鉴别发虫草的特征性核苷酸序列及其探针和方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102337347 B (45)授权公告日 2013.05.22 CN 102337347 B *CN102337347B* (21)申请号 201110346596.7 (22)申请日 2011.11.04 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 广东省微生物研究所 地址 510070 广东省广州市先烈中路 100 号 (72)发明人 王磊 章卫民 李浩华 潘清灵 陈玉蝉 (74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 代理人 刘明星 莫瑶江 CN 101。

2、255457 A,2008.09.03, Zhang,W.-M.etc. EU149926.1.GenBank .2007, Zhang,W.-M.etc. EU149926.1.GenBank .2007, (54) 发明名称 鉴别发虫草的特征性核苷酸序列及其探针和 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种鉴别发虫草的特征性核苷 酸序列及其探针和方法。所述的用于鉴定发虫草 (Ophiocordyceps crinalis) 的特征性核苷酸序 列来自发虫草核糖体 rRNA 内转录间隔区， 其序列 如 SEQ ID NO.1 所示。以此特征性核苷酸序列为 基础上设计的核酸分子探针 Probe I(。

3、 如 SEQ ID NO.2所示)和 Probe II(如 SEQ ID NO.3所示 )， 以及包含该核酸分子探针的鉴定试剂盒， 以及利 用该探针通过PCR、 核酸杂交或荧光定量PCR鉴别 发虫草的方法。 利用本发明， 可以方便、 快速、 准确 的进行发虫草及相关的制品的快速鉴定， 本发明 使用分子生物学手段排除了鉴定中的人为影响、 鉴定结果客观准确， 鉴定时间短， 半天即可完成。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张芙婧 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列。

4、表3页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102337347 B CN 102337347 B *CN102337347B* 1/1 页 2 1. 一种用于鉴别发虫草的发虫草专一性核苷酸分子探针， 其特征在于， 该发虫 草 专 一 性 核 苷 酸 分 子 探 针 为 Probe I ： 5 -GACCCAGACCCCGCTGTC-3和 Probe II ： 5 -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3 。 2. 一种用于鉴别发虫草的发虫草专一性核苷酸分子探针， 其特征在于， 该发 虫 草 专 一 性 核 苷 酸 分 子 探 针 为 Probe I ： 5 -GACCCAGACCCC。

5、GCTGTC-3 、 Probe II ： 5 -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3 和 Probe III ： 5 -TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3 。 3. 一种用于鉴别发虫草的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求 1 所述的发虫 草 专 一 性 核 苷 酸 分 子 探 针 ： Probe I ： 5 -GACCCAGACCCCGCTGTC-3和 Probe II ： 5 -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3 和 PCR 常规反应试剂。 4. 根据权利要求 3 所述的试剂盒， 其特征在于， 该试剂盒还含有虫草属核糖 体 rRNA 内。

6、 转 录 间 隔 区 通 用 引 物 CorF ： 5 -CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3和 CorR ： 5 -TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3 。 5. 根据权利要求 3 所述的试剂盒， 其特征在于， 该试剂盒还含有 Probe III ： 5 -TCAGC GTCCGCAAGCAGAAATGAATCA-3 。 6. 一 种 用 于 鉴 别 发 虫 草 的 方 法， 其 特 征 在 于， 是 以 权 利 要 求 1 所 述 的 发 虫 草 专 一 性 核 苷 酸 分 子 探 针 ： Probe I ： 5 -GACCCAGACCCCGCTGTC-3和 P。

7、robe II ： 5 -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3 作为引物， 利用 PCR 的方法鉴定发虫草。 7.根据权利要求6所述的用于鉴别发虫草的方法， 其特征在于， 所述的PCR的方法鉴定 发虫草是用荧光定量 PCR 的方法鉴定发虫草， 是以 Probe III ： 5 -TCAGCGTCCGCAAGCAGAAAT GAATCA-3 标记荧光基团后作为 Taqman 探针再进行荧光定量 PCR。 8. 根 据 权 利 要 求 6 所 述 的 用 于 鉴 别 发 虫 草 的 方 法， 其 特 征 在 于， 所 述 的 用 PCR 的 方 法 鉴 定 发 虫 草， 还 以 虫 草。

8、 属 核 糖 体 rRNA 内 转 录 间 隔 区 通 用 引 物 CorF ： 5 -CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3 和 CorR ： 5 -TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3 的扩增产物 作为阳性对照。 权 利 要 求 书 CN 102337347 B 2 1/5 页 3 鉴别发虫草的特征性核苷酸序列及其探针和方法 技术领域 0001 本发明属于利用分子生物学方法检测中药材真伪的技术领域， 具体涉及用于鉴别 发虫草(Ophiocordyceps crinalis)的特征性核苷酸序列以及核酸分子探针和鉴别发虫草 的方法。 背景技术 ： 0002 发虫草 (。

9、Ophiocordyceps crinalis) 是属于广义虫草属 (Cordyceps s.l.) 的一 种虫生真菌， 该属真菌还包括冬虫夏草 (Ophiocordyceps sinensis) 和蛹虫草 (Cordyceps militaris)。 野生冬虫夏草是中国传统中药， 具有保肺肾、 补精髓、 化痰止劳咳的作用， 能够 调节免疫功能， 增强人体抵抗力。 目前由于大量的采挖已经造成野生资源不足， 价格大幅上 张。目前， 仍然无法实现冬虫夏草子实体的人工栽培， 而其菌丝体培养也需要低温长期发 酵， 成本过高。发虫草与冬虫夏草在亲缘关系上极为接近， 与其具有相似的功能， 具有开发 为虫草。

10、新产品的价值。 因此可以快速而准确的鉴别发虫草子实体以及相关制品真伪的方法 和技术对于发虫草生产相关企业以及相关检验机构将具有重要的意义。 0003 DNA 是生物储存遗传信息的物质， 每个生物物种乃至个体均具有独特的特征性核 苷酸序列， 可以作为该生物物种或个体区别于其他物种或个体的标志。 DNA是细胞生物的基 本组成部分， 作为遗传信息的载体， 具有一定的稳定性， 不会受表型的影响而改变， 是用来 鉴别物种、 个体的可靠依据。通过生物信息学的分析可以找到不同物种或个体的特征性核 苷酸序列， 利用分子生物学的手段对该序列进行探测即可快速、 准确的对物种或个体进行 鉴别。发明人已申请并获授权两。

11、项鉴别尖头虫草及蜂头虫草的核苷酸特征性序列的专利， 目前未见与发虫草相关的核苷酸特征性序列的专利。 发明内容 ： 0004 本发明的第一个目的是提供来源于发虫草 (Ophiocordyceps crinalis) 核糖体 rRNA 内转录间隔区以及 5.8S rRNA 基因， 用于鉴别发虫草的特征性核苷酸序列， 其序列如 SEQ ID NO.1 所示。 0005 本发明提供的利用分子生物学手段鉴别发虫草的特征性核苷酸序列来源于发虫 草核糖体 rRNA 内转录间隔区以及 5.8S rRNA 基因 ( 核糖体 rRNA 内转录间隔区以及 5.8S rRNA 基因合并简称 ITS 区 )， 其序列如。

12、 SEQ ID NO.1 所示， 所在位置以及特征见图 1， 该序 列包含发虫草的 ITS1、 5.8S rDNA 以及 ITS2 的序列。该序列可通过实施例 1 所述的方法获 得， 亦可通过人工合成的方法在商业化的 DNA 合成仪器上按照发明人提供的核苷酸序列合 成。 0006 本发明以上述发虫草的特征性核苷酸序列 ( 如 SEQ ID NO.1 所示 ) 为模板而设计 得到全长序列或不少于 16 个核苷酸组成的寡核苷酸序列， 以及在上述全长序列或寡核苷 酸序列的基础上经修饰、 加工、 变化而获得核苷酸序列， 也包括在上述全长序列或寡核苷酸 序列的基础上在5 端添加或改变10个核苷酸以下或改。

13、变原有核苷酸序列数量小于10以 说 明 书 CN 102337347 B 3 2/5 页 4 及 3 端 6 个核苷酸改变不足 1 个核苷酸的核苷酸序列作为发虫草鉴定的专一性核苷酸分 子探针。上述序列可通过 DNA 自动合成仪等 DNA 合成装置按照设计好的顺序合成而获得， 并可以通过酶、 同位素、 生物素、 化学荧光素、 荧光剂等方式进行标记。 0007 因此本发明的第二个目的是提供一种针对上述 ITS 区的如 SEQ ID NO.1 所示 的序列的发虫草专一性核苷酸分子探针， 其特征在于， 该发虫草专一性核苷酸分子探针 包括 Probe I ： 5 -GACCCAGACCCCGCTGTC-。

14、3 ( 序列如 SEQ ID NO.2 所示 ) 和 Probe II ： 5 -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3 ( 序列如 SEQ ID NO.3 所示 )。进一步优选， 所述的发虫草 专一性核苷酸分子探针还包括 Probe III ： 5 -TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3 ( 序列 如 SEQ ID NO.4 所示 )。该序列经荧光标记后可作为 Taqman 探针用以鉴定发虫草。Probe I、 Probe II、 Probe III 的具体位置见图 2， 这些序列样适用于上述修饰、 加工与变化、 添加 酶切位点、 改变部分核苷酸序列以及标记。

15、等操作。 0008 本发明提供的上述发虫草专一性核苷酸分子探针 ： Probe I 和 Probe II 具有极高 的专一性， 可以与发虫草发生专一性的反应而不与其他种类的虫草或其他真菌发生反应。 利用上述探针通过 PCR 的方法或核酸杂交的方法可以快速的对发虫草及相关制品进行检 测。 0009 本发明的第三个目的是提供一种用于鉴别发虫草的试剂盒， 其特征在于， 包括 发虫草专一性核苷酸分子探针 ： Probe I ： 5 -GACCCAGACCCCGCTGTC-3和 Probe II ： 5 -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3 和 PCR 常规反应试剂。 0010 所 述 的。

16、 用 于 鉴 别 发 虫 草 的 试 剂 盒， 优 选 还 含 有 虫 草 属 核 糖 体 rRNA 内 转录间隔区通用引物 CorF ： 5 -CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3 和 CorR ： 5 -TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3 。以此引物对的扩增产物作为阳性对照。 0011 所述的用于鉴别发虫草的试剂盒， 优选还含有 Probe III ： 5 -TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3 。 Probe III经过荧光标记后， 可以作为Taqman探针， 利用荧光定量 PCR 仪可实时的检测样品中是否存在发虫草。 0012 本发。

17、明的第四个目的是提供一种用于鉴别发虫草的方法， 其特征在于， 是以 发虫草专一性核苷酸分子探针 ： Probe I ： 5 -GACCCAGACCCCGCTGTC-3和 Probe II ： 5 -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3 作为引物， 利用 PCR 的方法或者核酸杂交的方法或荧光定 量 PCR 的方法鉴定发虫草。 0013 所述的用荧光定量 PCR 的方法鉴定发虫草， 优选以 Probe III ： 5 -TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3 标记荧光后， 作为 Taqman 探针。 0014 所述的 PCR 的方法鉴定发虫草， 优选以虫草属核糖。

18、体 rRNA 内转录间隔区通 用 引 物 CorF ： 5 -CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3 ( 如 SEQ ID NO.5 所 示 ) 和 CorR ： 5 -TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3 ( 如 SEQ ID NO.6 所示 ) 的扩增产物作为阳性对照。 0015 荧光定量PCR法 ： 采用前面所述的发虫草专一性的核酸分子探针Probe I及Probe II 作为扩增引物， Probe III 标记荧光后作为 Taqman 探针， 利用荧光定量 PCR 仪可实时的 检测样品中是否存在发虫草。具体步骤和过程按照常规分子生物学方法进行。 0016 核酸。

19、分子杂交法 ： 采用前面所述的发虫草专一性的核酸分子探针， 通过核酸分子 杂交的方式 ( 例如 Southern 杂交或点杂交 ) 对发虫草及相关制品进行鉴定。具体步骤和 过程按照常规的分子生物学方法进行。其中， 发虫草及相关制品可以直接进行检测也可以 说 明 书 CN 102337347 B 4 3/5 页 5 先进行 DNA 的提取与扩增后再进行检测。 0017 PCR 方法 ： 采用前面所述的发虫草专一性的核酸分子探针 Probe I 及 Probe II 作 为一组PCR引物， 以如前所述虫草菌ITS区通用引物CorF及CorR作为阳性对照组的PCR引 物， 分别利用上述两组引物按照常。

20、规的 PCR 方法扩增待测样品， 两者均能扩增到特异性 DNA 片段的样品即为发虫草， 其中利用 Probe I 及 Probe II 获得的 DNA 片断长为 109bp， 利用 CorF 及 CorR 获得的 DNA 片断长为 530bp 左右。仅虫草菌 ITS 通用引物 CorF 及 CorR 能够 得到特异性片段而本发明提供的发虫草专一性的核酸分子探针组成的PCR引物Probe I及 Probe II 不能扩增到特异性 DNA 片段的样品则不是发虫草样品。其中， PCR 反应可以利用 本发明所述的试剂盒中的试剂或按照常规的分子生物学方法提取的发虫草样品总 DNA 作 为模板， 也可以直。

21、接挑取少量的发虫草样品加入 PCR 反应体系作为模板。 0018 本发明的发虫草专一性核苷酸分子探针 ： Probe I 和 Probe II 具有极高的专一 性， 可以与发虫草发生专一性的反应而不与其他种类的虫草或其他真菌发生反应。利用上 述探针通过PCR的方法或核酸杂交或荧光定量PCR的方法可以快速的对发虫草及相关制品 进行检测。本发明由于有采用 DNA 序列作为检测标记， 因此可以准确、 快速的检测未知样品 是否为或含有发虫草， 其中样品可以为子实体、 其粉碎加工产品及包含有发虫草的中成药 制剂、 保健品。采用 PCR 方法检测时， 所需样品量极少， 方法简单， 半天内可完成检测。 附图。

22、说明 ： 0019 图 1 是核糖体 rRNA 基因结构示意图， 其中标示为 ITS 区的范围为本发明涉及的 DNA 序列， 即核糖体 rRNA 内转录间隔区 ITS1 和 ITS2 以及 5.8S rRNA 基因 ； 0020 图2是本发明所述的发虫草特征性核苷酸序列全序列以及用于鉴定发虫草的两个 发虫草专一性核苷酸分子探针 Probe I、 Probe II 及 Probe III 的位置图， 该图显示 ITS 区 正链序列， 左侧为 5 端， 右侧为 3 端， 其中加粗及下划线部分分别为 Probe I(77bp-94bp， 位于正链上 )、 ProbeII(163bp-185bp， 位。

23、于负链上 ) 及 Probe III(103bp-129bp， 位于正链 上 ) ； 0021 图 3 是实施例 3 中的 PCR 反应结果示意图， 其中 1， 2 为蛹虫草 ； 3， 4 为戴氏虫草 ； 5， 6为冬虫夏草 ； 7， 8为蜂头虫草 ； 9， 10为球孢白僵菌， 11， 12为连州虫草 ； 13， 14为发虫草， M 为 DNA 分子量标准 ； 0022 图 4 是实施例 4 中的 PCR 反应结果示意图， 其中 1， 2 为蛹虫草 ； 3， 4 为戴氏虫草 ； 5， 6为冬虫夏草 ； 7， 8为蜂头虫草 ； 9， 10为球孢白僵菌， 11， 12为连州虫草 ； 13， 14为。

24、发虫草， M 为 DNA 分子量标准。 具体实施方式 ： 0023 以下实施例是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。 0024 实施例 1 ： 0025 发虫草 rRNA 内转录间隔区以及 5.8S rRNA 基因 (ITS 区的序列 ) 的制备 0026 取发虫草样品 0.1-0.5g， 液氮中研磨成粉， 加入 300l 尿素提取液 (SDS 1.5， 尿素 7mol/L， Tris-HCl pH8.00.05mol/L， NaCl 0.5mol/L)， 移入 1.5ml 微型离心管中， 在 液氮中冷却， 迅速移到 65融化。反复冻融 3 5 次后， 加入等体积的酚氯仿异戊 说 明。

25、 书 CN 102337347 B 5 4/5 页 6 醇 (25 24 1)， 震荡， 13000r/min 离心 10min， 上清移入新管中加入等体积氯仿异 戊醇 (24 1)， 震荡， 13000r/min 离心 10min， 上清移入新管中加入微量 Rnase A， 37保 温 30min， 加入 3 倍体积无水乙醇， 3M NaAc(pH5.2)， -20放置至少 30min 后， 13000rpm 离心 15min， 回收 DNA 沉淀， 用 70乙醇和无水乙醇洗涤， 抽干或风干， 每管加入 50ul TE(100mmol/L Tris-Cl， 10mmol/L EDTA， pH。

26、8.0) 回溶， 获得总 DNA。 0027 取0.2ml PCR管一支， 加入20ul PCR反应液(包括10 xPCR缓冲液2ul， 引物CorF、 CorR 各 40ng， 2mmol/L dNTP 1ul， Taq 酶 1 个单位， 加超纯水至 20ul)， 加入 0.5ul 发虫草总 DNA提取液， 闭紧管盖， 置于PCR仪上按以下程序进行PCR反应 ： 94预变性3min， 然后93 变性 1min， 55复性 1min， 72延伸 2min， 共 30 个循环， 最后 72延伸 10min。反应完成后 利用商业化的纯化试剂盒进行产物的纯化并直接在 DNA 测序仪上测序。获得核苷酸。

27、序列除 去 18S rRNA 基因以及 28S rRNA 基因序列后所得到的序列即为发虫草 rRNA 内转录间隔区 以及 5.8S rRNA 基因的序列， 其序列如 SEQ ID NO.1 所示。 0028 实施例 2 ： 0029 发虫草专一性探针 ( 引物 ) ： Probe I， Probe II 及 ProbeIII 的制备 0030 将发虫草的 ITS 区序列与其他虫草菌的同源序列进行比较， 获得最适于鉴别发虫 草寡核苷酸片段组成与排列顺序， 即 Probe I， Probe II 及 Probe III， 如图 2 所示， Probe I 位置为 77bp-94bp， 位于正链上 。

28、； Probe II 位置为 163bp-185bp， 位于负链上 ； Probe III 位置为 103bp-129bp， 位于正链上。根据 Probe I， Probe II 及 Probe III 的核苷酸排列和 组成可以在商业化的 DNA 合成仪上通过化学合成的方法合成 Probe I( 如 SEQ ID NO.2 所 示 )， Probe II( 如 SEQ ID NO.3 所示 ) 及 Probe III( 如 SEQ ID NO.4 所示 )， 即可用作专 一性 PCR 引物。再此基础上， 可以利用常规的分子生物学方法利用酶、 同位素、 生物素、 化学 荧光素、 荧光剂等对 Pr。

29、obe I 及 Probe II 进行标记， 即可用做杂交用探针。将 Probe III 根据Taqman探针法进行荧光及淬灭基团的标记即可利用其作为Taqman探针进行荧光定量 PCR。 0031 实施例 3 ： 0032 鉴定发虫草的正对照试验 0033 本试验用以确定 DNA 样品符合 PCR 要求可获得特异性 PCR 产物。 0034 方法 1 ： 总 DNA 提取参照实施例 1 进行， 对不同的样品 ( 蛹虫草， 戴氏虫草， 冬虫夏 草， 蜂头虫草， 球孢白僵菌， 连州虫草， 发虫草 ) 分别提取 DNA， 再进行 PCR 扩增。各个样品 的 PCR 反应体系为 ： 20ul PCR。

30、 反应液 ( 包括 10 xPCR 缓冲液 2ul， 引物 CorF、 CorR 各 40ng， 2mmol/L dNTP 1ul， Taq 酶 1 个单位， 加超纯水至 20ul)， 加入 0.5ul 各个样品的总 DNA 提 取液， 闭紧管盖， 置于 PCR 仪上按以下程序进行 PCR 反应 ： 94预变性 3min， 然后 93变性 1min， 55复性 1min， 72延伸 2min， 共 30 个循环， 最后 72延伸 10min。扩增的产物在 2的含有 DNA 染料的琼脂糖凝胶上进行电泳， 在适当的紫外光源下查看以及拍照。 0035 方法 2 ： 用牙签直接挑取适量的各个样品 ( 。

31、粉碎子实体、 粉碎的相关制品 )( 蛹虫 草， 戴氏虫草， 冬虫夏草， 蜂头虫草， 球孢白僵菌， 连州虫草， 发虫草 ) 在装 20ul 超纯水的 0.2ml PCR管种搅动， 并分别稀至0.1倍以及0.01倍， 取2ul上述三个浓度的样品悬浊液加 入含有 20ul PCR 反应液 ( 包括 10 xPCR 缓冲液 2ul， 引物 CorF、 CorR 各 40ng， 2mmol/L dNTP 1ul， Taq 酶 1 个单位， 加超纯水至 20ul) 的 0.2ml PCR 管中， 充分混匀闭紧管盖， 全部 PCR 说 明 书 CN 102337347 B 6 5/5 页 7 管置于 PCR。

32、 仪上进行如下 PCR 反应 ： 94预变性 3min， 然后 93变性 1min， 60复性 1min， 72延伸 2min， 共 30 个循环， 最后 72延伸 10min。扩增的产物在 2的含有 DNA 着色剂 的琼脂糖凝胶上进行电泳， 在适当的紫外光源下查看以及拍照。 0036 图 3 为按方法 1 进行的实验结果， 显示七种虫草 (1， 2 为蛹虫草 ； 3， 4 为戴氏虫草 ； 5， 6为冬虫夏草 ； 7， 8为蜂头虫草 ； 9， 10为球孢白僵菌， 11， 12为连州虫草 ； 13， 14为发虫草) 均可正常的扩增得到 ITS 区 DNA 特异性片段， 该结果表明五种待测虫草提取。

33、的总 DNA 符合 PCR 扩增的要求， 可以用作专一性检测的待测样品。 0037 实施例 4 ： 0038 发虫草专一性鉴别 0039 用以从符合 PCR 要求的样品中专一性的扩增发虫草， 从而鉴别发虫草。 0040 方法1 ： 使用实施例3中符合PCR反应要求的样品， 以这些样品的总DNA作为模板， 参照实施例1中方法进行PCR扩增， 其中引物替换为Probe I及Probe II， 反应条件为94 预变性 3min， 然后 93变性 1min， 60复性 1min， 72延伸 2min， 共 30 个循环， 最后 72 延伸 10min。扩增的产物在 2的含有 DNA 染料的琼脂糖凝胶上。

34、进行电泳， 在适当紫外的光 源下查看以及拍照。 0041 方法 2 ： 使用实施例 3 中符合 PCR 反应要求的样品悬浊液如实施例 3 中方法 2 所 述进行PCR反应， 其中引物替换为Probe I及Probe II， 反应条件为94预变性3min， 然后 93变性 1min， 60复性 1min， 72延伸 2min， 共 30 个循环， 最后 72延伸 10min。扩增的 产物在 2的含有 DNA 染料的琼脂糖凝胶上进行电泳， 在适当的紫外光源下查看以及拍照。 0042 图 4 为按方法 1 进行的实验结果， 显示七种虫草 (1， 2 为蛹虫草 ； 3， 4 为戴氏虫草 ； 5， 6 。

35、为冬虫夏草 ； 7， 8 为蜂头虫草 ； 9， 10 为球孢白僵菌， 11， 12 为连州虫草 ； 13， 14 为发虫 草 )， 其中只有发虫草被专一性的扩增获得 109bp 左右的特异性 DNA 片段， 而其他虫草均无 特异性 DNA 片段被扩增， 该结果表明， 发虫草专一性探针 ( 引物 )Probe I 及 Probe II 可以 从多种虫草中准确的鉴别出发虫草， 同时根据实施例 3 排除了假阴性 ( 不符合 PCR 扩增条 件而造成的阴性结果 ) 的可能。 说 明 书 CN 102337347 B 7 1/3 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 102337347 B 8 2/3 页 9 0003 序 列 表 CN 102337347 B 9 3/3 页 10 序 列 表 CN 102337347 B 10 1/2 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102337347 B 11 2/2 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102337347 B 12 。