银杏抗氧化活性肽及其制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102337318 A (43)申请公布日 2012.02.01 CN 102337318 A *CN102337318A* (21)申请号 201110210119.8 (22)申请日 2011.07.26 C12P 21/06(2006.01) C07K 1/14(2006.01) C07K 1/16(2006.01) C07K 5/107(2006.01) C07K 7/06(2006.01) (71)申请人 南京林业大学 地址 210037 江苏省南京市龙蟠路 159 号 (72)发明人 吴彩娥 曹福亮 李婷婷 范龚健 贾韶千 (74)专利代理机构 南京天翼专。

2、利代理有限责任 公司 32112 代理人 周静 (54) 发明名称 银杏抗氧化活性肽及其制备方法 (57) 摘要 本发明涉及银杏抗氧化活性肽及其制备方 法。 所述银杏抗氧化活性肽的制备方法， 以油脂含 量不大于 0.95的银杏种仁粉末为原料， 碱法提 取银杏种仁蛋白质， 然后采用碱性蛋白酶和胃蛋 白酶对所述银杏种仁蛋白质进行分步水解， 提纯 得到银杏抗氧化活性肽。 银杏抗氧化活性肽， 其序 列为 Tyr-Val-Gly-Asp， 或者 Leu-Gly-Asn-Thr-A sp-Tyr-Ala-Val-His。本发明以银杏种仁为原料 制备银杏抗氧化活性肽， 所得产品具有较高的抗 氧化活性， 能够。

3、清除自由基， 抑制亚油酸过氧化活 性， 具有较好的还原能力。 本发明技术设计科学合 理， 可以实现银杏种仁的综合利用和提高其附加 值， 对银杏产业的发展具有重要的意义。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 2 页 CN 102337330 A1/2 页 2 1. 一种银杏抗氧化活性肽的制备方法， 其特征在于， 以油脂含量不大于 0.95的银杏 种仁粉末为原料， 碱法提取银杏种仁蛋白质， 然后采用碱性蛋白酶和胃蛋白酶对所述银杏 种仁蛋白质进行分步水解， 提纯得到银杏抗氧化活性肽。 2. 如权。

4、利要求 1 所述的银杏抗氧化活性肽的制备方法， 其特征在于， 油脂含量不大于 0.95的银杏种仁粉末是将冷冻干燥、 粉碎得到的银杏种仁粉末超临界流体萃取法脱脂得 到。 3. 如权利要求 2 所述的银杏抗氧化活性肽的制备方法， 其特征在于， 冷冻干燥银杏种 仁粉末的条件为 ： 在真空度1020Pa， 不高于-35条件下冷冻干燥3648h， 超临界流体 萃取法脱脂的参数为 ： 萃取压力 30 35MPa， 萃取温度 50， CO2流量 20L/h， 萃取时间 3 4h。 4. 如权利要求 1 所述的银杏抗氧化活性肽的制备方法， 其特征在于， 所述碱法提取蛋 白质的方法为 ： 在油脂含量不大于 0.。

5、95的银杏种仁粉末中加入质量浓度为 1.5 2.5g/ L 的 NaOH 溶液， 银杏种仁粉末与 NaOH 溶液的质量体积比 1 25 1 30g/ml， 提取温度 3 5， 提取时间为 11 13h， 然后离心， 取上清液， 调整 pH 值到等电点， 分离得到沉淀即 为银杏种仁蛋白质。 5. 如权利要求 1 所述的银杏抗氧化活性肽的制备方法， 其特征在于， 所述碱性蛋白酶 为 2709 碱性蛋白酶， 对所述银杏种仁蛋白质进行分步水解的方法为 ： a.2709 碱性蛋白酶酶解 将银杏种仁蛋白配制成浓度为 18 22g/L 的蛋白水溶液， 调节 pH 值为 8.5 9.5， 以 银杏种仁蛋白的质。

6、量为基准， 2709 碱性蛋白酶添加量为 6500 7500U g-1， 54 56酶解 4 5h， 灭酶， 得到一次酶解液 ； b. 胃蛋白酶酶解 将一次酶解液的pH值调整为2.53.5， 以银杏种仁蛋白的质量为基准， 添加胃蛋白酶 的量为 8500 9500Ug-1， 49 51酶解 1.5 2.5h， 灭酶， 得到二次酶解液。 6. 如权利要求 1 所述的银杏抗氧化活性肽的制备方法， 其特征在于， 分步水解后提纯 的方法为 ： 离心二次酶解液得到上清液， 经过冷冻干燥， 得到具有抗氧化活性的银杏抗氧化 肽。 7. 如权利要求 6 所述的银杏抗氧化活性肽的制备方法， 其特征在于， 所述分步。

7、水解 后提纯过程中的冷冻干燥的方法为 ： 预冻温度为 -50， 真空度为 10 20Pa， 冻干温度低 于 -35， 冻干时间 36 48h。 8. 如权利要求 6 或 7 所述的银杏抗氧化活性肽的制备方法， 其特征在于， 分步水解后 提纯的方法为 ： 离心二次酶解液得到上清液， 经过冷冻干燥， 得到具有抗氧化活性的银杏抗 氧化肽， 将银杏抗氧化活性肽配制成 45 55mg/mL 的溶液， 上 Sephadex G-25 凝胶柱进行 分离纯化， 去离子水洗脱， 收集以 DPPH 自由基清除率为检测指标筛选的抗氧化活性最高的 多肽组分， 冷冻干燥， 然后配制成 45 55mg/mL 的溶液， 上。

8、 Sephadex G-10 凝胶柱进行分离 纯化， 去离子水洗脱， 收集以 DPPH 自由基清除率为检测指标筛选的抗氧化活性最高的多肽 组分， 冷冻干燥， 然后配制成 18 22mg/mL 的溶液， 采用半制备型液相色谱进行分离纯化， 以 10乙腈 +0.1 TFA 为洗脱液， 收集以 DPPH 自由基清除率为检测指标筛选抗氧化活性 最高的两种组分， 经冷冻干燥得到具有抗氧化活性的第一多肽组分和第二多肽组分。 权 利 要 求 书 CN 102337318 A CN 102337330 A2/2 页 3 9. 一种银杏抗氧化活性肽， 其序列为 Tyr-Val-Gly-Asp。 10. 一种银杏。

9、抗氧化活性肽， 其序列为 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His。 权 利 要 求 书 CN 102337318 A CN 102337330 A1/5 页 4 银杏抗氧化活性肽及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种银杏抗氧化活性肽及其制备方法。 背景技术 0002 我国具有丰富的银杏资源， 其资源量占世界银杏资源总量的 90。随着近年来国 内银杏产业的发展， 银杏种仁的产量也迅速增加， 导致银杏种仁的价格降低。 这一方面是由 于银杏种仁中还含有一些致敏性成分， 不能直接大量食用 ； 另一方面， 银杏种仁的精深加工 产品较少， 导致市场上供大于求， 价。

10、格随之下降。 如何解决银杏种仁的深加工问题成为银杏 产业发展的关键所在。 0003 银杏种仁营养丰富， 具有很高的食用和药用价值， 含有蛋白质、 淀粉、 黄酮类、 萜 类、 生物碱、 多糖类、 酚类、 氨基酸、 微量元素等， 此外还含有白果酸、 氢化白果酸、 银杏内酯 等成分。银杏种仁中蛋白质含量在 10以上， 氨基酸组成合理， 而且具有许多功能作用， 如 抗氧化、 抑菌、 抗肿瘤、 抗衰老和免疫调节等。因此， 以银杏蛋白为原料， 推动银杏的深加工 产业， 可以带来更高的产品附加值。 发明内容 0004 本发明提供一种银杏抗氧化活性肽的制备方法。 0005 本发明还提供银杏抗氧化活性肽。 00。

11、06 所述银杏抗氧化活性肽的制备方法， 以油脂含量不大于 0.95的银杏种仁粉末为 原料， 碱法提取银杏种仁蛋白质， 然后采用碱性蛋白酶和胃蛋白酶对所述银杏种仁蛋白质 进行分步水解， 提纯得到银杏抗氧化活性肽。 0007 优选， 油脂含量不大于 0.95的银杏种仁粉末是将冷冻干燥、 粉碎得到的银杏种 仁粉末超临界流体萃取法脱脂得到。 进一步优选， 冷冻干燥银杏种仁粉末的条件为 ： 在真空 度 10 20Pa， 不高于 -35条件下冷冻干燥 36 48h， 超临界流体萃取法脱脂的参数为 ： 萃取压力 30 35MPa， 萃取温度 50， CO2流量 20L/h， 萃取时间 3 4h。银杏种仁粉末。

12、由 银杏种仁粉碎、 过 60 目筛得到。 0008 优选， 所述碱法提取蛋白质的方法为 ： 在油脂含量不大于 0.95的银杏种仁粉末 中加入质量浓度为 1.5 2.5g/L 的 NaOH 溶液， 银杏种仁粉末与 NaOH 溶液的质量体积比 1 25 1 30g/ml， 提取温度 3 5， 提取时间为 11 13h， 然后离心， 取上清液， 调整 pH 值到等电点， 分离得到沉淀即为银杏种仁蛋白质。 0009 a.2709 碱性蛋白酶酶解 0010 将银杏种仁蛋白配制成浓度为1822g/L的蛋白水溶液， 调节pH值为8.59.5， 以银杏种仁蛋白的质量为基准， 2709 碱性蛋白酶添加量为 65。

13、00 7500U g-1， 54 56酶 解 4 5h， 灭酶， 得到一次酶解液 ； 0011 b. 胃蛋白酶酶解 0012 将一次酶解液的pH值调整为2.53.5， 以银杏种仁蛋白的质量为基准， 添加胃蛋 说 明 书 CN 102337318 A CN 102337330 A2/5 页 5 白酶的量为 8500 9500Ug-1， 49 51酶解 1.5 2.5h， 灭酶， 得到二次酶解液。 0013 优选， 分步水解后提纯的方法为 ： 离心二次酶解液得到上清液， 经过冷冻干燥， 得 到具有抗氧化活性的银杏抗氧化肽。所述分步水解后提纯过程中的冷冻干燥的方法为 ： 预 冻温度为 -50， 真空。

14、度为 10 20Pa， 冻干温度低于 -35， 冻干时间 36 48h。 0014 进一步优选， 分步水解后提纯的方法为 ： 离心二次酶解液得到上清液， 经过冷冻 干燥， 得到具有抗氧化活性的银杏抗氧化肽， 将银杏抗氧化活性肽配制成 45 55mg/mL 的 溶液， 上 Sephadex G-25 凝胶柱进行分离纯化， 去离子水洗脱， 收集以 DPPH 自由基清除率 为检测指标筛选的抗氧化活性最高的多肽组分， 冷冻干燥， 然后配制成 45 55mg/mL 的溶 液， 上 SephadexG-10 凝胶柱进行分离纯化， 去离子水洗脱， 收集以 DPPH 自由基清除率为检 测指标筛选的抗氧化活性最。

15、高的多肽组分， 冷冻干燥， 然后配制成 18 22mg/mL 的溶液， 采用半制备型液相色谱进行分离纯化， 以 10乙腈 +0.1 TFA 为洗脱液， 收集以 DPPH 自 由基清除率为检测指标筛选抗氧化活性最高的两种组分， 经冷冻干燥得到具有抗氧化活 性的第一多肽组分和第二多肽组分。采用液相色谱 - 四级杆飞行时间质谱对纯化后得到 的第一多肽组分和第二多肽组分两个肽段进行结构鉴定， 两个肽段的氨基酸序列分别为 ： Tyr-Val-Gly-Asp( 分子量为 452.21) 和 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His( 分子量 为 988.49)。 0015 本。

16、发明中所述百分比均为质量百分比。 0016 本发明以银杏种仁为原料制备银杏抗氧化活性肽， 所得产品具有较高的抗氧化活 性， 能够清除自由基， 抑制亚油酸过氧化活性， 具有较好的还原能力。本发明技术设计科学 合理， 可以实现银杏种仁的综合利用和提高其附加值， 对银杏产业的发展具有重要的意义。 附图说明 0017 图 1 为第一多肽组分的液相色谱 - 四极杆飞行时间质谱图。 0018 图 2 为第二多肽组分的液相色谱 - 四极杆飞行时间质谱图。 具体实施方式 0019 实施例 1 0020 在萃取压力 35MPa， 萃取温度 50， CO2流量 20L/h， 萃取时间 4h 的条件下对银杏 种仁粉。

17、末 ( 过 60 目筛 ) 进行脱脂， 脱脂后油脂含量为 0.95。称取脱脂后的银杏种仁粉 末 100g， 加入质量浓度为 2g/L 的 NaOH 溶液 2.6L， 置于 4冰箱中提取 12h， 每隔 30min 搅 拌一次。提取液经过 3000r/min 离心 15min， 调整上清液 pH 值到 4.62， 然后 5000r/min 离 心 20min， 得沉淀。将沉淀配制成 20g/L 的银杏种仁蛋白溶液， 调节 pH 值为 8.5， 首先添加 2709 碱性蛋白酶， 添加量为 6500U/g， 置于 55恒温振荡水浴槽中酶解 4h ； 将酶解液置于 90水浴中灭酶 10min， 调节 。

18、pH 值为 2.5， 添加胃蛋白酶的量为 8500U/g， 置于 50恒温振 荡水浴槽中 2h， 将酶解液置于 90水浴中灭酶 10min。灭酶后的酶解液于 3000r/min 离心 10min， 收集上清液， 在 -50下预冻 5h， 在真空度 10Pa， -35条件下冷冻干燥 36h， 得到银 杏抗氧化活性肽， 得率为 51.39。当银杏抗氧化活性肽的浓度为 1.0mg/mL 时， DPPH 自由 基清除率为 46.56， Fe2+螯合率为 76.38， 还原能力为 0.509。将银杏抗氧化活性肽冻 干粉配制成 45mg/mL 的溶液， 上 Sephadex G-25 凝胶柱进行分离纯化，。

19、 上样量为 4mL。以去 说 明 书 CN 102337318 A CN 102337330 A3/5 页 6 离子水为洗脱液， 洗脱流速为 0.4mL/min， 收集抗氧化活性最高的多肽组分。将 Sephadex G-25 分离得到的活性最高的组分进行多次收集， 冷冻干燥， 然后配制成 45mg/mL 的溶液， 上 SephadexG-10 凝胶柱进行分离纯化， 上样量为 4mL。以去离子水为洗脱液， 洗脱流速为 0.4mL/min， 收集抗氧化活性最高的多肽组分。将 Sephadex G-10 分离得到的活性最高的组 分进行多次收集， 冷冻干燥， 然后配制成 18mg/mL 的溶液， 采用。

20、半制备型液相色谱进行分离 纯化， 上样量为 1.8mL。以 10乙腈 +0.1 TFA 为洗脱液， 洗脱流速为 10mL/min， 收集抗氧 化活性最高的多肽组分。采用液相色谱 - 四级杆飞行时间质谱对纯化后得到的组分 1 和组 分 2 两个肽段进行结构鉴定， 两个肽段的氨基酸序列分别为 ： Tyr-Val-Gly-Asp( 分子量为 452.21)和Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His(分子量为988.49)。 当浓度为1.0mg/ mL 时， 肽段 Tyr-Val-Gly-Asp 的 DPPH 自由基清除率为 79.29， Fe2+螯合率为 87.38， 。

21、还 原能力为 1.026 ； 肽段 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His 的 DPPH 自由基清除率为 74.85， Fe2+螯合率为 91.73， 还原能力为 0.837。 0021 实施例 2 0022 在萃取压力 30MPa， 萃取温度 50， CO2流量 20L/h， 萃取时间 3h 的条件下对银杏 种仁粉末 ( 过 60 目筛 ) 进行脱脂， 脱脂后油脂含量为 0.95。称取脱脂后的银杏种仁粉末 100g， 加入质量浓度为 2g/L 的 NaOH 溶液 2.6L， 置于 4冰箱中提取 12h， 每隔 30min 搅拌 一次。提取液经过 3000r/m。

22、in 离心 15min， 调整上清液 pH 值到 4.62， 然后 5000r/min 离心 20min， 得沉淀。将沉淀配制成 2的银杏种仁蛋白溶液， 调节 pH 值为 9.0， 首先添加 2709 碱性蛋白酶， 添加量为7000U/g， 置于55恒温振荡水浴槽中酶解5h ； 将酶解液置于90水 浴中灭酶 10min， 调节 pH 值为 3.0， 添加胃蛋白酶的量为 9000U/g， 置于 50恒温振荡水浴 槽中 2h， 将酶解液置于 90水浴中灭酶 15min。灭酶后的酶解液于 3000r/min 离心 10min， 收集上清液， 在 -50下预冻 5h， 在真空度 15Pa， -35条件。

23、下冷冻干燥 48h， 得到银杏抗氧 化活性肽， 得率为 53.51。当银杏抗氧化活性肽的浓度为 1.0mg/mL 时， DPPH 自由基清除 率为 48.56， Fe2+螯合率为 79.26， 还原能力为 0.537。将银杏抗氧化活性肽冻干粉配制 成 50mg/mL 的溶液， 上 Sephadex G-25 凝胶柱进行分离纯化， 上样量为 5mL。以去离子水为 洗脱液， 洗脱流速为 0.5mL/min， 收集抗氧化活性最高的多肽组分。将 Sephadex G-25 分离 得到的活性最高的组分进行多次收集， 冷冻干燥， 然后配制成 50mg/mL 的溶液， 上 Sephadex G-10 凝胶柱。

24、进行分离纯化， 上样量为 5mL。以去离子水为洗脱液， 洗脱流速为 0.5mL/min， 收集抗氧化活性最高的多肽组分。将 Sephadex G-10 分离得到的活性最高的组分进行多次 收集， 冷冻干燥， 然后配制成 20mg/mL 的溶液， 采用半制备型液相色谱进行分离纯化， 上样 量为 2mL。以 10乙腈 +0.1 TFA 为洗脱液， 洗脱流速为 10mL/min， 收集抗氧化活性最高 的多肽组分。采用液相色谱 - 四级杆飞行时间质谱对纯化后得到的组分 1 和组分 2 两个 肽段进行结构鉴定， 两个肽段的氨基酸序列分别为 ： Tyr-Val-Gly-Asp( 分子量为 452.21) 和。

25、 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His( 分子量为 988.49)。当浓度为 1.0mg/mL 时， 肽段 Tyr-Val-Gly-Asp 的 DPPH 自由基清除率为 79.05， Fe2+螯合率为 87.31， 还原能力 为1.018 ； 肽段Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His的DPPH自由基清除率为74.85， Fe2+螯合率为 92.14， 还原能力为 0.826。 0023 实施例 3 0024 在萃取压力 35MPa， 萃取温度 50， CO2流量 20L/h， 萃取时间 3h 的条件下对银杏 说 明 书 CN 。

26、102337318 A CN 102337330 A4/5 页 7 种仁粉末 ( 过 60 目筛 ) 进行脱脂， 脱脂后油脂含量为 0.95。称取脱脂后的银杏种仁粉末 100g， 加入质量浓度为 2g/L 的 NaOH 溶液 2.6L， 置于 4冰箱中提取 12h， 每隔 30min 搅拌 一次。提取液经过 3000r/min 离心 15min， 调整上清液 pH 值到 4.62， 然后 5000r/min 离心 20min， 得沉淀。将沉淀配制成 2g/L 的银杏种仁蛋白溶液， 调节 pH 值为 9.5， 首先添加 2709 碱性蛋白酶， 添加量为7500U/g， 置于55恒温振荡水浴槽中酶。

27、解4h ； 将酶解液置于90水 浴中灭酶 10min， 调节 pH 值为 3.0， 添加胃蛋白酶的量为 9500U/g， 置于 50恒温振荡水浴 槽中 2h， 将酶解液置于 90水浴中灭酶 15min。灭酶后的酶解液于 3000r/min 离心 15min， 收集上清液， 在 -50下预冻 5h， 在真空度 20Pa， -40条件下冷冻干燥 48h， 得到银杏抗氧 化活性肽， 得率为 50.79。当银杏抗氧化活性肽的浓度为 1.0mg/mL 时， DPPH 自由基清除 率为 47.34， Fe2+螯合率为 76.98， 还原能力为 0.526。将银杏抗氧化活性肽冻干粉配制 成 45mg/mL 。

28、的溶液， 上 Sephadex G-25 凝胶柱进行分离纯化， 上样量为 6mL。以去离子水为 洗脱液， 洗脱流速为 0.4mL/min， 收集抗氧化活性最高的多肽组分。将 Sephadex G-25 分离 得到的活性最高的组分进行多次收集， 冷冻干燥， 然后配制成 45mg/mL 的溶液， 上 Sephadex G-10 凝胶柱进行分离纯化， 上样量为 6mL。以去离子水为洗脱液， 洗脱流速为 0.6mL/min， 收集抗氧化活性最高的多肽组分。将 Sephadex G-10 分离得到的活性最高的组分进行多次 收集， 冷冻干燥， 然后配制成 22mg/mL 的溶液， 采用半制备型液相色谱进行。

29、分离纯化， 上样 量为 1.8mL。以 10乙腈 +0.1 TFA 为洗脱液， 洗脱流速为 10mL/min， 收集抗氧化活性最 高的多肽组分。采用液相色谱 - 四级杆飞行时间质谱对纯化后得到的组分 1 和组分 2 两个 肽段进行结构鉴定， 两个肽段的氨基酸序列分别为 ： Tyr-Val-Gly-Asp( 分子量为 452.21) 和 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His( 分子量为 988.49)。当浓度为 1.0mg/mL 时， 肽段 Tyr-Val-Gly-Asp 的 DPPH 自由基清除率为 80.04， Fe2+螯合率为 87.15， 还原能力 为1。

30、.033 ； 肽段Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His的DPPH自由基清除率为74.36， Fe2+螯合率为 91.57， 还原能力为 0.828。 0025 实施例 4 0026 在萃取压力 35MPa， 萃取温度 50， CO2流量 20L/h， 萃取时间 4h 的条件下对银杏 种仁粉末 ( 过 60 目筛 ) 进行脱脂， 脱脂后油脂含量为 0.95。称取脱脂后的银杏种仁粉末 100g， 加入质量浓度为 0.2的 NaOH 溶液 2.6L， 置于 4冰箱中提取 12h， 每隔 30min 搅拌 一次。提取液经过 3000r/min 离心 15min， 调整。

31、上清液 pH 值到 4.62， 然后 5000r/min 离心 20min， 得沉淀。将沉淀配制成 2g/L 的银杏种仁蛋白溶液， 调节 pH 值为 9.5， 首先添加 2709 碱性蛋白酶， 添加量为6500U/g， 置于55恒温振荡水浴槽中酶解5h ； 将酶解液置于90水 浴中灭酶 10min， 调节 pH 值为 3.5， 添加胃蛋白酶的量为 9000U/g， 置于 50恒温振荡水浴 槽中 2h， 将酶解液置于 90水浴中灭酶 10min。灭酶后的酶解液于 3000r/min 离心 15min， 收集上清液， 在 -50下预冻 5h， 在真空度 15Pa， -40条件下冷冻干燥 36h， 。

32、得到银杏抗氧 化活性肽， 得率为 50.24。当银杏抗氧化活性肽的浓度为 1.0mg/mL 时， DPPH 自由基清除 率为 46.88， Fe2+螯合率为 77.06， 还原能力为 0.519。将银杏抗氧化活性肽冻干粉配制 成 55mg/mL 的溶液， 上 Sephadex G-25 凝胶柱进行分离纯化， 上样量为 4mL。以去离子水为 洗脱液， 洗脱流速为 0.4mL/min， 收集抗氧化活性最高的多肽组分。将 Sephadex G-25 分离 得到的活性最高的组分进行多次收集， 冷冻干燥， 然后配制成 55mg/mL 的溶液， 上 Sephadex G-10 凝胶柱进行分离纯化， 上样量。

33、为 4mL。以去离子水为洗脱液， 洗脱流速为 0.4mL/min， 说 明 书 CN 102337318 A CN 102337330 A5/5 页 8 收集抗氧化活性最高的多肽组分。将 Sephadex G-10 分离得到的活性最高的组分进行多次 收集， 冷冻干燥， 然后配制成 22mg/mL 的溶液， 采用半制备型液相色谱进行分离纯化， 上样 量为 2mL。以 10乙腈 +0.1 TFA 为洗脱液， 洗脱流速为 11mL/min， 收集抗氧化活性最高 的多肽组分。采用液相色谱 - 四级杆飞行时间质谱对纯化后得到的组分 1 和组分 2 两个 肽段进行结构鉴定， 两个肽段的氨基酸序列分别为 ：。

34、 Tyr-Val-Gly-Asp( 分子量为 452.21) 和 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His( 分子量为 988.49)。当浓度为 1.0mg/mL 时， 肽段 Tyr-Val-Gly-Asp 的 DPPH 自由基清除率为 79.17， Fe2+螯合率为 87.31， 还原能力 为1.022 ； 肽段Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His的DPPH自由基清除率为74.97， Fe2+螯合率为 92.12， 还原能力为 0.841。 0027 实施例 5 0028 在萃取压力 30MPa， 萃取温度 50， CO2流量 。

35、20L/h， 萃取时间 4h 的条件下对银杏 种仁粉末 ( 过 60 目筛 ) 进行脱脂， 脱脂后油脂含量为 0.95。称取脱脂后的银杏种仁粉 末 100g， 加入质量浓度为 2g/L 的 NaOH 溶液 2.6L， 置于 4冰箱中提取 12h， 每隔 30min 搅 拌一次。提取液经过 3000r/min 离心 15min， 调整上清液 pH 值到 4.62， 然后 5000r/min 离 心 20min， 得沉淀。将沉淀配制成 20g/L 的银杏种仁蛋白溶液， 调节 pH 值为 9.0， 首先添加 2709 碱性蛋白酶， 添加量为 7000U/g， 置于 55恒温振荡水浴槽中酶解 4h ；。

36、 将酶解液置于 90水浴中灭酶 15min， 调节 pH 值为 3.0， 添加胃蛋白酶的量为 9500U/g， 置于 50恒温振 荡水浴槽中 2h， 将酶解液置于 90水浴中灭酶 15min。灭酶后的酶解液于 3000r/min 离心 10min， 收集上清液， 在 -50下预冻 5h， 在真空度 15Pa， -45条件下冷冻干燥 36h， 得到银 杏抗氧化活性肽， 得率为 51.93。当银杏抗氧化活性肽的浓度为 1.0mg/mL 时， DPPH 自由 基清除率为 47.13， Fe2+螯合率为 77.57， 还原能力为 0.528。将银杏抗氧化活性肽冻 干粉配制成 50mg/mL 的溶液， 。

37、上 Sephadex G-25 凝胶柱进行分离纯化， 上样量为 6mL。以去 离子水为洗脱液， 洗脱流速为 0.4mL/min， 收集抗氧化活性最高的多肽组分。将 Sephadex G-25 分离得到的活性最高的组分进行多次收集， 冷冻干燥， 然后配制成 45mg/mL 的溶液， 上 SephadexG-10 凝胶柱进行分离纯化， 上样量为 6mL。以去离子水为洗脱液， 洗脱流速为 0.4mL/min， 收集抗氧化活性最高的多肽组分。将 Sephadex G-10 分离得到的活性最高的组 分进行多次收集， 冷冻干燥， 然后配制成 20mg/mL 的溶液， 采用半制备型液相色谱进行分离 纯化， 。

38、上样量为 2.2mL。以 10乙腈 +0.1 TFA 为洗脱液， 洗脱流速为 11mL/min， 收集抗氧 化活性最高的多肽组分。采用液相色谱 - 四级杆飞行时间质谱对纯化后得到的组分 1 和组 分 2 两个肽段进行结构鉴定， 两个肽段的氨基酸序列分别为 ： Tyr-Val-Gly-Asp( 分子量为 452.21)和Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His(分子量为988.49)。 当浓度为1.0mg/ mL 时， 肽段 Tyr-Val-Gly-Asp 的 DPPH 自由基清除率为 78.65， Fe2+螯合率为 86.87， 还 原能力为 1.033 ； 肽段。

39、 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His 的 DPPH 自由基清除率为 74.27， Fe2+螯合率为 91.46， 还原能力为 0.829。 说 明 书 CN 102337318 A CN 102337330 A1/1 页 9 多肽 1 ： Tyr-Val-Gly-Asp 多肽 2 ： Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr- Ala-Val-His 序 列 表 CN 102337318 A CN 102337330 A1/2 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102337318 A CN 102337330 A2/2 页 11 图 2 说 明 书 附 图 CN 102337318 A 。