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萘并12h 16萘啶3(4H) 酮类化合物及其制备方法和应用.pdf

  • 上传人：倪**
  • 文档编号：8977227
  • 上传时间：2021-01-24
  • 格式：PDF
  • 页数：16
  • 大小：749.42KB
    • 摘要
    申请专利号：

    CN201610554316.4

    		 申请日：

    20160714
    公开号：

    CN106243103B

    		 公开日：

    20171103
    当前法律状态：

    		有效性：

    有效
    法律详情：

    IPC分类号：

    C07D471/04,A61K31/4745,A61K31/5377,A61P35/00

    		 主分类号：

    C07D471/04,A61K31/4745,A61K31/5377,A61P35/00
    申请人：

    广西师范大学
    发明人：

    潘成学,苏桂发,孔石林,戴求资,朱海妙,刘晴晴
    地址：

    541004 广西壮族自治区桂林市七星区育才路15号
    优先权：

    CN201610554316A
    专利代理机构：

    南宁东智知识产权代理事务所(特殊普通合伙)

    		 代理人：

    戴燕桃;巢雄辉
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    内容摘要

    本发明公开了一种萘并[1,2‑h][1,6]萘啶‑3(4H)‑酮类化合物，化合物的通式为其中，R1独立地选自氢、甲基、乙基；R2独立地选自‑(CH2)2N(CH3)2、并公开了其制备方法和在制备抗肿瘤药物方面的应用，经试验证明其对肿瘤细胞具有很好地抑制作用，在抗肿瘤和抑制拓扑异构酶I活性方面都具有广泛的应用前景。

    权利要求书

    1.具有通式(I)的萘并[1，2-h][1，6]萘啶-3(4H)-酮类化合物：其中，R独立地选自氢、甲基、乙基；R独立地选自-(CH)N(CH)、 2.制备具有通式(I)的萘并[1，2-h][1，6]萘啶-3(4H)-酮类化合物的方法，其特征在于：当R为氢、R为-(CH)N(CH)时，包括以下步骤：(1)以1-萘胺和2-腈基-3-乙氧基丙烯酸乙酯为原料，加入乙醇，在氮气或惰性气体保护下，加热回流反应，反应完成后冷却、过滤、洗涤、干燥，所获得的固体产物加入二苯醚，加热回流反应，反应完成后加入溶剂，析出固体，过滤，除去溶剂，获得化合物1(2)化合物1在氮气或惰性气体保护下，进行氯代反应，反应完成后冷却、除去溶剂、中和，再萃取、合并有机层、洗涤、干燥、过滤、除去溶剂，经柱层析获得化合物2(3)加入化合物2、N，N-二甲基乙二胺和甲苯，在氮气或惰性气体保护下，搅拌反应，反应完成后冷却、除去溶剂，经柱层析获得化合物3a(4)加入化合物3、乙酸酐和碱，在氮气或惰性气体保护下，搅拌反应，反应完成后冷却、中和，再萃取、合并有机层、洗涤、干燥、过滤、除去溶剂，所获得的油状物再加入二氯甲烷和叔丁醇钾，在氮气或惰性气体保护下，搅拌反应，反应完成后除去溶剂，经柱层析获得化合物4aA 3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，以1-萘胺和2-腈基-3-乙氧基丙烯酸乙酯为原料，加入乙醇，在氮气或惰性气体保护下，加热回流并搅拌，反应时间为1.5～3h；所获得的固体产物加入二苯醚，加热回流并搅拌，反应时间为0.8～2h。 4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，化合物1加入三氯氧磷，在氮气或惰性气体保护下进行氯代反应，反应温度为75～90℃，反应完成后冷却、除去大部分溶剂，加入冰水，加入饱和碳酸氢钠溶液中和，再萃取、合并有机层，用饱和食盐水洗涤，用去除水分的干燥剂干燥，过滤，除去溶剂，经柱层析获得化合物2。 5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，加入化合物2、N，N-二甲基乙二胺和甲苯，在氮气或惰性气体保护下，搅拌反应2.5～4h，反应温度为85～95℃，反应完成后冷却、除去溶剂，经柱层析获得化合物3。 6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，加入化合物3、乙酸酐和碱，在氮气或惰性气体保护下，搅拌反应2.5～4h，反应温度为110～130℃，反应完成后冷却，加入冰水，加入饱和碳酸氢钠溶液中和，再萃取、合并有机层后，用饱和食盐水洗涤，用去除水分的干燥剂干燥、过滤、除去溶剂，所获得的油状物再加入二氯甲烷和叔丁醇钾，在氮气或惰性气体保护下，搅拌反应3～5h，反应完成后除去溶剂，经柱层析获得化合物4。 7.权利要求1所述的通式(I)的萘并[1，2-h][1，6]萘啶-3(4H)-酮类化合物和药学上可接受的辅料组成的药物组合物。 8.权利要求1所述的通式(I)的萘并[1，2-h][1，6]萘啶-3(4H)-酮类化合物或权利要求7所述的药物组合物在制备抗肿瘤和抑制拓扑异构酶I活性药物方面的应用。 9.如权利要求8所述的应用，所述肿瘤是人胃癌、人肝癌、人非小细胞肺癌、人卵巢癌或人膀胱癌引起的肿瘤。 10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：当所述药物组合物为液体制剂时，通式(I)的萘并[1，2-h][1，6]萘啶-3(4H)-酮类化合物的浓度>15μM。

    说明书

    技术领域

    本发明涉及嘧啶酮并菲啶类化合物及其制备方法和应用，更具体的涉及萘并[1，2-h][1，6]萘啶-3(4H)-酮类化合物，及其制备方法和在制备抗肿瘤和抑制拓扑异构酶I活性药物方面的应用。

    背景技术

    DNA拓扑异构酶(DNA topoisaneras)Topo)是非常重要的核酶，在DNA复制、转录、重组、基因调节及细胞有丝分裂等重要生命活动中起非常重要的作用。在真核细胞中，通常都有拓扑异构酶I(Topo I)拓扑异构酶II(Topo II)俩种。

    在DNA的复制、转录等过程中，TopoI的酪氨酸残基与DNA的3′末端以磷酸二酷键结合，形成TopoI DNA可裂解复合物，介导DNA单链断裂，松弛DNA的超螺旋结构，待完成预定的DNA复制、转录、基因修复或基因表达后，再将已断裂的DNA连接起来。在肿瘤细胞中，TopoI含量及活性往往比正常细胞中要高，通过抑制TopoI对DNA的超螺旋结构的催化解旋，可以选择性抑制肿瘤细胞的快速增殖，起到抗肿瘤效果。因此，TopoI是非常重要的抗肿瘤药物作用靶点，这使得具有抑制拓扑异构酶I活性的化合物，在抗肿瘤新药研发中具有重要应用。

    发明内容

    本发明的目的在于提供一种抗肿瘤和抑制拓扑异构酶I活性的萘并[1，2-h][1，6]萘啶-3(4H)-酮类化合物，及其制备方法和应用。

    为实现上述目的，本发明的技术方案为：

    具有通式(I)的萘并[1，2-h][1，6]萘啶-3(4H)-酮类化合物：

    其中，R1独立地选自氢、甲基、乙基；

    R2独立地选自-(CH2)2N(CH3)2、

    本发明还提供了具有通式(I)的萘并[1，2-h][1，6]萘啶-3(4H)-酮类化合物的制备方法，包括以下步骤：

    (1)以1-萘胺和2-腈基-3-乙氧基丙烯酸乙酯为原料，加入乙醇，在氮气或惰性气体保护下，加热回流反应，反应完成后冷却、过滤、洗涤、干燥，所获得的固体产物加入二苯醚，加热回流反应，反应完成后加入溶剂，析出固体，过滤，除去溶剂，获得化合物1；

    (2)化合物1在氮气或惰性气体保护下，进行氯代反应，反应完成后冷却、除去大部分溶剂、中和，再萃取、合并有机层、洗涤、干燥、过滤、除去溶剂，经柱层析获得化合物2；

    (3)加入化合物2、N，N-二甲基乙二胺和甲苯，在氮气或惰性气体保护下，搅拌反应，反应完成后冷却、除去溶剂，经柱层析获得化合物3；

    (4)加入化合物3、乙酸酐和碱，在氮气或惰性气体保护下，搅拌反应，反应完成后冷却、中和，再萃取、合并有机层、洗涤、干燥、过滤、除去溶剂，所获得的油状物再加入二氯甲烷和叔丁醇钾，在氮气或惰性气体保护下，搅拌反应，反应完成后除去溶剂，经柱层析获得化合物4。

    进一步的，所述步骤(1)中，以1-萘胺和2-腈基-3-乙氧基丙烯酸乙酯为原料，加入乙醇，在氮气或惰性气体保护下，加热回流并搅拌，反应时间为1.5～3h；

    所获得的固体产物加入二苯醚，加热回流并搅拌，反应时间为0.8～2h。

    进一步的，所述步骤(2)中，化合物1加入三氯氧磷，在氮气或惰性气体保护下进行氯代反应，反应温度为75～90℃，反应完成后冷却、除去大部分溶剂，加入冰水，加入饱和碳酸氢钠溶液中和，再萃取、合并有机层，用饱和食盐水洗涤，用去除水分的干燥剂干燥，过滤，除去溶剂，经柱层析获得化合物2。

    进一步的，所述步骤(3)中，加入化合物2、N，N-二甲基乙二胺和甲苯，在氮气或惰性气体保护下，搅拌反应2.5～4h，反应温度为85～95℃，反应完成后冷却、除去溶剂，经柱层析获得化合物3。

    进一步的，所述步骤(4)中，加入化合物3、乙酸酐和碱，在氮气或惰性气体保护下，搅拌反应2.5～4h，反应温度为110～130℃，反应完成后冷却，加入冰水，加入饱和碳酸氢钠溶液中和，再萃取、合并有机层后，用饱和食盐水洗涤，用去除水分的干燥剂干燥、过滤、除去溶剂，所获得的油状物再加入二氯甲烷和叔丁醇钾，在氮气或惰性气体保护下，搅拌反应3～5h，反应完成后除去溶剂，经柱层析获得化合物4。

    上述制备方法的反应式为：

    进一步的，通式(I)的萘并[1，2-h][1，6]萘啶-3(4H)-酮类化合物和药学上可接受的辅料组成的药物组合物；

    本发明进一步提供了通式(I)的萘并[1，2-h][1，6]萘啶-3(4H)-酮类化合物和上述药物组合物在制备抗肿瘤和抑制拓扑异构酶I活性药物方面的应用；药物的剂型可为颗粒剂、胶囊剂、喷雾剂、滴剂、注射剂和冲剂等；所述的肿瘤特别是指人胃癌、人肝癌、人非小细胞肺癌、人卵巢癌或人膀胱癌引发的肿瘤。

    更进一步的，当所述药物组合物为液体制剂时，通式(I)的萘并[1，2-h][1，6]萘啶-3(4H)-酮类化合物的浓度>15μM，具有显著的抑制Topo I对DNA的催化解旋作用，使得其具有抑制拓扑异构酶I活性的功效。

    本发明合成了具有通式(I)的化合物，并提供了其制备方法，通过对人胃癌(MGC-803)、人肝癌(HepG-2)、人非小细胞肺癌(NCI-H460)、人卵巢癌(SKOV3)和人膀胱癌(T24)的细胞体外抑制试验，证实通式(I)的新化合物对肿瘤细胞具有很好地抑制作用。

    经琼脂糖凝胶电泳法试验验证，通式(I)的化合物能有效抑制Topo I对DNA的催化解旋作用，显然，通式(I)的化合物具有抑制拓扑异构酶I活性的效果，可将其直接使用，也可将通式(I)的化合物与药学上可接受的辅料组成药物组合物，药物组合物可为颗粒剂、胶囊剂、喷雾剂、滴剂、注射剂和冲剂等。

    上述添加了对肿瘤细胞具有很好抑制活性的通式(I)化合物的药物组合物，对肿瘤细胞尤其是人胃癌(MGC-803)、人肝癌(HepG-2)、人非小细胞肺癌(NCI-H460)、人卵巢癌(SKOV3)和人膀胱癌(T24)具有很好地抑制活性的作用，将在抗肿瘤和抑制拓扑异构酶I活性方面都具有广阔的应用前景。

    附图说明

    图1是效果验证实施例2的琼脂凝胶电泳实验结果图。

    具体实施方式

    以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例。

    制备实施例1：通式(I)的萘并[1，2-h][1，6]萘啶-3(4H)-酮类化合物的合成

    步骤(1)：在电磁搅拌下，依次向50mL的圆底烧瓶中加入1-萘胺(1.43g，10mmol)、2-腈基-3-乙氧基丙烯酸乙酯(1.85g，11mmol)和无水乙醇(10mL)，在氮气保护下，加热至回流，搅拌反应2h，通过TLC监测反应进程，展开剂为V乙酸乙酯:V石油醚＝1:8，待反应完成后冷却至室温，抽滤，用乙酸乙酯洗涤3次，每次10mL，干燥，得到淡黄色固体2.39g。

    将上述淡黄色固体与二苯醚(10mL)混合，搅拌下加热回流1h，通过TLC监测反应进程，展开剂为V乙酸乙酯:V石油醚＝1:4，待反应完成后，冷却至室温，加入石油醚(15mL)，析出固体，抽滤，滤饼用石油醚充分洗涤并晾干，得到1.76g化合物1。

    化合物1:棕褐色固体，产率80％，m.p.>300℃，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ:13.05(s，1H)，8.80～8.68(m，2H)，8.15～8.05(m，2H)，7.90(d，J＝8.8Hz，1H)，7.83～7.75(m，2H)。

    步骤(2)：向50mL的圆底烧瓶中依次加入化合物1(0.44g，2mmol)和三氯氧磷(4mL)，氮气保护，于80℃下搅拌反应3h，通过TLC监测反应进程，展开剂为V乙酸乙酯:V石油醚＝1:1，待反应完成后，冷却，减压除去大部分溶剂，加入5mL冰水，再加入饱和碳酸氢钠溶液中和，用二氯甲烷萃取3次，每次15mL，合并有机层后，用20mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，粗产物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂:V石油醚:V二氯甲烷＝1:1)得到0.44g化合物2。

    化合物2:白色固体，产率93％，m.p.222～223℃，1H NMR(500MHz，CDCl3)δ:9.29～9.23(m，1H)，9.04(s，1H)，8.11(d，J＝9.1Hz，1H)，8.00(d，J＝9.1Hz，1H)，7.98～7.95(m，1H)，7.86～7.79(m，2H)。

    步骤(3)：向50mL的圆底烧瓶中依次加入化合物2(0.48g，2mmol)、N，N-二甲基乙二胺(0.44mL，4mmol)和甲苯(5mL)，氮气保护，90℃下搅拌反应3h，通过TLC监测反应进程，展开剂为V乙酸乙酯:V石油醚＝1:10；待反应完成后，冷却至室温，减压除去溶剂，粗产物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂:V甲醇:V乙酸乙酯＝1:20)，得到0.43g化合物3a；利用同样方法可合成化合物3b～3d。

    3a:黄色固体，产率91％，m.p.105～106℃,1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:9.21～9.16(m,1H),8.70(s,1H),7.89～7.85(m,1H),7.79(d,J＝9.1Hz,1H),7.74～7.67(m,2H),7.62(d,J＝9.2Hz,1H),6.87(s,1H),3.95～3.90(m,2H),2.69(t,J＝5.8Hz,2H),2.36(s,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:153.0,152.0,146.9,134.2,131.4,129.0,127.7,127.5,127.3,125.6,120.2,116.6,114.5,86.3,57.1,45.0,45.0,41.2。

    3b:白色固体，产率91％，m.p.193～194℃,1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:9.22～9.15(m,1H),8.71(s,1H),7.91～7.86(m,1H),7.83(d,J＝9.1Hz,1H),7.75～7.68(m,2H),7.62(d,J＝9.1Hz,1H),6.84(s,1H),3.96(q,J＝5.8Hz,2H),3.83～3.76(m,4H),2.79(t,J＝5.8Hz,2H),2.63～2.54(m,4H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:152.9,152.1,147.0,134.2,131.5,129.1,127.7,127.6,127.6,125.6,120.0,116.3,114.5,86.7,67.2,67.2,56.1,52.9,52.9,40.1。

    3c:淡黄色固体，产率91％，m.p.118～119℃,1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:9.23～9.15(m,1H),8.71(s,1H),7.91～7.86(m,1H),7.83(d,J＝9.1Hz,1H),7.74～7.67(m,2H),7.65(d,J＝9.2Hz,1H),7.15(br,1H),3.93(dd,J＝10.4,5.6Hz,2H),2.74(t,J＝6.0Hz,2H),2.51(br,4H),1.70～1.63(m,4H),1.59～1.47(m,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:153.0,152.2,147.0,134.2,131.5,129.0,127.7,127.5,127.4,125.6,120.2,116.6,114.6,86.4,56.1,53.8,53.8,40.3,26.5,26.5,24.4。

    3d:白色固体，产率96％，m.p.132～133℃,1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:9.22～9.15(m,1H),8.71(s,1H),7.91～7.86(m,1H),7.83(d,J＝9.1Hz,1H),7.75～7.68(m,2H),7.62(d,J＝9.1Hz,1H),6.84(s,1H),3.96(q,J＝5.8Hz,2H),3.83～3.76(m,4H),2.79(t,J＝5.8Hz,2H),2.63～2.54(m,4H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:153.0,152.2,147.0,134.2,131.5,129.0,127.7,127.6,127.4,125.6,120.3,116.6,114.6,86.4,53.8,53.6,53.6,42.5,23.8,23.8。

    步骤(4)：化合物4的合成(以化合物4aA为例)；向50mL的圆底烧瓶中依次加入化合物3a(0.15g，0.5mmol)，乙酸酐(3mL)和氢氧化钾(0.08g，1.5mmol)，氮气保护，120℃下搅拌反应3h，通过TLC监测反应进程，展开剂为V甲醇:V乙酸乙酯＝1:10，待反应完成后，冷却至室温，加入10mL冰水，再加入饱和碳酸氢钠溶液中和，用二氯甲烷萃取3次，每次10mL，合并有机层后，用15mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，得0.16g棕黄色油状物；

    向50mL的圆底烧瓶中加入上述棕色油状物(0.16g，0.48mmol)、二氯甲烷(4mL)和叔丁醇钾(0.11g，0.96mmol)，氮气保护下，室温搅拌反应4h，通过TLC监测反应进程，展开剂为V甲醇:V乙酸乙酯＝1:10，减压除去溶剂，粗产物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂:V甲醇:V乙酸乙酯＝1:10)，得0.13g化合物4aA，利用同样方法可合成化合物4aB～4aC。

    4aA:淡黄色固体，产率80％，m.p.244～246℃,1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:9.40(s,1H),9.24～9.20(m,1H),8.32(d,J＝9.4Hz,1H),8.02(m,1H),7.90(d,J＝9.4Hz,1H),7.77～7.72(m,2H),7.03(s,2H),5.70(s,1H),4.43(t,J＝6.8Hz,2H),2.70(t,J＝6.8Hz,2H),2.08(s,6H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:164.6,152.3,146.8,145.0,144.4,132.7,130.9,128.7,127.4,127.1,125.3,124.9,122.1,114.4,109.3,93.8,57.5,46.9,45.3,45.3；HRMS(ESI+)m/zcalcd forC20H21ON4[M+H]+333.1715,found 333.1695。

    4aB：白色固体，产率75％，m.p.255～257℃,1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.47(s,1H),9.26～9.21(m,1H),8.34(d,J＝9.4Hz,1H),8.04～7.99(m,1H),7.90(d,J＝9.4Hz,1H),7.77～7.72(m,2H),6.60(s,2H),4.45(d,J＝6.8Hz,2H),2.75(d,J＝6.8Hz,2H),2.12(s,6H),2.03(s,3H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ164.4,147.5,146.0,144.3,142.7,132.5,130.9,128.4,127.3,127.0,125.2,124.7,122.1,114.1,109.2,100.3,57.5,47.5,45.3,45.3,10.5；HRMS(ESI+)m/zcalcd forC21H23ON4[M+H]+347.1872,found 347.1853。

    4aC:淡黄色固体，产率79％，m.p.216～217℃,1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.47(s,1H),9.26～9.21(m,1H),8.34(d,J＝9.4Hz,1H),8.05～8.00(m,1H),7.91(d,J＝9.4Hz,1H),7.77～7.72(m,2H),6.62(s,2H),4.46(t,J＝6.8Hz,2H),2.76(t,J＝6.8Hz,2H),2.60(q,J＝7.3Hz,2H),2.11(s,6H),1.04(t,J＝7.3Hz,3H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:164.1,146.9,146.0,144.5,143.0,132.6,130.9,128.4,127.4,127.0,125.2,124.7,122.1,114.1,109.4,106.6,57.5,47.5,45.3,45.3,17.5,12.0；HRMS(ESI+)m/zcalcd forC22H25ON4[M+H]+361.2028,found 361.2008。

    将化合物3a替换为化合物3b，按照步骤(4)的方法制备4bA～4bC。

    4bA:白色固体，产率66％，m.p.262～263℃,1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:9.40(s,1H),9.25～9.21(m,1H),8.37(d,J＝9.4Hz,1H),8.05～8.02(m,1H),7.92(d,J＝9.3Hz,1H),7.78～7.73(m,2H),7.01(s,2H),5.69(s,1H),4.49(t,J＝6.6Hz,2H),3.32(t,J＝4.3Hz,4H),2.68(t,J＝6.6Hz,2H),2.22(t,J＝4.4Hz,4H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:164.8,152.4,146.7,145.4,144.3,132.7,130.9,128.6,127.4,127.1,125.3,124.8,122.2,114.6,109.4,93.7,66.1,66.1,56.6,53.2,53.2,46.4；HRMS(ESI+)m/zcalcd forC22H23O2N4[M+H]+375.1821,found 375.1803。

    4bB:白色固体，产率71％，m.p.274～275℃,1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:9.47(s,1H),9.25～9.21(m,1H),8.37(d,J＝9.4Hz,1H),8.04～8.00(m,1H),7.90(d,J＝9.3Hz,1H),7.76～7.72(m,2H),6.61(s,2H),4.48(t,J＝6.7Hz,2H),3.37(t,J＝4.3Hz,4H),2.74(t,J＝6.7Hz,2H),2.27(t,J＝4.3Hz,4H),2.03(s,3H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ:164.6,147.6,146.0,144.3,143.1,132.5,130.9,128.4,127.4,127.0,125.1,124.7,122.1,114.3,109.3,100.2,66.1,66.1,56.6,53.2,53.2,47.0,10.5；HRMS(ESI+)m/zcalcd forC23H25O2N4[M+H]+389.1978,found 389.1956。

    4bC:白色固体，产率69％，m.p.256～257℃,1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.48(s,1H),9.26～9.21(m,1H),8.36(d,J＝9.4Hz,1H),8.05～8.00(m,1H),7.91(d,J＝9.4Hz,1H),7.77～7.72(m,2H),6.63(s,2H),4.50(t,J＝6.5Hz,2H),3.34(br,4H),2.72(t,J＝6.5Hz,2H),2.60(q,J＝7.2Hz,2H),2.23(t,J＝4.3Hz,4H),1.04(t,J＝7.3Hz,3H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:164.4,146.9,146.0,144.4,143.4,132.6,130.9,128.4,127.4,127.1,125.2,124.7,122.2,114.3,109.6,106.6,66.1,66.1,56.5,53.2,53.2,47.0,17.5,12.1；HRMS(ESI+)m/zcalcd forC24H27O2N4[M+H]+403.2134,found 403.2115。

    将化合物3a替换为化合物3c，按照步骤(4)的方法制备4cA～4cC。

    4cA:淡黄色固体，产率57％，m.p.253～255℃,1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.39(s,1H),9.26～9.20(m,1H),8.39(d,J＝9.4Hz,1H),8.06～8.00(m,1H),7.89(d,J＝9.4Hz,1H),7.77～7.71(m,2H),6.99(s,2H),5.69(s,1H),4.47(t,J＝6.4Hz,2H),2.64(t,J＝6.3Hz,2H),2.18(s,4H),1.22(s,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:164.9,152.4,146.7,145.5,144.3,132.7,130.9,128.6,127.4,127.1,125.1,124.8,122.3,114.6,109.4,93.7,56.9,54.0,54.0,46.8,25.5,25.5,23.7；HRMS(ESI+)m/zcalcd forC23H25ON4[M+H]+373.2028,found 373.20077。

    4cB:淡黄色固体，产率68％，m.p.239～240℃,1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.46(s,1H),9.26～9.21(m,1H),8.41(d,J＝9.4Hz,1H),8.05～8.00(m,1H),7.88(d,J＝9.4Hz,1H),7.76～7.71(m,2H),6.59(s,2H),4.47(t,J＝6.6Hz,2H),2.69(t,J＝6.6Hz,2H),2.23(br,4H),2.03(s,3H),1.27(br,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:164.6,147.6,146.0,144.2,143.2,132.5,131.0,128.3,127.3,127.0,125.0,124.7,122.3,114.3,109.3,100.2,57.0,54.1,54.1,47.4,25.6,25.6,23.8,10.5；HRMS(ESI+)m/zcalcd forC24H27ON4[M+H]+387.2185,found 387.2165。

    4cC:淡黄色固体，产率63％，m.p.229～230℃,1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.47(s,1H),9.26～9.21(m,1H),8.39(d,J＝9.4Hz,1H),8.05～8.00(m,1H),7.88(d,J＝9.3Hz,1H),7.76～7.71(m,2H),6.60(s,2H),4.48(t,J＝6.5Hz,2H),2.67(t,J＝6.5Hz,2H),2.60(q,J＝7.3Hz,2H),2.18(br,4H),1.24(br,6H),1.04(t,J＝7.3Hz,3H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:164.4,146.9,146.0,144.4,143.5,132.6,131.0,128.3,127.4,127.0,125.0,124.7,122.3,114.3,109.6,106.6,56.9,54.0,54.0,47.5,25.5,25.5,23.8,17.5,12.0；HRMS(ESI+)m/zcalcd forC25H29ON4[M+H]+401.2341,found 401.2319。

    将化合物3a替换为化合物3d，按照步骤(4)的方法制备4dA～4dC。

    4dA:白色固体，产率73％，m.p.235～237℃,1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.46(s,1H),9.23～9.18(m,1H),8.26(d,J＝9.4Hz,1H),8.06～8.01(m,1H),7.94(d,J＝9.4Hz,1H),7.78～7.72(m,2H),7.23(s,2H),5.74(s,1H),4.53(t,J＝6.8Hz,2H),3.15(t,J＝6.6Hz,2H),2.67(br,4H),1.66(br,4H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:165.1,152.9,147.0,145.0,144.7,132.9,131.0,129.0,127.7,127.5,125.9,125.0,122.2,114.6,109.6,93.7,53.6,53.6,53.6,47.1,23.1,23.1；HRMS(ESI+)m/zcalcd forC22H23ON4[M+H]+359.1872,found 359.1860。

    4dB:淡黄色固体，产率69％，m.p.257～259℃,1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.46(s,1H),9.25～9.20(m,1H),8.36(d,J＝9.4Hz,1H),8.04～7.99(m,1H),7.89(d,J＝9.4Hz,1H),7.76～7.71(m,2H),6.60(s,2H),4.46(t,J＝7.0Hz,2H),2.94(t,J＝7.0Hz,2H),2.44(br,4H),2.03(s,3H),1.64～1.57(m,4H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:164.4,147.6,146.1,144.3,142.8,132.5,131.0,128.4,127.3,127.0,125.1,124.7,122.1,114.1,109.1,100.3,54.0,53.6,53.6,48.3,23.1,23.1,10.5；HRMS(ESI+)m/zcalcd forC23H25ON4[M+H]+373.2028,found 373.2014。

    4dC:淡黄色固体，产率71％，m.p.226～228℃,1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.47(s,1H),9.26～9.21(m,1H),8.36(d,J＝9.4Hz,1H),8.05～8.00(m,1H),7.90(d,J＝9.4Hz,1H),7.77～7.71(m,2H),6.62(s,2H),4.48(t,J＝6.9Hz,2H),2.93(t,J＝6.9Hz,2H),2.60(q,J＝7.2Hz,2H),2.41(br,4H),1.59(t,J＝3.1Hz,4H),1.04(t,J＝7.3Hz,3H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:164.2,146.9,146.1,144.5,143.1,132.6,131.0,128.4,127.4,127.1,125.1,124.7,122.1,114.1,109.4,106.6,54.0,53.5,53.5,48.4,23.2,23.2,17.5,12.0；HRMS(ESI+)m/zcalcd forC24H27ON4[M+H]+387.2185,found 387.2169。

    效果验证实施例1：化合物的体外抗肿瘤活性

    I.细胞株培养

    细胞体外抗肿瘤活性筛选的受试细胞株有:MGC-803(人胃癌)、HepG-2(人肝癌)、NCI-H460(人非小细胞肺癌)、SKOV3(人卵巢癌)、T24(人膀胱癌)；用含有10％胎牛血清(50～55mL)以及1％青链霉素(5～6mL)的DMEM(500mL)作为培养液，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，利用倒置显微镜定期观察细胞生长状况，0.25％胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于下述实验。

    П.化合物4对肿瘤细胞株作用的抑制率及IC50值测定

    本实验使用MTT比色法来测定化合物对于肿瘤细胞株的抑制率及IC50值，实验步骤如下:

    (1)收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入180μL，铺板使待测细胞调密度为1000～10000；

    (2)5％CO2，37℃条件下孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)后，加入5种浓度的化合物，每孔20μL，设5个复孔；

    (3)5％CO2，37℃条件下孵育16～48h，倒置显微镜下观察；

    (4)每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h；若化合物4与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，用PBS冲洗2～3遍后再加入含有MTT的培养液；

    (5)终止培养，除去孔内培养液；

    (6)每孔加入100μL二甲基亚砜(AR)，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪OD 570nm处测量各孔的吸光值；

    (7)计算出细胞增殖抑制率：抑制率＝(1–样品组OD值/对照组OD值)×100％

    用SPSS软件分别计算各化合物对于各种肿瘤细胞株的IC50值，所有实验重复3次后取平均值，并算出相对误差

    Ш化合物4抗肿瘤活性结果

    化合物4对体外肿瘤细胞抑制率的测试实验分为初筛与IC50值测试两部分，为了确保加入96孔板后助溶剂DMSO浓度小于或等于1％，所配初始药物浓度为10mmol/L，以化合物终浓度为10μmol/L与不同细胞株作用；设置5个浓度梯度(0.5μmol/L，1μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L)，并以10-羟基喜树碱作为对照组进行IC50值的测定。

    化合物4的通式(即通式(I))

    其中，R1独立地选自-H、-CH3、-C2H5；R2独立地选自-(CH2)2N(CH3)2、

    测定结果见表1：

    表1化合物4对肿瘤细胞株的IC50(μmol/L)

    效果验证实施例2：琼脂糖凝胶电泳法研究代表化合物4cA对拓扑异构酶I的抑制活性

    称取3.7mg化合物4cA溶于1mL DMSO，配成10mM的储存液，分别取2.5μL、5μL、10μL、15μL、20μL储存液用PBS稀释为25μM、50μM、100μM、150μM、200μM的溶液；利用同样方法配制200μM的HCPT溶液，Topo I用PBS稀释为1U/μL的酶液，现配现用。

    称量1.0g琼脂糖加入到100mL电泳缓冲液(TAE)中，微波加热至沸腾，溶解的琼脂糖冷却至60℃时，将温热的凝胶倒入已插好梳子的胶膜中，冷却至室温后上样。

    在0.5mL的EP管中依次加入:ddH2O、10X Buffer、0.1％BSA、4cA稀释液、TopoI、PBR322DNA，总体积为20μL，各物质加入量如表2所示。

    表2琼脂糖凝胶电泳实验各物质加入量

    加入以上物质充分混匀后，置于37℃恒温水浴槽中反应30min，取出，分别加入6X上样缓冲液(4μL)终止反应。分别取上述溶液10μL上样，1％的琼脂糖凝胶电泳槽中电泳(电流110mA、电压85V)120min后，取出，放入EB染料中染色1h，取出，在Tanon成像系统中成像，所获得的结果如图1所示。

    其中，各泳道的物质分别为：

    泳道1:DNA；

    泳道2:TopoⅠ+DNA；

    泳道3:化合物(2.5μM)+TopoⅠ+DNA；

    泳道4:化合物(5μM)+TopoⅠ+DNA；

    泳道5:化合物(10μM)+TopoⅠ+DNA；

    泳道6:化合物(15μM)+TopoⅠ+DNA；

    泳道7:化合物(20μM)+TopoⅠ+DNA；

    泳道8:化合物(20μM)+DNA；

    泳道9:HCPT(20μM)+TopoⅠ+DNA；

    泳道10:HCPT(20μM)+DNA。

    从泳道1与泳道2对比，说明Topo I催化解旋了超螺旋DNA；第泳道3～7与泳道1、泳道2对比可以看出，随着化合物4cA浓度的逐渐增大，在4cA浓度为15μM时明显抑制Topo I解旋超螺旋DNA，开始出现超螺旋DNA条带；泳道8与泳道1对比，出现了拖尾的现象，说明化合物4cA与DNA有一定的直接作用；泳道7与泳道9对比，在相同的浓度下，泳道7出现了明显的超螺旋DNA条带，而泳道9没有，说明化合物4cA抑制Topo I的活性比HCPT的效果好；综上所述，化合物4cA能抑制Topo I对DNA的催化解旋作用，且抑制作用随着化合物浓度的增大而增强。

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