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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711111333.1 (22)申请日 2017.11.13 (71)申请人 江苏大学 地址 212013 江苏省镇江市京口区学府路 301号 (72)发明人 黄姗芬马海乐李云亮阮思煜 王禹程杨雪陆峰黄畅 (51)Int.Cl. C07K 14/425(2006.01) C12P 21/06(2006.01) (54)发明名称 一种制备玉米醇溶蛋白降血压肽的方法 (57)摘要 本发明公开了一种制备玉米醇溶蛋白降血 压肽的方法， 涉及农副产品深加工领域。 具体涉 及一种在低浓。
2、度的乙醇环境下， 依次采用胰酶和 胃蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白制备高活性降血压 肽的方法。 本发明避免了玉米醇溶蛋白在水溶环 境下溶解性差， 酶解效率低的问题。 在低浓度乙 醇环境下， 胰酶和胃蛋白酶具有较高活性， 同时 玉米醇溶蛋白溶解性很好， 从而显著提高了酶解 效率， 大幅提高酶解产物降血压活性， 降低制备 成本。 权利要求书1页 说明书3页 CN 108003230 A 2018.05.08 CN 108003230 A 1.一种制备玉米醇溶蛋白降血压肽的方法， 其特征在于： 将玉米醇溶蛋白进行可溶化 处理， 调节温度至3050， 加入含有胰酶的水溶液， 进行酶解， 用碱液维持pH为7.0。
3、8.5， 酶解至一定时间后， 加入酸使其pH至1.52.0， 加入胃蛋白酶进行酶解， 维持pH为1.5 2.0， 酶解至一定时间后终止反应， 去除乙醇， 补水灭酶， 冷却， 干燥， 制备成玉米多肽成品。 2.根据权利要求1所述的一种制备玉米醇溶蛋白降血压肽的方法， 其特征在于， 采用 6070乙醇完全溶解玉米醇蛋白。 3.根据权利要求1所述的一种制备玉米醇溶蛋白降血压肽的方法， 其特征在于， 加入胰 酶的水溶液后， 使得乙醇浓度下降至1520。 4.根据权利要求1所述的一种制备玉米醇溶蛋白降血压肽的方法， 其特征在于， 胰酶添 加量35(E/S)， 胃蛋白酶添加量35(E/S)。 5.根据权利。
4、要求1所述的一种制备玉米醇溶蛋白降血压肽的方法， 其特征在于， 胰酶酶 解时间36h， 胃蛋白酶酶解时间24h。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108003230 A 2 一种制备玉米醇溶蛋白降血压肽的方法 技术领域 0001 本发明涉及农副产品深加工领域， 具体涉及在醇溶环境下， 由于胰酶和胃蛋白酶 对乙醇有较好耐受性， 依次酶解玉米醇溶蛋白制备降血压肽的方法。 背景技术 0002 玉米醇溶蛋白资源丰富。 我国是玉米生产大国， 2014年玉米年产量2.15亿吨。 玉米 淀粉生产过程中的主要副产物为玉米蛋白粉， 其中醇溶蛋白占5060。 玉米醇溶蛋白 营养成分丰富， 且不含有毒有害物质， 。
5、目前利用玉米醇溶蛋白的成膜性、 抗氧化性， 被广泛 应用于包装、 保鲜等领域， 但是其高值化利用度低。 近年来研究表明玉米醇溶蛋白是制备降 血压肽非常理想的蛋白资源， 且大多采用酶解法制备玉米醇溶蛋白降血压肽。 但是， 玉米醇 溶蛋白富含谷氨酸、 亮氨酸、 脯氨酸和苯丙氨酸等疏水性氨基酸， 易溶于乙醇溶液， 难溶于 水， 即使是水解能力极强的碱性蛋白酶也很难 “进攻” 其酶切位点， 不仅酶解效率低， 而且碱 性蛋白酶价格昂贵， 提高了制备成本。 0003 胰酶(含胰蛋白酶和糜蛋白酶等)和胃蛋白酶是动物体内重要的消化性蛋白酶， 其 具有较强的专一性， 其中胰蛋白酶对碱性氨基酸组成的肽键具有高度专。
6、一性， 糜蛋白酶能 专一水解Tyr、 Trp和Phe羧基端肽键。 贾俊强研究的降血压肽构效关系表明酶解制备降血压 肽时， 首选酶切位点在Tyr、 Pro、 Trp、 Phe和Leu羧基端的蛋白酶(贾俊强.超声对酶法制备小 麦胚芽降血压肽的影响及其作用机理D.江苏大学， 2009.)。 其中胃蛋白酶能够优先断裂 由色氨酸、 酪氨酸、 苯丙氨酸或亮氨酸等疏水性氨基酸形成的肽键。 胰酶和胃蛋白酶的提取 工艺简单， 不涉及纯化工艺， 且价格低廉。 在水溶环境下， 玉米醇溶蛋白溶解性差， 胃蛋白 酶、 胰酶很难接触到其酶切位点， 且其水解能力不如碱性蛋白酶， 但是， 胰酶和胃蛋白酶对 乙醇具有很强的耐受。
7、性， 研究其在醇溶液中酶解玉米醇溶蛋白制备生物活性肽， 还未见报 道。 发明内容 0004 本发明的目的是为了克服已有技术存在的问题， 提供一种在醇溶环境下， 利用胃 肠消化酶(胃蛋白酶和胰酶)酶解玉米醇溶蛋白制备降血压肽的方法。 具体为在低浓度的乙 醇环境中， 依次利用胰酶、 胃蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白， 制备高活性的降血压肽。 0005 为了实现上述发明目的， 其具体的技术方案如下： 0006 一种制备玉米醇溶蛋白降血压肽的方法， 按照下述步骤进行： 0007 将玉米醇溶蛋白用60-70的乙醇溶解后， 调节温度至3550， 加入含有胰酶 的水溶液进行酶解， 使得乙醇终浓度降为1520， 蛋白。
8、终浓度1.5(m/v)胰酶添加量3 5(E/S)， 采用NaOH溶液维持pH为7.58.5， 酶解36h后结束， 加入HCl调节pH为1.5 2.0， pH稳定后， 加入胃蛋白酶进行酶解， 胃蛋白酶添加量35(E/S)， 维持pH为1.5 2.0， 酶解24h后， 调pH为碱性终止反应， 旋转蒸发去除乙醇， 补水后灭酶， 离心， 收集上清 液， 干燥。 说明书 1/3 页 3 CN 108003230 A 3 0008 本发明的优点： 在醇溶环境下， 用胰酶和胃蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白制备降血压 肽的优势， 一方面， 玉米醇溶蛋白易溶于60的乙醇， 将该体系缓慢加水稀释至1520乙 醇溶液， 玉。
9、米醇溶蛋白在短时间内不会聚集析出， 有效增加酶与蛋白的接触面积， 更有利于 酶 “进攻” 其酶切位点； 另一方面， 胰酶和胃蛋白酶对乙醇具有很好的耐受性， 胰酶和胃蛋白 酶是常用的制备降血压肽的蛋白酶， 且价格便宜。 本发明在蛋白酶活性较高的条件下， 不仅 有效提高玉米醇溶蛋白的溶解性， 而且有效提高酶解产物降血压肽的活性， 从而有效降低 生产成本。 0009 下面通过实施例， 对本发明的技术方案做进一步的详细描述。 具体实施方式 0010 在本发明中所使用的术语， 除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。 下面结合具体的实施例， 并参照数据进一步详细地描述本发明。 应理。
10、解， 这些 实施例只是， 对本发明进行进一步说明， 不能理解为对本发明保护范围的限定， 该领域的技 术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。 0011 在以下的实施例中， 未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用试剂的来源、 商品名以及有必要列出其组成成分者， 均在首次出现时标明， 其后所用相 同试剂如无特殊说明， 均以首次标明的内容相同。 0012 对照例和实施例中降血压活性的测定方法如下： 0013 按照丁青芝建立的血管紧张素转移酶(ACE)体外抑制活性快速检测方法(丁青芝. 脉冲超声辅助酶解法制备玉米黄粉ACEI活性肽的研究D.江苏大学， 200。
11、8.)。 0014 对照例1 0015 称取玉米醇溶蛋白6.75g， 加入150mL蒸馏水， 温度调节至40， 然后称取337.5mg 胰酶于300mL蒸馏水中制得胰酶悬浮液， 边搅拌边缓慢加入胰酶悬浮液， 用1M NaOH稳定pH 至8.0， 在酶解过程中不断滴加NaOH维持pH恒定， 水浴温度恒定。 酶解4h后结束。 加入1M HCl 调节pH至2.0， 在酶解过程中不断滴加NaOH维持pH恒定， 水浴温度恒定。 加入270mg的胃蛋白 酶酶解， 酶解4h后结束。 然后取样， 迅速沸水浴煮沸10min， 冷却后， 10000rpm离心10min， 收 集上清液， -20冻存， 待测ACE抑。
12、制活性。 降血压活性的测定实验结果表明： 酶解产物ACE抑 制活性为31.2。 0016 实施例1 0017 称取玉米醇溶蛋白6.75g， 加入150mL 70乙醇溶液至其完全溶解， 温度调节至40 ， 称取337.5mg胰酶于375mL蒸馏水中制成胰酶悬浮液， 边搅拌边缓慢加入胰酶悬浮液， 用 1M NaOH稳定pH至8.5， 在酶解过程中不断滴加NaOH维持pH恒定， 水浴温度恒定。 酶解6h后结 束。 加入1M HCl调节pH至1.5， 在酶解过程中不断滴加NaOH维持pH恒定， 水浴温度恒定。 加入 270mg胃蛋白酶酶解， 酶解4h后结束。 调pH为8终止反应， 旋转蒸发去除乙醇， 。
13、补水后沸水浴 煮沸10min， 冷却， 10000rpm离心10min， 收集上清液， -20冻存， 待测ACE抑制活性。 降血压 活性的测定实验结果表明： 酶解产物ACE抑制活性为82.7。 0018 实施例2 0019 称取玉米醇溶蛋白6.75g， 加入150mL 60乙醇溶液至其完全溶解， 温度调节至40 ， 称取337.5mg胰酶于300mL蒸馏水中制成胰酶悬浮液， 边搅拌边缓慢加入胰酶悬浮液， 用 说明书 2/3 页 4 CN 108003230 A 4 1M NaOH稳定pH至7.5， 在酶解过程中不断滴加NaOH维持pH恒定， 水浴温度恒定。 酶解3h后结 束。 加入1M HCl。
14、调节pH至2.0， 在酶解过程中不断滴加NaOH维持pH恒定， 水浴温度恒定。 加入 270mg胃蛋白酶酶解， 酶解2h后结束。 调pH为8终止反应， 旋转蒸发去除乙醇， 补水后沸水浴 煮沸10min， 冷却， 10000rpm离心10min， 收集上清液， -20冻存， 待测ACE抑制活性。 降血压 活性的测定实验结果表明： 酶解产物ACE抑制活性为75.4。 0020 实施例3 0021 称取玉米醇溶蛋白6.75g， 加入150mL 60乙醇溶液至其完全溶解， 温度调节至35 ， 称取202.5mg胰酶于300mL蒸馏水中制成胰酶悬浮液， 边搅拌边缓慢加入胰酶悬浮液， 用 1M NaOH稳。
15、定pH至8.0， 在酶解过程中不断滴加NaOH维持pH恒定， 水浴温度恒定。 酶解4h后结 束。 加入1M HCl调节pH至2.0， 在酶解过程中不断滴加NaOH维持pH恒定， 水浴温度恒定。 加入 202.5mg胃蛋白酶酶解， 酶解2h后结束。 调pH为8终止反应， 旋转蒸发去除乙醇， 补水后沸水 浴煮沸10min， 冷却， 10000rpm离心10min， 收集上清液， -20冻存， 待测ACE抑制活性。 降血 压活性的测定实验结果表明： 酶解产物ACE抑制活性为63.8。 0022 实施例4 0023 称取玉米醇溶蛋白6.75g， 加入150mL 60乙醇溶液至其完全溶解， 温度调节至5。
16、0 ， 称取202.5mg胰酶于450mL蒸馏水中制成胰酶悬浮液， 边搅拌边缓慢加入胰酶悬浮液， 用 1M NaOH稳定pH至7.5， 在酶解过程中不断滴加NaOH维持pH恒定， 水浴温度恒定。 酶解3h后结 束。 加入1M HCl调节pH至2.0， 在酶解过程中不断滴加NaOH维持pH恒定， 水浴温度恒定。 加入 202.5mg的胃蛋白酶酶解， 酶解2h后结束。 调pH为8终止反应， 旋转蒸发去除乙醇， 补水后沸 水浴煮沸10min， 冷却， 10000rpm离心10min， 收集上清液， -20冻存， 待测ACE抑制活性。 降 血压活性的测定实验结果表明： 酶解产物ACE抑制活性为54.3。 说明书 3/3 页 5 CN 108003230 A 5 。