用于在昆虫细胞中外源蛋白质表达的昆虫衍生启动子.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102203264 A (43)申请公布日 2011.09.28 CN 102203264 A *CN102203264A* (21)申请号 200880131742.0 (22)申请日 2008.09.02 CECT 7431 2008.07.02 C12N 15/85(2006.01) C12N 15/866(2006.01) A01K 67/033(2006.01) (71)申请人 替代基因表达有限公司 ( 艾尔基尼 克斯 ) 地址 西班牙马德里 (72)发明人 西尔维娅戈麦斯 萨巴斯蒂安 贾维尔洛佩兹 维达尔 伊斯梅尔桑切斯 拉莫斯 科瓦东加阿隆索 马蒂 何塞。

2、安赫尔马丁内斯 埃斯克里 瓦诺 (74)专利代理机构 北京市立方律师事务所 11330 代理人 郑瑜生 (54) 发明名称 用于在昆虫细胞中外源蛋白质表达的昆虫衍 生启动子 (57) 摘要 用于在昆虫细胞中外源蛋白质表达的昆虫衍 生启动子。 在本发明中已经从昆虫(粉纹夜蛾)分 离了调控多核苷酸序列， 其驱动重要的昆虫蛋白 质 (hexamerin) 在幼虫特定的演化阶段表达。所 述调控多核苷酸序列促进外源基因在杆状病毒系 统中比常规的多角体蛋白启动子更强的表达。另 外， 相对于生物技术工业中使用的常规杆状病毒， 本发明的新的幼虫起源启动子与 pL 启动子的组 合提高杆状病毒表达水平最高达到 6。

3、1 -375 (取决于侵染时间)。 启动子 pB2 还驱动基因比多 角体蛋白启动子更早表达， 该特征对于正确的蛋 白质折叠及翻译后修饰而言是重大优点。 (85)PCT申请进入国家阶段日 2011.04.29 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2008/061580 2008.09.02 (87)PCT申请的公布数据 WO2010/025764 EN 2010.03.11 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 序列表 3 页 附图 4 页 CN 102203270 A1/2 页 2 1。

4、. 用于开发表达调控多核苷酸序列的方法， 其包括 ： a) 分离任何包括它们的相应调控多核苷酸序列的多核苷酸序列， 其位于编码 hexamerin 家族蛋白质的基因的可读框上游 ； 和 b) 通过传统手段扩增步骤 a) 的调控多核苷酸序列。 2.根据权利要求1的方法， 其特征为最终开发的调控多核苷酸序列特征为SEQ ID NO ： 1(pB1) 和 SEQ ID NO ： 2(pB2)。 3.根据权利要求1或2的方法， 其特征为所述扩增是通过使用引物SEQ ID NO ： 3和SEQ ID NO ： 4 用于开发 pB1 和通过使用引物 SEQ ID NO ： 5 和 SEQ ID NO ： 。

5、6 用于开发 pB2 而进行 的。 4. 根据权利要求 1 的方法， 其特征为所述调控多核苷酸序列属于昆虫幼虫。 5. 根据权利要求 4 的方法， 其特征为所述昆虫幼虫是粉纹夜蛾。 6. 调控多核苷酸序列， 其来源于位于编码 hexamerin 家族蛋白质的基因可读框上游的 任何多核苷酸序列。 7. 根据权利要求 6 的调控多核苷酸序列， 其特征为其为启动子。 8. 根据权利要求 6 或 7 的调控多核苷酸序列， 其选自 SEQ ID NO ： 1(pB1)、 SEQ ID NO ： 2(pB2)， 或其任何部分片段， 其来源于位于编码 hexamerin 家族蛋白质的基因的可读框上 游的任何。

6、调控核苷酸区域的任何序列。 9. 调控多核苷酸序列， 其特征为包括权利要求 6-8 任一项的调控多核苷酸序列以及任 何其它调控多核苷酸序列的序列。 10. 根据权利要求 9 的调控多核苷酸序列， 其中所述其他调控多核苷酸序列是蛋白质 多角体蛋白的启动子或蛋白质 p10 的启动子。 11. 根据权利要求 9 或 10 的调控多核苷酸序列， 其特征为包括 pB2 序列 (SEQ ID NO ： 2) 及蛋白质多角体蛋白的启动子序列。 12. 根据权利要求 9 或 10 的调控多核苷酸序列， 其特征为包括 pB1 序列 (SEQ ID NO ： 1) 及蛋白质多角体蛋白的启动子序列。 13. 根据权。

7、利要求 9 或 10 的调控多核苷酸序列， 其特征为包括 pB2 序列 (SEQ ID NO ： 2) 及蛋白质 p10 的启动子序列。 14. 根据权利要求 9 或 10 的调控多核苷酸序列， 其特征为包括 pB1 序列 (SEQ ID NO ： 1) 及蛋白质 p10 的启动子序列。 15. 调控多核苷酸序列， 其特征为包括权利要求 8 中其任何序列的组合。 16. 根据权利要求 15 的调控多核苷酸序列， 其特征为包括 pB1 序列 (SEQ ID NO ： 1) 及 pB2 序列 (SEQ ID NO ： 2)。 17.根据权利要求15的调控多核苷酸序列， 其特征为包括pB1序列(SE。

8、Q ID NO ： 1)， 所 述 pB1 序列至少重复两次。 18.根据权利要求15的调控多核苷酸序列， 其特征为包括pB2序列(SEQ ID NO ： 2)， 所 述 pB2 序列至少重复两次。 19. 权利要求 6-18 的调控多核苷酸序列用于构造表达载体的用途。 20. 根据权利要求 19 的用途， 其中所述表达载体是病毒， 优选杆状病毒。 21. 根据权利要求 19 的用途， 其中所述表达载体是质粒。 权 利 要 求 书 CN 102203264 A CN 102203270 A2/2 页 3 22. 表达载体， 其特征为包括权利要求 6-18 的任何调控多核苷酸序列及至少编码目标 。

9、蛋白质的序列。 23. 根据权利要求 22 的表达载体， 其特征为其为病毒， 优选杆状病毒。 24. 根据权利要求 22 的表达载体， 其特征为其为质粒。 25. 由权利要求 22-24 的表达载体转化或转染的细胞。 26. 根据权利要求 25 的细胞， 其特征为它们是昆虫细胞优选来自 Spodoptera frugiperda 的 sf9 或 sf21。 27. 昆虫幼虫， 其被权利要求 22-24 的表达载体转染、 感染或转化。 28. 用于生产重组蛋白质的方法， 其包括用权利要求 22-24 的表达载体接种或转染昆 虫细胞或昆虫幼虫， 以及通过传统手段提取和纯化目标重组蛋白质。 29. 。

10、权利要求 22-24 用于生产重组蛋白质的用途。 30. 权利要求 25 或 26 的细胞用于生产重组蛋白质的用途。 31. 权利要求 27 的昆虫幼虫作为生物工厂用于生产重组蛋白质的用途。 权 利 要 求 书 CN 102203264 A CN 102203270 A1/7 页 4 用于在昆虫细胞中外源蛋白质表达的昆虫衍生启动子 技术领域 0001 本发明可以涉及生物技术领域。本发明涉及源自昆虫中 hexamerin 家族基因的调 控多核苷酸序列 ( 如启动子 )， 和它们用于在昆虫细胞和昆虫幼虫中外源蛋白质表达的用 途， 例如使用杆状病毒表达载体。 背景技术 0002 杆状病毒 - 昆虫细。

11、胞表达系统是通用的和广泛地用来产生异源的 ( 天然的和重 组 ) 蛋白质。这个系统被普遍地接受作为最强的和通用的系统之一以生产任何尺寸的重组 蛋白质。它基于两个主要的特性 ： 获得高含量的蛋白质表达和恰当的蛋白质折叠以变得生 物活性， 同时出现哺乳动物细胞的重要的翻译后修饰。另外， 这个系统的开发时间较短， 重 组病毒的遗传稳定性非常高。杆状病毒基因组包含两个强的启动子， 称为多角体蛋白启动 子 (pL) 和启动子 p10(p10 蛋白质 )， 其中多角体蛋白启动子 (pL) 是高等生物中已知的最 强启动子。pL 启动子可用于控制几乎任何基因的表达。与基于转化动物细胞或转基因动 物的任何其他先。

12、进生产系统相比， 更快速和更便宜地设计杆状病毒用于蛋白质生产。尽管 如此， 先前的市售可得的启动子具有一些缺点， 如它们促进基因表达的时期非常晚。那时， 细胞机制被大大影响， 并且随后在昆虫细胞中表达的异源蛋白质的产率可能被影响， 由于 不完全的加工和聚集。这些限制可以是由于寄主细胞因子随着病毒感染进行而恶化。为了 解决那样问题， 本发明建议使用具有稳定的表达的早期启动子， 其至少与多角体蛋白启动 子一样强， 作为非常令人感兴趣的选择以抵消寄主细胞分解的影响， 同时获得异源蛋白质 的高表达水平。本发明希望强调这样的事实 ： 幼虫 ( 不成熟的 ) 向成虫 ( 成熟 ) 形式的转 变是通过在各种。

13、组织 ( 昆虫变形发育 ) 中激活和抑制许多基因实现的。在变形相关蛋白质 中， 存在被称为 hexamerin 的家族， 其在最后的龄虫期间以非常高的水平表达。这些蛋白质 主要是血淋巴储存蛋白质， 其在后幼虫发育期间被使用。在五龄期的最初 48 小时期间能够 观察到 hexamerin 的最高水平， 其为该时期后的大约 4 倍 ( 图 1)。在本发明中已经开发了 用于外源蛋白质表达的启动子家族， 其脱离了编码上述幼虫蛋白质家族的序列。 因此， 本发 明提供了启动子 pB1(SEQ ID NO ： 1) 和 pB2(SEQ ID NO ： 2)， 其与现有技术中使用的启动子 相比更早期和更强。 。

14、在本发明中已经分离了在特定的进展幼虫阶段驱动重要昆虫蛋白质表 达的启动子。它们来自编码幼虫中蛋白质 hexamerin 的序列， 并且可以用于构造任何表达 载体 ( 如杆状病毒表达载体 ) 以便在多种昆虫细胞中表达异源蛋白质， 优选来自草地夜蛾 (Spodoptera frugiperda)的sf9或sf21细胞。 与构成这些新的启动子类似的调节序列已 经在鳞翅目幼虫中被鉴定， 但之前还未曾用于杆状病毒表达系统。 发明内容 0003 简要说明 0004 由此， 本发明提供了来自调节 hexamerin 家族基因表达的序列的调控多核苷酸序 列， 如pB1(SEQ ID NO 1)和/或pB2(S。

15、EQ ID NO 2)。 这些蛋白质在五龄期期间显示出最高 说 明 书 CN 102203264 A CN 102203270 A2/7 页 5 的表达， 在该幼虫发育期的最初 48 小时候以非常高的百分比， 呈现出在短时期内非常快速 的积聚 ( 图 1)。这些特征暗示这些蛋白质的表达是由强的启动子驱动的， 这些启动子可用 于形成更有效率的杆状病毒或任何其它表达载体， 并且因此用于优化异源蛋白质的表达。 在杆状病毒表达系统情况下， 一旦蛋白质集中在分泌途径中， 则启动子的早期活性是特别 相关的， 如果其他方式的话， 则会受到细胞翻译后机制和分泌机制在杆状病毒感染的非常 晚期改变的影响。 000。

16、5 本发明的启动子的序列来自调节 hexamerin 家族基因 (BJHSPl 和 BJHSP2) 表达的 序列， 但是具有一些不包含在所述 hexamerin 家族基因原始调控核苷酸序列中的突变。所 述分离自粉纹夜蛾 (Trichoplusiani)(T.ni) 幼虫并通过质谱分析鉴定为在 80KDa 的带 中 ( 图 2)。一旦蛋白质被鉴定， 则分离编码它们的基因以及包含它们的各自启动子的上游 序列。用于扩增各原始的启动子的引物在该专利中被指定。特征为 SEQ ID NO ： 3 和 4 的引 物用于扩增原始的启动子， 其最终起源于启动子 pB1(SEQ ID NO ： 1)。特征为 SE。

17、Q ID NO ： 3 和 4 的引物 5 和 6 的引物用于扩增原始的启动子， 其最终起源于启动子 pB2。 0006 本发明的启动子的主要优点， 具体地 pB2， 是这样的启动子， 与现在在杆状病毒表 达系统中使用的已知的非常晚期启动子相比， 它们产生更早和更强的目标蛋白质的表达。 0007 在优选实施方案中， 本发明还包括本发明的启动子 pB1 和 pB2( 优选 pB2) 与任何 其它启动子例如 pL 或 p10( 优选 pL) 的组合。令人惊讶地， 当进行这样的组合时， 实现了协 同作用。当测试包括 pLpB2 启动子的杆状病毒表达载体时， 相对于仅仅使用 pL 启动子， 目 标蛋白。

18、质的表达水平被提高最高达到61-375(取决于侵染时间)。 这个实施方案对本 发明来说是非常重要的， 因为现在启动子 pL 通常用于生物技术工业。 0008 在其它优选的实施方案中， 本发明还涉及本发明的启动子 (pB1 和 pB2) 的组合 ： pB1-pB1、 pB2-pB2 和 pB1-pB2。 0009 在哺乳动物细胞中没有检测到本发明的启动子的活性。因而， 本发明还提供了两 个安全的启动子用于开发杆状病毒重组体。 0010 因此， 本发明阐明 ( 参见发明的详细说明 ) 调控多核苷酸序列 ( 启动子 )， 比现有 技术中所涉及的那些更有效， 可以衍生自任何位于编码 hexamerin。

19、 家族蛋白质的基因可读 框上游的多核苷酸序列。因此， 源自位于编码 hexamerin 家族蛋白质的基因的可读框上游 任何多核苷酸序列的任何调控多核苷酸序列都包括在本发明的目标中。 0011 仅用于本发明的目的， 定义下列术语 ： 0012 - 调控多核苷酸序列 ： 是通常位于允许基因转录的基因上游 ( 朝有义链 5区域 ) 的 DNA 区域。 0013 - 载体表达 ： 载体用于在细胞内部传递外源的遗传物质。这个载体包含必要 的调节序列以驱动克隆基因或基因的转录和翻译， 由此转录和克隆DNA。 杆状病毒表达载体 优选用于本发明。 0014 - 杆状病毒 ： 是传染性的病毒家族用于无脊椎动物，。

20、 主要地感染昆虫和节肢动物。 0015 -重组DNA ： 它是一种人造的DNA形式， 通过组合或插入一个或多个DNA链被构建， 由此组合通常不会出现在一起的 DNA。重组 DNA 是通过添加相应的 DNA 入现有生物基因组 内而产生的。重组蛋白质 ： 通过重组 DNA 编码的蛋白质。 0016 - 早期表达 ： 这个术语是指启动子开始表达目标蛋白质的时间。在本发明中， 该时 说 明 书 CN 102203264 A CN 102203270 A3/7 页 6 间起始于感染后 16 小时。 0017 - 更强的表达 ： 这个术语是指任何目标蛋白质的表达， 其水平与通过常规的杆状 病毒启动子 p1。

21、0 或 pL 所实现的表达水平相当或者更高。 0018 - 目标蛋白质 ： 可以用于人和动物的蛋白质， 其可以具有工业的、 商业的或治疗的 应用。 0019 - 生物工厂 ： 遗传修饰或未遗传修饰的细胞或生物， 其可以产生工业规模比例的 蛋白质， 具有许多应用包括治疗目的(抑制剂、 酶、 抗体、 抗原等)或商业用途的主要或次级 产品。 0020 - 部分片段 ： 这个表达是指任何源自本发明的调控多核苷酸序列的部分片段， 具 有相同改进的性质 ： 与现有技术的那些相比更早或者更强。 附图说明 0021 图 1 ： 在粉纹夜蛾的首先四个进展阶段显示缺少 80kDa 带， 其在后面被称为 hexam。

22、erin(A)， 在第五幼虫龄中的 2 天后出现了该带 (B)。图 C 显示在第五幼虫龄的最初 6 天， 密度测定法量化这个带。 0022 图 2 ： 质谱分析鉴定 80KDa 带的方案。 0023 图 3 ： 产生的表达载体， 其仅携带启动子 pB1 序列或 pB2 结合 pL 序列 (pLpB2)。 0024 图 4 ： 昆虫 sf21 细胞和昆虫幼虫， 其在不同的时期感染重组体杆状病毒后， 表达绿 色荧光蛋白 (GFP) 在不同的启动子控制下 (pB1、 pB2、 pL 和 pLpB2)。在该图中， 描述了感染 72 小时后的幼虫。 0025 图 5 ： 通过利用不同的启动子插入杆状病毒。

23、载体 (pB1、 pB2、 pL 和 pLpB2) 在不同的 感染后时间表达 GFP(16-72h) 和通过蛋白质印迹检测 (A)。通过 GFP 带密度测定法 (B) 或 通过细胞提取物的荧光 (C) 量化重组蛋白质。 具体实施方式 0026 本发明提供调控多核苷酸序列如启动子序言和 pB1 和 pB2， 其特征分别为 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2， 且来源于位于昆虫幼虫中编码 hexamerin 家族蛋白质的基因可读框 上游的多核苷酸序列。 本发明进一步设计使用这样的调控多核苷酸序列用于构造昆虫表达 载体如杆状病毒和用于在细胞中优选昆虫细胞表达异源蛋白质。启动子。

24、 pB1 和 pB2 的序列 分别来自T.ni hexamerin BJHSPl和BJHSP2， 其在五龄期以高水平表达， 并且在该时期的最 初 48 小时期间以非常高的转录活性表达 ( 图 1)。 0027 pB1 序列包括 1057 个核苷酸 (SEQ ID NO 1)， 且源自编码 BJHSPl 蛋白质起始密码 子的基因上游的 5区， BJHSPl 是可以由保幼激素抑制的碱性蛋白 1。通过使用两个特定 的引物从 T.ni 基因组 DNA 扩增该序列 ： SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 4。然后， 将该片段克 隆在 pGEM-Teasy 商业载体中 (Promega。

25、)。 0028 pB2 序列包括 1041 个核苷酸 (SEQ ID NO 2)， 且源自编码 B JHSP2 蛋白质起始密 码子的基因上游的 5区， B JHSP2 是可以由保幼激素抑制的碱性蛋白 2。通过使用两个特 定的引物从 T.ni 基因组 DNA 扩增该序列 ： SEQ ID NO ： 5 和 SEQ ID NO ： 6。然后， 将该片段 克隆在 pGEM-Teasy 商业载体中 (Promega)。 说 明 书 CN 102203264 A CN 102203270 A4/7 页 7 0029 用 BamHl 和 Sphl 酶从 pGEM-Teasy 提取 pB1 和 pB2 序列。

26、， 并且克隆至 pFasTBac 双 向商业质粒 (INVITROGEN) 的那些位点中。这个 pFasTBac 双向载体被所提到的酶打开， 其 除去了杆状病毒启动子序列 ( 获得的载体被命名为 ： pFBpB1 和 pFBpB2)。所有它们都呈现 出了克隆位点以引入目标 cDNA。这些用于形成重组体杆状病毒， 其能够感染和在昆虫细胞 和昆虫幼虫中复制。另外， 通过用限制性内切酶 Notl 和 Pstl( 两个限制性位点来自 pGemT easy载体)消化来提取pB2序列， 并且克隆至pFasTBac1商业载体(INVITROGEN)相同的位 点内， 并且在 pL 启动子序列之后。获得的载体被。

27、命名为 ： pFBpLpB2。 0030 因此， 本发明的第一实施方案是指用于产生表达调控多核苷酸序列的方法 ： SEQ ID NO ： 1(pB1) 和 SEQ ID NO ： 2(pB2)。所述方法包括分离位于编码 hexamerin 家族蛋白质 的基因的可读框上游任何多核苷酸序列的任何调控多核苷酸序列。 一旦调控多核苷酸序列 被测序， 则它们通过传统手段被扩增。 0031 在本发明的优选实施方案中， hexamerin 可读框的上游多核苷酸序列属于昆虫， 优 选粉纹夜蛾。 0032 本发明的第二实施方案是指调控多核苷酸序列 ： SEQ ID NO ： 1(pB1)、 SEQ ID NO 。

28、： 2(pB2)， 或其任何部分片段， 其特征为包含源自位于编码 hexamerin 家族蛋白质的基因的 可读框上游的任何调控核苷酸区域的任何序列。这些启动子序列呈递调控 DNA 基序， 涉及 转录活性的调节。 因此， 这些序列可以通过激素在幼虫发育期间调节， 但其他信号也可能潜 在地在细胞培养以及在表达载体上下文中。 0033 在优选实施方案中， 本发明的调控多核苷酸序列 ： SEQ ID NO ： 1(pB1) 和 SEQ ID NO ： 2(pB2) 与任何其它调控多核苷酸序列组合， 优选启动子 pL( 蛋白质 polyedrin 的启动 子 ) 或 p10( 蛋白质 p10 的启动子 。

29、)， 得到不同的组合 ： pLpB2、 pLpB1、 p10pB2 和 p10pB1。本 发明提供了非常强的启动子序列， 当 pL 序列 (polyedrin 启动子 ) 与 pB2 序列组合时。 0034 在其它优选实施方案中， 本发明的调控多核苷酸序列 ： SEQ ID NO ： 1(pB1) 和 SEQ ID NO ： 2(pB2) 被组合得到不同的组合 ： pB1pB2、 pB1pB1( 至少重复两次 ) 和 pB2pB2( 至少 重复两次 )。 0035 已经显示， 串联定位的启动子提高了重组蛋白表达在细菌和植物中的效率 (H ichev AA 等 人， Genetika.19872。

30、3 ： 197-201 ； Kay R 等 人， Science.1987 Jun 5 ； 236(4806) ： 1299-1302.)。 0036 本发明的第三实施方案是指使用任何上述的调控多核苷酸序列用于构造表达载 体， 优选杆状病毒或质粒。 0037 本发明的第四实施方案是指表达载体， 其特征在于包括任何上述说明的调控多核 苷酸序列和至少编码目标蛋白质的序列。在优选实施方案中， 在载体是杆状病毒或质粒。 0038 本发明的第五实施方案是指被表达载体转染的细胞， 或者被重组病毒感染用作 前一段落所述的载体。在优选实施方案中， 细胞是昆虫细胞， 优选来自草地夜蛾的 sf9 或 sf21。 。

31、0039 本发明的第六实施方案是指昆虫幼虫， 其被上述的表达载体转化、 转染或感染。 0040 本发明的第七实施方案是指用于在昆虫细胞或昆虫幼虫中利用上述的表达载体 产生重组蛋白质的方法， 以及通过传统手段提取和纯化目标重组蛋白质。 0041 本发明的第八实施方案是指使用所述表达载体用于产生重组蛋白质。 说 明 书 CN 102203264 A CN 102203270 A5/7 页 8 0042 本发明的第九实施方案是指使用所述细胞用于产生重组蛋白质。 0043 本发明的最后的实施方案是指使用所述昆虫幼虫作为生物工厂用于产生重组蛋 白质。 0044 根据布达佩斯条约的微生物保存 0045 在。

32、 2008 年 7 月 2 日， 这些质粒被保藏在西班牙典型培养物保藏中心 (CECT) ； University of Valencia， Spain， 其保藏号 ： CECT 7431。 0046 实施例 0047 通过以下实施例充分阐明本发明， 这些实施例不应该被解释为对本发明范围的限 制。相反地， 必须清楚地理解其它实施方案、 改变和其等同可以被使用， 这是本说明书可以 暗示本领域技术人员的， 而且不会离开本发明的主旨和 / 或所附权利要求的范围。 0048 本发明的实施例表明与使用常规的启动子相比， 蛋白质表达发生在感染后的更早 期时间。此外， 对于 pB2 和 pLpB2 启动子序。

33、列， 与现有技术中获得的那些启动子 ( 启动子 pL) 相比， 表达水平在感染后时间早期和晚期都更高。 0049 实施例 1 ： 通过本发明的昆虫启动子表达绿色荧光蛋白 (GFP) 0050 克隆 GFP 0051 通过Sphl限制性内切酶从pFBpLGFP质粒提取GFP， 并克隆入pFBpB1或pFBpB2质 粒的 Sphl 限制性位点内。获得的供体 - 表达质粒分别被命名为 pFBpBIGFP 和 pFBpB2GFP。 在所有情况中， 都除去pL序列， 因而GFP表达仅仅由于不同昆虫启动子自身的活性(图3)。 0052 另一方面， 两侧为 Not I 和 PstI 限制性位点的 pB2 启。

34、动子被连接至也被相同限制 性内切酶打开的 pFBpLGFP。所获得的供体 - 表达质粒被命名为 pFBpLpB2GFP， 并且所包含 的 GFP 编码基因在双重启动子 pL 和 pB2 的控制下 ( 图 3)。 0053 GFP- 杆状病毒表达载体的构建 0054 通过自动测序对所得到的质粒进行鉴定， 并且用于产生重组杆状病毒、 BocpB2GFP， BacpB1GFP 和 BacpLpB2GFP，使 用杆 状 病 毒 表 达 载 体 (Invitrogen， USA)， 按照制造商的指导。简言之， 将所得到的供体表达 - 质粒用于转化 DHlOBacTM大肠杆菌 (E.coli) 细胞以易位。

35、进入重组杆粒。将 1g 的每种杆粒用于转染 1x 106 Spodoptera fnigiperda sf21 细胞， 使用Reagent。在 27 摄氏度接种 72 小时后， 获得 Pl 病毒储液。根据制造商的指导， 扩增杆状病毒。将 sf21 昆虫细胞在 BD BaculoGoldTM TNM-FH Insect Medium(BD Biosciences)上进行培养， 其中BD BaculoGoldTM TNM-FH Insect Medium(BD Biosciences)补充了50mg/mL庆大霉素。 根据相同的规程使用 pFBpLGFP 质粒获得了之前在我们实验室产生的杆状病毒 B。

36、acpLGFP。 0055 昆虫接种 0056 随后以 0.1cfu 的感染复数感染细胞， 并将细胞在感染后 16、 24、 48 或 72 小时通过 在 2000rpm 下离心 5 分钟进行沉淀。 0057 并且在感染后不痛时间在荧光显微镜中对感染的细胞进行拍照， 照片显示在图 4 中。显著的是， 与 pL 启动子相比， pB2 和 pLpB2 启动子序列的早期 ( 感染后 16 小时开始 ) 活性以及二者的强度要更高， 甚至在感染的后期 ( 感染后 48h 和 72 小时 )。pB1 启动子还 呈现出活性， 尽管不如 pB2 或 pL 启动子强。 0058 昆虫生长条件和接种 说 明 书 。

37、CN 102203264 A CN 102203270 A6/7 页 9 0059 将五龄期粉纹夜蛾幼虫在腹足附近 ( 朝向体腔 ) 注射重组体杆状病毒， 使用 104-105pfu/ 幼虫剂量。感染的幼虫被保持在 28 摄氏度的生长箱中， 并在 72 小时时收集。 图 4 的下图显示 pB1( 低 )、 pB2 和 pL 和 pB2 启动子的组合呈现出在昆虫幼虫中的活性， 通 过在幼虫组织中表达 GFP 蛋白质。蛋白质提取物的制备 0060 将来自 P6 孔板的沉淀细胞 (2x106细胞 / 孔以 0.1pfu/ 孔感染 ) 重悬浮在 30l 150mM NaCl， 1NP-40， 0， 1。

38、SDS， 50rnM Tris pH 8， 蛋白酶抑制剂(Roche)， 2- 巯基乙醇 (RIPA 缓冲液 ) 中， 在冰上保持 30 分钟， 并且通过在 4 摄氏度， 2000g 下离心 5 分钟以除去细胞碎片。 0061 蛋白质提取物的分析 0062 在12SDS(w/v)聚丙烯酰胺凝胶上分离40g全部可溶性蛋白(TSP)。 将蛋白质 用考马斯亮蓝G-250(BioRad)染色， 或者转移至硝化纤维膜上(Hybond C， GE Healthcare)， 在 PBS 中用 0.1 (v/v) 吐温 20(PBS-T) 和 4脱脂乳 (PBS-TM) 封闭过夜， 且与稀释 1 1000 的。

39、 GFP 一抗 (Chemicon) 和在 PBS-TM 中稀释 1 500 的肌动蛋白一抗 (Sigma) 孵 育 1 小时。在 PBS-T 中清洗 10 分钟两次后， 将膜与在 PBS-TM 中 1 2000 稀释的过氧化物 酶 - 偶联抗小鼠 IgG 或抗兔 IgG(GE Healthcare) 孵育 1 小时。在洗涤之后， 使用 Advanced ECL 系统 (GE Healthcare) 根据制造商的知道检测特定的信号。 0063 通过蛋白质印迹进行分析， 得到图 5 的结果。再次证实 pB2 和 pLpB2 启动子显示 了比 pL 启动子更早和更强的活性 ( 图 5)。通过使用 。

40、TINA 2.0 程序和使用肌动蛋白带归一 化结果， 测量 GFP 的特定带的密度。 0064 荧光测定法检验 0065 在 485nm 激发后使用 GENIOS 荧光计测量在 535nm 的 40gTSP 的发射光。每个提 取物通过测量 3 次， 获得每个数值。结果显示在图 5C 中。再次明确观察到了 pL 序列置于 pB2 启动子 5上游的协同效应， 与仅 pL 启动子相比， 蛋白质产量提高 61至 375， 依赖 于感染后时间 ( 图 5)。 0066 说 明 书 CN 102203264 A CN 102203270 A7/7 页 10 说 明 书 CN 102203264 A CN 。

41、102203270 A1/3 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 102203264 A CN 102203270 A2/3 页 12 0003 序 列 表 CN 102203264 A CN 102203270 A3/3 页 13 序 列 表 CN 102203264 A CN 102203270 A1/4 页 14 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102203264 A CN 102203270 A2/4 页 15 图 3 说 明 书 附 图 CN 102203264 A CN 102203270 A3/4 页 16 图 4 说 明 书 附 图 CN 102203264 A CN 102203270 A4/4 页 17 图 5 说 明 书 附 图 CN 102203264 A 。