含有番茄LeEXP2基因的重组载体及重组菌及LeEXP2基因在重组菌中的表达.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102286520 B (45)授权公告日 2013.02.13 CN 102286520 B *CN102286520B* (21)申请号 201110161314.6 (22)申请日 2011.06.16 CGMCC NO4123 2010.08.27 201010279932.6 2010.09.13 CN C12N 15/81(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (73)专利权人 天津大学 地址 300072 天津市南开区卫津路 92 号 (72)发明人 马媛媛 邹少兰 张鲲 洪解放 井欣 张敏华 (74)专利代理机构 天津市北洋有限责任专。

2、利代 理事务所 12201 代理人 陆艺 Catala C et al.Lycopersicon esculentum expansin (LeEXP2) mRNA， complete cds， GenBank: AF096776， 1147 bp mRNA linear. NCBI .2000,1-2. Catala C et al.Auxin-regulated genes encoding cell wall-modifying proteins are expressed during early tomato fruit growth.Plant Physiol .2000, 第 1。

3、22 卷 ( 第 2 期 ),527-534. (54) 发明名称 含有番茄 LeEXP2 基因的重组载体及重组菌 及 LeEXP2 基因在重组菌中的表达 (57) 摘要 本发明公开了含有番茄 LeEXP2 基因的重组 载体及重组菌及 LeEXP2 基因在重组菌中的表达， 本发明首先从番茄中克隆了 LeEXP2 基因 ； 进一步 将 LeEXP2 基因构建至巴斯德毕赤酵母表达载体 ； 通过电转化获得一种含有番茄 LeEXP2 基因的重 组巴斯德毕赤酵母菌 ； 诱导番茄 LeEXP2 基因在重 组巴斯德毕赤酵母菌中的表达 ； 本发明的重组菌 能有效地表达目的蛋白 LeEXP2。克服了现有技术 从。

4、植物中纯化出膨胀素的量有限， 无法大量应用 到纤维素降解中， 自然界中有诸多的废弃的木质 纤维素， 本发明获得的 LeEXP2 蛋白能提高纤维素 酶降解纤维素的效率， 对清洁有效的利用废弃的 纤维素生产能源， 解决当前能源危机具有极其重 要意义。 (66)本国优先权数据 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 朱宁 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 7 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 7 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 一种含有番茄 LeEXP2 基因的重组载。

5、体， 其特征是用下述方法构建 ： (1) 提取番茄的总 RNA， 反转录成 cDNA， 以该 cDNA 为模板， 用序列表中 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2 所示核苷酸序列为上、 下游引物进行 PCR， 扩增出序列表中 SEQ ID NO.3 所示的 744bp 的 LeEXP2 基因， 连接至 TA 载体 pGEM-T， 获得含有番茄 LeEXP2 基因的质粒 pGEM-LeEXP2 ； (2)LeEXP2 基因构建至巴斯德毕赤酵母表达载体 ： 以所述质粒 pGEM-LeEXP2 为模板， 以序列表中 SEQ ID NO.4 和 SEQ ID NO.5 所示核苷酸序列为上。

6、、 下游引物进行 PCR 扩增， 获得序列表中 SEQ ID NO.6 所示的 703bp 片段， 将所述 703bp 片段经 TA 克隆连至 pGEM-T 载体， 命名为 pTLeEXP2 ； 提取质粒 pTLeEXP2 和巴斯德毕赤酵母表达载体 pPICZalpha A 质 粒， 用 EcoRI 和 XbaI 同时酶切 pTLeEXP2 和 pPICZalpha A， 经琼脂糖凝胶电泳后回收酶切 pTLeEXP2得到SEQ ID NO.7所示的689bp片段和酶切pPICZalpha A得到的SEQ ID NO.8所 示的3530bp片段 ； 回收产物连接后转化到大肠杆菌TOP10F的感受。

7、态细胞中， 涂含Zeocin 25g/mL 的 LB 平板， 培养 12-16h， 得到含 pPICZalpha A-LeEXP2 质粒的大肠杆菌， 提取大 肠杆菌中 pPICZalpha A-LeEXP2 质粒， 即得到含有番茄 LeEXP2 基因的重组载体。 权 利 要 求 书 CN 102286520 B 2 1/7 页 3 含有番茄 LeEXP2 基因的重组载体及重组菌及 LeEXP2 基因 在重组菌中的表达 技术领域 0001 本发明属于生物工程领域， 具体地涉及一种含有番茄 LeEXP2 基因的重组载体、 含 番茄LeEXP2基因的重组巴斯德毕赤酵母菌及番茄LeEXP2基因在重组巴。

8、斯德毕赤酵母菌中 的诱导表达。 背景技术 0002 纤维素是植物细胞壁的主要成份， 是地球上最大量的可再生碳源物质。利用其进 行生物转化生产燃料乙醇等化学品， 对于当前人类解决能源危机、 粮食短缺、 环境污染等问 题具有极其重要的意义。 纤维素特殊的晶体结构使纤维素酶分子很难靠近纤维素分子内部 的糖苷键， 酶解消耗大量的纤维素酶和时间已成为生物质转化的瓶颈 1。目前运用化学试 剂或高温高压等方式改变纤维结构不仅成本高和费时， 而且也会带来环境污染。 因此， 寻找 温和、 高效、 环保的改变纤维结构的方法尤为迫切。 0003 膨胀素 (Expansins) 是高等植物的细胞壁中普遍存在的一类蛋白。

9、质， 能增强 细胞壁的延展能力， 松弛植物细胞壁从而使细胞扩增， 在植物的生长发育及应答胁迫中 扮演重要角色 2-3。目前发现 Expansins 主要有四个基因家族， 即 -expansin(EXPA)， -expansin(EXPB)， expansin-like A (EXLA) 和 expansin-like B (EXLB)4。Expansin 的典型结构特点为 N- 端信号肽， D1(Domain1) 和 D2(Domain2) 两个结构域由 Linker 相 连。最近在线虫 5 紫贻贝 6， 少数真菌和细菌等生物中也发现了一些在结构上类似于植物 Expansin的同源蛋白 7-1。

10、0。 细胞壁是棉、 麻和纸等纤维素产品的原材料， 若能利用膨胀素改 善或降解纤维素， 将会对清洁降解纤维素生产化工品有重要的意义。但从植物的总蛋白中 纯化出单一的 Expansin 蛋白不仅步骤繁琐难度大而且纯化的量也较为有限， 而且植物膨 胀素难于在细菌的中大量表达 11。这限制了 Expansin 的应用。 0004 番茄的 Expansins 家族有 LeEXP1， LeEXP2， LeEXP3 等蛋白， LeEXP2 被报道在膨胀、 成熟的组织中表达， 参与细胞伸长等方面的生理角色 12-13， 但目前尚未将其在番茄体外的 其他宿主中表达， 也未用其提高纤维素酶降解纤维素材料效率。 0。

11、005 参考文献 ： 0006 1 Merino ST， Cherry J. Progress and challenges in enzyme development for biomass utilization. Adv Biochem Engin/Biotechnol， 2007， 108 ： 95-120.2 Sampedro J， Cosgrove DJ.The expansin superfamily. Genome Biology， 2005， 6(12) ： 1-11. 0007 3 Cosgrove DJ. Loosening of plant cell walls by 。

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13、9) ： 30. 说 明 书 CN 102286520 B 3 2/7 页 4 0010 6 Xu BZ， Hellman U， Ersson B， et al.Purification， characterization and amino-acid sequence analysis of a thermostable， low molecularmass endo-b-(1， 4)-glucanase from bluemussel， Mytilus edulis.Eur J Biochem， 2000， 267(16) ： 4970-4977. 0011 7 Kerffa F，Amor。

14、osoa A，Hermana R，et al.Crystal structure and activity of Bacillus subtilis YoaJ(EXLX1)， a bacterial expansin that promotes rootcolonization.PNAS， 2008， 105(44) ： 16876-16881. 0012 8 Yao Q， Sun TT， liu WF， Chen GJ.Gene cloning and heterologous expression of a novel endoglucanase， swollenin， from Tric。

15、hoderma pseudokoningiiS38.Biosci Biotechnol Biochem， 2008， 72(11) ： 2799-2805. 0013 9 Lee HJ， Lee S， Ko H， Kim KH， Choi I.An Expansin-Like Protein from Hahella chejuensis Binds Cellulose and Enhances Cellulase Activity. Mol. Cells， 2010.29 ： 379-385. 0014 10 Saloheimo M， Paloheimo M， Hakola S， et al。

16、. Swollenin， a Trichoderma reesei protein with sequence similarity to the plant expansins， exhibits disruption activity on cellulosic materials.Eur J Biochem， 2002， 269(17) ： 4202-4211. 0015 11 Kim ES， Lee HJ， Bang WG et al.Functional Characterization of a Bacterial Expansin From Bacillus subtilis f。

17、or Enhanced Enzymatic Hydrolysis of Cellulose.Biotechnology and Bioengineering， 2009. 0016 12 Vogler H， Caderas D， Mandel T， Kuhlemeie C.Domains of expansin gene expression define growth regions in the shoot apex of tomato.Plant Molecular Biology.2003.53 ： 267-272. 0017 13 Reinhardt D，Wittwer F，Mand。

18、el T，and Kuhlemeier C.Localized Upregulation of a New Expansin Gene Predicts the Site of Leaf Formation in the Tomato Meristem. The Plant Cell， 1998 ： 10， 1427-1437. 发明内容 0018 本发明的目的是克服现有技术中存在的不足， 提供一种含有番茄 LeEXP2 基因的 重组载体。 0019 本发明的第二个目的是提供一种含番茄 LeEXP2 基因的重组巴斯德毕赤酵母菌。 0020 本发明的第三个目的提供一种番茄 LeEXP2 基因在重。

19、组巴斯德毕赤酵母菌中的诱 导表达。 0021 本发明的技术方案概述如下 ： 0022 一种含有番茄 LeEXP2 基因的重组载体， 用下述方法构建 ： 0023 (1)提取番茄的总RNA， 反转录成cDNA， 以该cDNA为模板， 用序列表中SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2 所示核苷酸序列为上、 下游引物进行 PCR， 扩增出序列表中 SEQ ID NO.3 所示的 744bp 的 LeEXP2 基因， 连接至 TA 载体 pGEM-T， 获得含有番茄 LeEXP2 基因的质粒 pGEM-LeEXP2 ； 说 明 书 CN 102286520 B 4 3/7 页 5 0024。

20、 (2)LeEXP2 基因构建至巴斯德毕赤酵母表达载体 ： 以所述质粒 pGEM-LeEXP2 为模 板， 以序列表中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列为上、 下游引物进行PCR扩增， 获得序列表中 SEQ ID NO.6 所示的 703bp 片段， 将所述 703bp 片段经 TA 克隆连至 pGEM-T 载体， 命名为 pTLeEXP2 ； 提取质粒 pTLeEXP2 和巴斯德毕赤酵母表达载体 pPICZalpha A 质 粒， 用 EcoRI 和 XbaI 同时酶切 pTLeEXP2 和 pPICZalpha A， 经琼脂糖凝胶电泳后回收酶切 pTLeEXP2得。

21、到SEQ ID NO.7所示的689bp片段和酶切pPICZalpha A得到的SEQ ID NO.8所 示的3530bp片段 ； 回收产物连接后转化到大肠杆菌TOP10F的感受态细胞中， 涂含Zeocin 25g/mL 的 LB 平板， 培养 12-16h， 得到含 pPICZalpha A-LeEXP2 质粒的大肠杆菌， 提取大 肠杆菌中 pPICZalpha A-LeEXP2 质粒， 即得到含有番茄 LeEXP2 基因的重组载体。 0025 一种含有番茄 LeEXP2 基因的重组巴斯德毕赤酵母菌， 用下述方法获得 ： 0026 将 10-15g 的 pPICZalpha A-LeEXP2。

22、 质粒， 用 PmeI 酶切成 SEQ ID NO.9 所示的 4219bp片段， 乙醇沉淀SEQ ID NO.9所示的线性DNA片段， 干燥所述线形DNA片段后溶于无 菌水， 制成浓度为 0.5-1g/L 的线形 DNA 溶液 ； 将 80L 巴斯德毕赤酵母宿主菌 X33 的 感受态细胞与10L的0.5-1g/L的线形DNA溶液混合匀后转移到0-4预冷的电极杯 中， 冰浴 5min， 1500V 电击 5ms， 电击后加入 1mL 冰冷的 1M 山梨醇水溶液到电转杯中， 混匀， 将混合液转移到离心管中， 28-30静置培养1-2h， 在含100g/mL Zeocin的YPD平板上涂 50L-。

23、200L 培养后的混合液， 30倒置培养至菌落出现， PCR 鉴定菌落， PCR 结果为阳性 的菌落为含有番茄 LeEXP2 基因的重组巴斯德毕赤酵母菌 (Pichia pastoris)， 将其中的重 组巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)L15CGMCC NO.4123进行保藏， 保藏单位 ： 中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏日 期 ： 2010 年 8 月 27 日， ( 见保藏存活证明 )。 0027 番茄 LeEXP2 基因在重组巴斯德毕赤酵母菌中的诱导表达， 包括下述步骤 ： 0028 将含有番茄。

24、 LeEXP2 基因的重组巴斯德毕赤酵母菌和巴斯德毕赤酵母宿主菌 X33 分别接种在 2-3ml pH 4.8 的 BMGY 中预培养， 200-250 转 / 分钟， 28-30培养至 OD600 2-6 ； 0029 按 1 100 的体积比分别将步骤的经预培养的菌液转接至 25ml BMGY 培养基 中， 200-250 转 / 分钟， 28-30培养至 OD600 2-6 ； 0030 将步骤培养的菌液分别转接加入至 50ml pH 4.8 的含体积浓度为 0.5 -1甲醇的 BMMY 培养基中， 使菌液的浓度 OD600 0.8-1.5 ； 在 200-250 转 / 分钟， 28-。

25、30摇床中培养， 每 24h 补甲醇至 0.5 -1， 诱导 LeEXP2 因在重组巴斯德毕赤酵母菌 中的表达。 0031 本发明的重组菌能有效地表达目的蛋白LeEXP2。 克服了现有技术从植物中纯化出 膨胀素的量有限， 无法大量应用到纤维素降解中的不足， 蛋白 LeEXP2 能协同纤维素酶提高 纤维素降解产生还原糖的效率。自然界中有诸多的废弃的木质纤维素， 通过本发明的方法 获得的 LeEXP2 蛋白能提高纤维素酶降解纤维素的效率， 避免了现有技术用高温高压和酸 碱水解预处理纤维素等方法对环境造成的污染， 这对清洁有效的利用废弃的纤维素生产能 源， 解决当前能源危机具有极其重要的意义。 附图。

26、说明 说 明 书 CN 102286520 B 5 4/7 页 6 0032 图 1 为 LeEXP2 基因的 PCR 产物凝胶电泳。泳道 1 所示的 DNA 标准分子量 Marker ； 泳道 2 所示的为 LeEXP2 的 PCR 产物凝胶电泳结果。 0033 图 2 为含有番茄 LeEXP2 基因的质粒 pGEM-LeEXP2 的构建策略图。 0034 图 3 为 pTLeEXP2 质粒酶切凝胶电泳。图中泳道 1 为限制性内切酶 EcoRI 和 XbaI 双切 pTLeEXP2 质粒 ； 泳道 2 为 pTLeEXP2 质粒对照 ； M 为 DNA 标准分子量 Marker。 0035 。

27、图 4 为 pPICZalpha A 质粒酶切凝胶电泳。图中 M 为 DNA 标准分子量 Marker， 泳道 1 为 pPICZalpha A 的 EcoR I 和 XbaI 双切产物泳道 2 为 pPICZalpha A 质粒对照。 0036 图 5 是将 LeEXP2 基因构建至巴斯德毕赤酵母表达载体时， 转化后得到的重组质 粒酶切鉴定结果 ： 图中泳道 1 是质粒对照 ； 泳道 2 是限制性内切酶 EcoRI 单切质粒产生的 4219bp 片段 ； 泳道 3 是 XbaI 单切质粒产生的 4219bp ； 泳道 4 是 EcoRI 和 XbaI 双切质粒产 生的 3530bp 和 68。

28、9bp 两个 DNA 片段 ； 泳道 M 为 DNA 标准分子量 Marker。 0037 图 6 为 LeEXP2 基因构建至巴斯德毕赤酵母表达载体的构建策略图。 0038 图 7 为质粒 LeEXP2-pPICZalpha A 酶切凝胶电泳。图中泳道 1 为 pPICZalpha A-LeEXP2 质粒对照 ； 泳道 2 是质粒 pPICZalpha A-LeEXP2 的经 PmeI 单切产生的 4219bp 的 DNA 片段 ； 泳道 M 为 Marker。 0039 图 8 为 PCR 鉴定重组巴斯德毕赤酵母菌株。图中 M 为 Marker ； 泳道 1 到 9 分别对 应 L7， L。

29、9， L10， L11， L12， L13， L14， L15， L16 等菌株的 PCR 结果 ； 泳道 10 是用 X-33 的 DNA 作为 PCR 阳性对照扩增产生的 2.2kb 的片段， 泳道 11 是用水为模板作为 PCR 阴性对照的结 果。 0040 图 9 为不同诱导时间重组菌株 L15 分泌的总蛋白电泳图。泳道 1 为蛋白 Marker， 泳道 2-9 为重组菌 1-8 天分泌表达的 LeEXP2， 泳道 10 为对照菌株巴斯德毕赤酵母宿主菌 X33 在第 8 天分泌的蛋白。 具体实施方式 0041 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。 0042 实施例 1 番茄。

30、 LeEXP2 基因的克隆 0043 用 Trizol 试剂按照试剂盒说明提取番茄的总 RNA ： 取 2ug 总 RNA， 用反转录试剂 盒将其反转录成 cDNA(Promega 公司 )， 以该 cDNA 为模板， 用序列表中 SEQ ID NO.1 和 SEQ IDNO.2 所示核苷酸序列为上游引物和下游引物进行 PCR， 扩增出序列表中 SEQ ID NO.3 所 示的 744bp 的 LeEXP2 基因 ( 见图 1)。回收 PCR 产物， 连接至 TA 载体 pGEM-T(Promega 公 司 ) 得到新的质粒， 经测序证实该质粒含有番茄 LeEXP2 基因， 质粒命名为 pGE。

31、M-LeEXP2， 即 获得含有番茄 LeEXP2 基因的质粒 pGEM-LeEXP2。构建策略见图 2。 0044 实施例 2 LeEXP2 基因构建至巴斯德毕赤酵母表达载体 0045 以质粒 pGEM-LeEXP2 为模板， 以序列表中 SEQ ID NO.4 所示核苷酸序列为上游引 物， 以序列表中 SEQ ID NO.5 所示核苷酸序列为下游引物进行 PCR 扩增， 获得序列表中 SEQ IDNO.6 所示的 703bp 片段， 将所述 703bp 片段与 TA 克隆载体 pGEM-T 连接转化大肠杆菌 TOP10F得到的转化子， 经鉴定转化子中的质粒是由LeEXP2基因与pGEM-T。

32、连接而成， 将转 化子获得的新质粒命名为 pTLeEXP2， 并从上述转化子提取质粒 pTLeEXP2， 并从含有酵母表 达载体 pPICZalpha A 质粒的大肠杆菌中提取 pPICZalpha A 质粒， 用 EcoRI 和 XbaI 同时 说 明 书 CN 102286520 B 6 5/7 页 7 酶切质粒 pTLeEXP2 和 pPICZalpha A ； 琼脂糖凝胶电泳酶切产物 ( 图 3 和图 4)， 经琼脂糖 凝胶电泳后回收酶切 pTLeEXP2 质粒得到 SEQ ID NO.7 所示的 689bp 片段 ( 图 3) 和酶切 pPICZalpha A 质粒得到的 SEQ I。

33、D NO.8 所示的 3530bp 片段 ( 图 4)。回收产物连接后转化 到大肠杆菌TOP10F的感受态细胞中， 涂含Zeocin(购自Invitrogen公司)25g/mL的LB 平板， 37倒置培养 12-16h， 菌落长至直径为 1-2mm ； 挑选平板上的单克隆， 通过菌裂解 PCR 筛选阳性克隆， 提取质粒后用 EcoRI 和 XhaI 酶切验证载体上外源基因的插入 ： 单切质粒皆 产生片段 4219bp， 双切质粒皆产生 3530bp 和 689bp 片段 ( 图 5)， 验证结果与预期一致， 经 测序证实后， 命名为 pPICZalpha A-LeEXP2， 即得到含 pPIC。

34、Zalpha A-LeEXP2 质粒的大肠杆 菌。 提取大肠杆菌中pPICZalpha A-LeEXP2质粒， 即得到含有番茄LeEXP2基因的重组载体。 构建策略见图 6。 0046 实施例 3 LeEXP2 基因整合至巴斯德毕赤酵母染色体 ： 0047 取 10-15g pPICZalpha A-LeEXP2 质粒， 用 PmeI 酶切成线性的 SEQ ID NO.9 所 示的 4219bp 片段， 电泳检测如图 7 所示产生 4219bp 片段， 经酚 / 氯仿抽提后， 乙醇沉淀线 性 SEQ ID NO.9 所示的线性 DNA 片段， 干燥后溶于无菌水， 制成 DNA 浓度为 0.5-。

35、1g/L 线形 DNA 溶液 ； 0048 参照精编分子生物学实验指南(第四版)(P512-513)中的电穿孔转化制备酵母感 受态细胞方法制备巴斯德毕赤酵母宿主菌X-33的感受态细胞， 将80L巴斯德毕赤酵母宿 主菌 X33 的感受态细胞与 10L 的 0.5-1g/L 线形 DNA 溶液混匀后， 转移到 4预冷的 电极杯中， 冰浴 5min， 电压 1500V， 用 eppendorf 公司的电转仪进行电击， 电击 5ms， 电击后 立即加入 1mL 冰冷的 1M 山梨醇水溶液到电转杯中， 混匀， 将混合液转移到 15mL 离心管中， 28-30静置培养 1h， 在含 100g/mL 的 Z。

36、eocin(Invitrogen 公司出售 ) 的 YPD 平板上涂 100L 培养后的混合液， 30倒置培养直至重组菌出现。 0049 YPD 培养基为酵母提取物 10g/L， 蛋白胨 20g/L， 葡萄糖 20g/L， 琼脂 18g/L。 0050 预冷的电极杯的温度也可以是 0-4中的任意一值 ； 28-30静置培养的时间也 可以是 1-2h 中的任意一值 ； 在平板上涂培养后的混合液的体积也可以是 50L-200L 中 的任意一值。以上实验均可获得含有 LeEXP2 基因的重组巴斯德毕赤酵母菌。 0051 实施例 4 LeEXP2 巴斯德毕赤酵母转化子的 PCR 鉴定 0052 提取实。

37、施例 3 中所获得的重组菌的基因组 DNA， 以重组菌的基因组 DNA 为模板， 用 SEQID NO.10 和 SEQ ID NO.11 所示核苷酸序列为上、 下游引物进行 PCR， 以检测外源 DNA 的 插入， 巴斯德毕赤酵母宿主菌 X33 的染色体基因组 DNA 为模板的 PCR 作为阳性对照， 以水为 模板的 PCR 作为阴性对照。PCR 扩增条件为 95变性 30s， 54退火 30s， 72延伸 3min。 PCR 产物电泳， 如图 8 所示 L7， L9， L10， L11， L12， L13， L14， L15， L16 等菌株皆能扩增出插入 到巴斯德毕赤酵母宿主菌 X33 。

38、染色体上的包括 LeEXP2 基因的 1.215kb 的片段， 以及巴斯德 毕赤酵母宿主菌 X33 的 AOX1 基因的 2.2kb 基因片段， 说明上述重组菌皆整合有 LeEXP2 基 因。 0053 实施例 5 甲醇诱导巴斯德毕赤酵母转化子的 LeEXP2 基因表达 0054 接种经实施例 4 鉴定的含有 LeEXP2 基因的重组巴斯德毕赤酵母菌 L7， L9， L10， L11， L12， L13， L14， L15， L16 和巴斯德毕赤酵母宿主菌 X33 分别转接至 2ml， pH 4.8 的 BMGY 培养基预培养， 220 转 / 分钟， 29培养至 OD600 4 ； 说 明 。

39、书 CN 102286520 B 7 6/7 页 8 0055 按 1 100 的体积比分别将步骤的经预培养的菌液转接至 25ml BMGY 培养基 中， 220 转 / 分钟， 29培养至 OD600 4 ； 0056 将步骤培养的菌液分别转接加入至 50ml pH 4.8 的含体积浓度为 0.5甲 醇的 BMMY 培养基中， 使菌液的浓度 OD600 1， 在 220 转 / 分钟， 29摇床中培养， 每 24h 补 甲醇至 0.5， 诱导重组菌分泌表达 LeEXP2。为检测 LeEXP2 能有效地表达且将目的蛋白分 泌到重组巴斯德毕赤酵母菌的细胞外， 从诱导后第 1 天至 8 天取重组菌。

40、生长的培养基进行 蛋白电泳。取样及电泳方式如下 ： 取 100l 培养基， 离心后， 取上清 16l 与 4l 的上样 缓冲液混合， 沸水煮 5 分钟后， 取 12ul 电泳。如图 9 所示， 随着诱导时间的增加， 目的蛋白 LeEXP2分泌的越多， 而对照菌株巴斯德毕赤酵母宿主菌X33则没有目的蛋白LeEXP2的分泌 (图9为不同诱导时间重组菌株L15分泌的总蛋白电泳图)， 各个菌株分泌表达的LeEXP2也 有所差异， 其中重组菌L15分泌的重组蛋白LeEXP2的量较大， 因此， 将重组巴斯德毕赤酵母 菌 (Pichia pastoris)L15 CGMCC NO.4123 进行保藏， 保藏。

41、单位 ： 中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心， 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏日期 ： 2010 年 8 月 27 日， ( 见保藏存活证明 )。 0057 步骤和中培养的转速也可以是 200-250 转 / 分钟中的任意一值 ； 培养温度也 可以是 28 -30中的任意一值 ； 培养菌的浓度 OD600也可以是 2-6 中的任意一值。步骤 中 BMMY 培养基中含甲醇的浓度也可以是 0.5 -1中的任意一值 ； 菌体的浓度 OD600也可 以是0.8-1.5范围中任意一值 ； 转速也可以是200-250转/分钟中的任意一值 ； 培养温度也 可以是 28 -。

42、30中的任意一值， 每 24h 补甲醇的浓度也可以是 0.5 -1中的任意一值。 通过电泳证明这些条件下也可以完成诱导巴斯德毕赤酵母转化子的 LeEXP2 基因表达。 0058 BMGY 培养基为 1酵母提取物， 2蛋白胨， 1.34酵母氮基， 100mM 磷酸钾， 4x10-5生物素， 1甘油， 余量为水。 0059 BMMY 培养基为 1酵母提取物， 2蛋白胨， 1.34酵母氮基， 100mM 磷酸钾， 4x10-5生物素， 0.5 -1甲醇， 余量为水。 0060 上样缓冲液为 15.1g/L 的 Tris， 94g/L 甘氨酸 ； 5.0g/L 十二烷基硫酸钠 (SDS)， 余 量为水。

43、。 0061 实施例 6 LeEXP2 提高纤维素酶降解滤纸的效率 0062 用实施例 5 的方法诱导巴斯德毕赤酵母宿主菌 X33 和重组巴斯德毕赤酵母菌 (Pichia pastoris)L15 CGMCC NO.4123(简称重组菌L15)， 当诱导第六天时， 分别取巴斯德 毕赤酵母宿主菌 X33 和重组菌 L15 分泌表达的培养基 2 毫升， 12000 转 / 分钟离心 1 分钟 后， 取 1.5ml 上清与 50mg 的新华滤纸条在 25ml 具塞试管中室温下温浴 48h， 再加入 0.5ml 的 7U/L 纤维素酶 (Sigma Aldrich 公司 ) 液进行反应， 50水浴 1。

44、hr 后， 每管加入 3mlDNS 溶液， 沸水浴加热 5min， 冷却至室温后定容至 25ml， 测定 OD540的值， 依据葡萄糖的标准曲线 来确定释放的葡萄糖的量 ( 葡萄糖标准曲线的测定方法如下 ： 分别将 2 毫升浓度为 0， 0.5， 1， 1.5， 2.0， 2.5， 3.0.3.5， 4.0mg/ml 的葡萄糖溶液与 3 毫升 DNS 混匀， 沸水浴加热 5min， 冷 却至室温后定容至 25ml， 测定 OD540的值， 以浓度为横坐标， 以各 OD540的值为纵坐标绘制标 准曲线 )。重组菌 L15 的培养基中含有 LeEXP2 蛋白， 其与纤维素酶作用滤纸产生的还原糖 是。

45、 1.34mg ； 而对照巴斯德毕赤酵母宿主菌 X33 的培养基中未有 LeEXP2 分泌， 与纤维素酶作 用滤纸产生的还原糖是 0.88mg。重组菌 L15 诱导表达的 LeEXP2 与纤维素酶协同作用滤纸 说 明 书 CN 102286520 B 8 7/7 页 9 产糖是纤维素酶单独作用的 1.52 倍。所述的 DNS 试剂成份如下 ： 在 1 升 DNS 溶液中含 10g 的 3， 5- 二硝基水杨酸， 10g NaOH， 200g 的酒石酸钾钠， 2g 的苯酚， 5g 的 NaHSO3， 余量为水。 0063 将重组菌 L7， L9， L10， L11， L12， L13， L14 。

46、或 L16 采用本实施例的方法进行上述实 验， 并证明 LeEXP2 协同纤维素酶降解滤纸纤维素比纤维素酶单独作用强。该试验说明了 LeEXP2 能提高纤维素酶降解纤维素材料 - 滤纸的效率。 说 明 书 CN 102286520 B 9 1/7 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 102286520 B 10 2/7 页 11 0003 序 列 表 CN 102286520 B 11 3/7 页 12 0004 序 列 表 CN 102286520 B 12 4/7 页 13 0005 序 列 表 CN 102286520 B 13 5/7 页 14 0006 序 列 表 CN 102286520 B 14 6/7 页 15 0007 序 列 表 CN 102286520 B 15 7/7 页 16 序 列 表 CN 102286520 B 16 1/4 页 17 图 1 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102286520 B 17 2/4 页 18 图 2 说 明 书 附 图 CN 102286520 B 18 3/4 页 19 图 6 说 明 书 附 图 CN 102286520 B 19 4/4 页 20 图 7 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 102286520 B 20 。