能量、库伦静电能量、内部空间能量)，以评分8000至10000标记为「+」；评分10000至12000标记为「++」；评分12000至14000标记为「+++」，其中，评分愈高表示多胜肽与胰岛素受体间的分子间交互作用能量愈大，且结合力愈强。
表10
表10的结果显示，具有针对IRBP-9B进行单一氨基酸的取代所衍生的同源性氨基酸序列(SEQ ID NO：194至SEQ ID NO：364)的多胜肽都具有不同程度的结合到胰岛素受体的能力。
[实施例14]降血糖活性试验
将IRBP-1-68、具有IRBP片段氨基酸序列的多胜肽、以及经多点突变所获得的多胜肽进行降血糖活性试验。首先，使每组3只的血糖代谢正常小鼠(BALB/c)禁食18小时、及糖尿病状态的小鼠(STZ-induced或ob/ob)禁食4小时后，以腹腔注射的方式投予实验组中每只小鼠如表11所示的各种多胜肽(100微升，2.5×10-9莫耳/千克体重)，而对照组中，则投予每只小鼠100微升的水。15分钟后，以腹腔注射的方式将4公克/千克体重的葡萄糖溶液投予正常小鼠(BALB/c)，并将1公克/千克体重的葡萄糖溶液投予糖尿病状态的小鼠(STZ-induced或ob/ob)，以造成小鼠的血糖值快速上升。150分钟后，于小鼠的尾部取血，并以优势血糖机(Accu-Check Advantage，Roche，德国)测量其血糖值，比较并分析实验组与对照组中小鼠的血糖值。
表11
(以Student’s t-test进行统计分析，*p＜0.05)
如表11的结果所示，无论是正常小鼠或是糖尿病状态的小鼠，以2.5×10-9莫耳/千克体重的IRBP-1-68或由其衍生的同源性多胜肽都可以有效地降低小鼠的血糖值。其中，IRBP-1-68、IRBP-50-68、IRBP-60-68、及IRBP-9B的多胜肽在BALB/c小鼠的组别中可达到约61％至70％的血糖抑制比率；IRBP-1-68、IRBP-50-68、IRBP-60-68、IRBP-9A、IRBP-9B、IRBP-9C、及IRBP-9D的多胜肽在STZ-induced小鼠的组别中可达到约22％至67％的血糖抑制比率；IRBP-1-68、IRBP-50-68、及IRBP-60-68的多胜肽在ob/ob或db/db鼠的组别中可达到约33％至55％的血糖抑制比率。上述结果显示IRBP-1-68、具有IRBP-1-68片段氨基酸序列的多胜肽、及经多点突变所得的多胜肽都具有降血糖的功效。
[实施例15]糖化血红素值试验
糖化血红素值(HbA1c)是指生物体的血液中的红血球上所附着的葡萄糖浓度，一般而言，血糖浓度愈高则糖化血红素值愈高，且糖化血红素值也为评估药物治疗糖尿病效果的黄金准则，因此本实施例通过测量糖化血红素值评估多胜肽控制小鼠血糖值的效果。
如表12所示，将IRBP-50-68及IRBP-60-68多胜肽投予糖尿病状态的小鼠(STZ-induced)。在实验组中，以口服方式将1×10-6莫耳/千克体重的多胜肽(20微升)投予每只实验组中的小鼠，而控制组中，则投予每只小鼠20微升的水。28天后测量其糖化血红素值。
表12
多胜肽名称 SEQ ID NO 糖化血红素值(％) (控制组) - 7.55±0.33 IRBP-50-68 SEQ ID NO：6 5.93±0.55* IRBP-60-68 SEQ ID NO：7 5.73±0.11***
(以Student’s t-test进行统计分析，*p＜0.05，***p＜0.001)
如表12所示，本发明多胜肽可以有效地降低糖尿病状态小鼠的糖化血红素值，显示这些多胜肽确实具有控制糖尿病小鼠血糖值的功效。
[实施例16]肝功能指数测定
因为糖尿病患者常发生糖尿病肝肾病变等并发症，因此本实施例通过测量肝功能指数评估多胜肽控制小鼠糖尿病肝病变的效果。
以如实施例14所述的方法，将IRBP-50-68的多胜肽以口服方式投予糖尿病状态的实验组的小鼠，28天后测量其麸氨酸草乙酸转氨酶(GOT)与麸氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)的肝功能指数，以评估该多胜肽对于糖尿病状态小鼠的后续糖尿病肝病变的影响，结果显示于表13。
表13
多胜肽名称 SEQ ID NO GOT GPT (控制组) - 838.45±33.64 202.95±30.10 IRBP-50-68 SEQ ID NO：6 247.89±97.38*** 135.72±30.72*
(以Student’s t-test进行统计分析，*p＜0.05，***p＜0.001)
如表13所示，本发明多胜肽可以有效地降低糖尿病状态小鼠的肝功能指标(GOT及GPT)，显示该多胜肽可通过降血糖的功效而改善糖尿病状态小鼠的后续糖尿病肝病变。
[实施例17]肾功能指数测定
以如实施例14所述方法，将IRBP-50-68及IRBP-60-68的多胜肽以口服的方式投予糖尿病状态的实验组的小鼠，28天后测量其血中尿素氨(BUN)与血清肌酸酐(CRE)的肾功能指数，以评估这些多胜肽对于糖尿病状态小鼠的后续糖尿病肾病变的影响，结果显示于表14。
表14
多胜肽名称 SEQ ID NO BUN CRE (控制组) - 88.84±11.76 0.302±0.06 IRBP-50-68 SEQ ID NO：6 107.25±42.99 0.191±0.12 IRBP-60-68 SEQ ID NO：7 73.17±29.95 0.17±0.04*
(以Student’s t-test进行统计分析，*p＜0.05)
如表14所示，本发明多胜肽可以有效地降低糖尿病状态小鼠的肾功能指数(BUN及CRE)，显示该多胜肽可通过降低血糖而改善糖尿病状态小鼠的后续糖尿病肾病变。
上述实施例仅是用以例示说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。本领域技术人员可在不违背本发明的技术原理及精神的情况下，对上述实施例进行修改及变化，该些变化与修饰均属于本发明专利申请所要求保护的范围。