技术领域
本发明涉及一种用于检测待测猪对猪蓝耳病病毒抗性的试剂盒。
背景技术
猪蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征，是猪的重要传染病，以妊娠母猪繁殖障碍和各年龄段猪呼吸道症状为主要特征。猪蓝耳病是由猪繁殖呼吸与综合征病毒引起的。患病猪和带毒猪是本病的重要传染源，主要传播途径是接触感染、空气传播和精液传播，也可通过胎盘垂直传播。易感猪可经口、鼻腔、肌肉、腹腔、静脉及子宫内接种等多种途径而感染病毒，猪感染病毒后2～14周均可通过接触将病毒传播给其他易感猪。从病猪的鼻腔、粪便及尿中均可检测到病毒。
猪蓝耳病1987年首次在美国报道，此后在加拿大、德国、西班牙、英国也相继报道了该病的发生。1995年，我国大陆发现了此病，且在多个省份开始流行。猪蓝耳病现已成为我国危害养猪生产的重要原因之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测待测猪对猪蓝耳病病毒抗性的试剂盒。
本发明提供了一种用于检测待测猪对猪蓝耳病病毒抗性的试剂盒，包括用于检测特定SNP的物质；所述特定SNP为猪基因组DNA中特异引物对的靶序列的第125位核苷酸；所述特异引物对由引物F和引物R组成；
所述引物F为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物R为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子。
所述特定SNP为G/A多态。
所述试剂盒中，所述用于检测特定SNP的物质为所述特异引物对。
所述试剂盒还包括记载有如下判断标准的载体：基于所述特定SNP，AA基因型的待测猪对猪蓝耳病病毒的抗性高于GG基因型的待测猪。
所述试剂盒还包括记载有如下所述“检测待测猪对猪蓝耳病病毒抗性的方法”的载体。
所述待测猪为大白猪。
本发明还保护所述试剂盒的应用，为如下(c1)或(c2)：
(c1)检测待测猪对猪蓝耳病病毒抗性中的应用；
(c2)猪的育种。
所述待测猪为大白猪。所述猪为大白猪。
本发明还保护用于检测特定SNP的物质在制备试剂盒中的应用；所述特定SNP为猪基因组DNA中特异引物对的靶序列的第125位核苷酸；所述特异引物对由引物F和引物R组成；
所述引物F为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物R为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述试剂盒的功能为检测待测猪对猪蓝耳病病毒的抗性。
所述应用中，所述用于检测特定SNP的物质为所述特异引物对。
所述待测猪为大白猪。
本发明还保护一种特异引物对，由引物F和引物R组成；
所述引物F为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物R为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子。
本发明还保护所述特异引物对在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为检测待测猪对猪蓝耳病病毒的抗性。所述待测猪为大白猪。
本发明还保护所述特异引物对的应用，为如下(c1)或(c2)：
(c1)检测待测猪对猪蓝耳病病毒抗性中的应用；
(c2)猪的育种。
所述待测猪为大白猪。所述猪为大白猪。
本发明还保护一种检测待测猪对猪蓝耳病病毒抗性的方法，包括如下步骤：
以待测猪的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行测序；
如果PCR扩增产物只有一种且第125位核苷酸为G，该待测猪的基因型为GG；如果PCR扩增产物只有一种且第125位核苷酸为A，该待测猪的基因型为AA；如果PCR扩增产物有两种，其中一种第125位核苷酸为G，另一种第125位核苷酸为A，该待测猪的基因型为GA；
AA基因型的待测猪对猪蓝耳病病毒的抗性高于GG基因型的待测猪。
所述待测猪为大白猪。
以上任一所述猪蓝耳病病毒具体可为ATCC VR-2385毒株。
应用本发明提供的方法对猪进行育种，可对待选猪进行早期筛选，有效地缓解实际生产中的猪蓝耳病问题，提高经济效益。本发明的检测方法操作简单、费用低廉、准确度高，并可实现自动化的直接检测。本发明将在猪的育种工作中发挥巨大作用。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例中，用于检测猪蓝耳病抗体的试剂盒为购自将来商城的货号为JL21926-48T的猪蓝耳病抗体(PRRS-Ab)ELISA试剂盒(江莱生物)。
实施例中，用于攻毒的猪蓝耳病病毒(猪繁殖呼吸与综合征病毒)为ATCC VR-2385。
猪蓝耳病的发病表征为：采食量下降、喜卧懒动、体温40.5℃左右、有眼屎泪斑、耳朵发绀、眼睑水肿、眼结膜炎、咳嗽、喘气。
实施例、
一、试验群体的获得
40天的大白猪仔猪(体重为11±2kg)，取血检测猪蓝耳病抗体(抗体检测)，采集鼻拭子检测猪蓝耳病病毒(病毒检测)，筛除抗体检测为阳性和/或病毒检测为阳性的仔猪，抗体检测为阴性且病毒检测为阴性的仔猪组成试验群体。
二、基因型检测
试验群体的各个仔猪，分别进行如下操作：
1、取血，提取基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用F和R组成的引物对进行PCR扩增。
F(序列表的序列1)：5’-TGAGAGGGGCCCTCCAGGTGA-3’；
R(序列表的序列2)：5’-TGTGATGTGTGGAGCACTTCC-3’。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行测序，根据测序结果获得各个仔猪的基因型。
各个仔猪的PCR扩增产物均为240bp。根据PCR扩增产物的测序结果，试验群体的所有待测猪分别属于3种基因型。
如果PCR扩增产物只有一种且第125位核苷酸为G，该仔猪的基因型为GG。如果PCR扩增产物只有一种且第125位核苷酸为A，该仔猪的基因型为AA。如果PCR扩增产物有两种，其中一种第125位核苷酸为G，另一种第125位核苷酸为A，该仔猪的基因型为GA。
从试验群体中，随机取21头GG基因型的个体组成GG组(均对个体进行标记，标记为GG)，随机取21头AA基因型的个体组成AA组(均对个体进行标记，标记为AA)。
三、饲养
在与外界隔离的环境中，将GG组和AA组混合饲养。混合饲养即GG组个体和AA组个体均可以自由接触。与外界隔离的环境即与外界不发生猪蓝耳病病毒传播的环境。
四、发病猪的获得
步骤三中的仔猪饲养至9月龄时,从GG组和AA组中各随机抽取1头取出，用猪蓝耳病病毒进行攻毒，持续观察，两头猪均出现猪蓝耳病的发病表征且鼻拭子均可检测到猪蓝耳病病毒。
将从GG组抽取并进行上述步骤得到的发病猪命名为发病猪-GG。将从AA组抽取并进行上述步骤得到的发病猪命名为发病猪-AA。
五、模拟感染
步骤三中的仔猪饲养至10月龄时，以步骤四获得的发病猪为传染源，模拟感染：即同一天，将发病猪-GG和发病猪-AA放回原群体。
六、统计发病率
从步骤五中放入发病猪开始计天数，40天后统计各组的发病情况，即各组中具有猪蓝耳病的发病表征的猪的个数(统计不含发病猪-GG和发病猪-AA)。
以上步骤进行三次重复试验。
GG组的三次重复试验中发病猪的头数分别为：10只、10只、12只。
AA组的三次重复试验中发病猪的头数分别为：4只、5只、6只。
结果表明，AA基因型的猪对猪蓝耳病病毒的抗性显著高于GG基因型的猪。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京农业职业学院
<120> 用于检测待测猪对猪蓝耳病病毒抗性的试剂盒
<130> GNCYX171349
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgagaggggc cctccaggtg a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgtgatgtgt ggagcacttc c 21