具人鼠交叉反应的抗VEGFR-2单克隆抗体及其制备、应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101643509 B (45)授权公告日 2011.09.07 CN 101643509 B *CN101643509B* (21)申请号 200910026399.X (22)申请日 2009.04.22 CGMCC No.3013 2009.04.09 C07K 16/28(2006.01) C12N 15/06(2006.01) C12P 21/08(2006.01) G01N 33/577(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12N 5/20(2006.0。

2、1)(73)专利权人 南京医科大学 地址 210029 江苏省南京市鼓楼区汉中路 140 号 专利权人 中国人民解放军南京军区军事医 学研究所 (72)发明人 冯振卿 黄剑飞 朱进 谭洋 唐奇 刘新建 管晓虹 (74)专利代理机构 南京君陶专利商标代理有限 公司 32215 代理人 奚胜元 CN 101245106 A,2008.08.20, 说明书全文 . CN 1800373 A,2006.07.12, 说明书全文 . (54) 发明名称 具人鼠交叉反应的抗 VEGFR-2 单克隆抗体及 其制备、 应用 (57) 摘要 本发明涉及的是一种具人鼠交叉反应的抗 VEGFR-2 单克隆抗体及其制。

3、备、 应用， 该抗体由杂 交瘤细胞株 8H1 分泌产生， 具人鼠交叉反应， 高特 异性识别天然抗原 VEGFR-2 的三种形式。具人 鼠交叉反应的抗 VEGFR-2 单克隆抗体 A8H1 由抗 VEGFR-2 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 8H1 分泌产 生。其制备方法 ： 制备小鼠免疫原和检测用抗原 ； 制备抗VEGFR-2杂交瘤细胞株， 用His-VEGFR-2重 组蛋白作为免疫原在纯系 BALB/c 小鼠腹部皮下 注射进行免疫接种 ； VEGFR-2 阳性单克隆抗体的 筛选， ELISA 方法筛选 VEGFR-2 阳性而正常人血 清阴性的单克隆抗体 ； 单克隆抗体的亚型鉴定 ； BALB/c。

4、 小鼠体内生产单抗并纯化 ； 采用 ELISA 等 方法对 A8H1 进行功能鉴定及应用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 奚静 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 5 页 CN 101643509 B1/1 页 2 1. 一种具人鼠交叉反应抗 VEGFR-2 的单克隆抗体 A8H1， 是由保藏号为 CGMCC No.3013 的鼠源杂交瘤细胞株 8H1 所分泌的。 2. 权利要求 1 所述的具人鼠交叉反应抗 VEGFR-2 的单克隆抗体 A8H1 在制备检测 VEGFR-2 抗原试剂中的应用。

5、。 3. 权利要求 1 所述的具人鼠交叉反应抗 VEGFR-2 的单克隆抗体 A8H1 在制备血管相关 的治疗性药物、 相关的诊断试剂及科研试剂中的应用。 4. 分泌权利要求 1 所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞， 是保藏号为 CGMCC No.3013 的鼠 源杂交瘤细胞株 8H1。 权 利 要 求 书 CN 101643509 B1/9 页 3 具人鼠交叉反应的抗 VEGFR-2 单克隆抗体及其制备、 应用 技术领域 0001 本发明涉及的是一种具人鼠交叉反应的抗 VEGFR-2 单克隆抗体及其制备、 应用， 该抗体由杂交瘤细胞株8H1分泌产生， 具人鼠交叉反应， 高特异性识别天然抗原VEGF。

6、R-2的 三种形式。 背景技术 0002 血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factors， VEGFs) 家族在胚 胎发育及出生后的血管发育过程中均起重要的调节作用， 主要参与新生血管和淋巴管的 形成。VEGF 家族成员与 3 种酪氨酸激酶受体即血管内皮生长因子受体 (VEGFR1、 VEGFR2、 VEGFR3) 结合后发挥作用。VEGFR 介导了一系列细胞行为包括细胞迁移、 存活、 增殖等， 在介 导脉管新生过程中还有其特殊功能， 如调节血管渗透性导致的组织水肿。VEGFR2 主要功能 是在各种生理病理情况下介导新生血管的形成。 0003 近几年。

7、免疫治疗及免疫靶向疗法在疾病综合治疗中的作用有了较大进步。 由于抗 体的高度特异性， 利用抗体将药物导向靶点细胞是一种理想的途径， 抗体导向的药物治疗 在动物模型和临床试验中显示出较强的治疗作用。 0004 同时， 用于医学科研和临床诊断的生物试剂市场需求大， 就目前国内外市场上及 现有的文献报道， 尚未见具有具人鼠交叉反应， 高特异性抗 VEGFR-2 的单克隆抗体， 可用多 种免疫学方法的研究。 发明内容 0005 本发明目的是提供一种具人鼠交叉反应的抗 VEGFR-2 单克隆抗体及其制备、 应 用。 0006 本发明所提供的可产生具人鼠交叉反应的抗 VEGFR-2 单克隆抗体的杂交瘤细胞。

8、 株， 名称为 8H1， 该细胞株已于 2009 年 4 月 9 日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心， 保藏编号为 CGMCC No.3013。 0007 具人鼠交叉反应的抗 VEGFR-2 单克隆抗体 A8H1 由抗 VEGFR-2 单克隆抗体的杂交 瘤细胞株 8H1 分泌产生。 0008 具人鼠交叉反应的抗 VEGFR-2 单克隆抗体的制备方法 ： 0009 1、 制备小鼠免疫原和检测用抗原 ： 0010 从 GenBank 获取 VEGFR-2 基因的核苷酸片段序列 (accession No.NM002253) (nucleotides975-1283)gatgtggttctgag。

9、tccgtctcatggaattgaactatctgttggagaaaagcttgt cttaaattgtacagcaagaactgaactaaatgtggggattgacttcaactgggaatacccttcttcgaagcatcagc ataagaaacttgtaaaccgagacctaaaaacccagtctgggagtgagatgaagaaatttttgagcaccttaactata gatggtgtaacccggagtgaccaaggattgtacacctgtgcagcatccagtgggctgatgaccaagaagaacagcac atttgtcagggtccatgaaaaa，。

10、 设计并合成上下游引物 ： F ： 5-cgggatccgatgtggttctgagtccgtc tcatgg-3 ； R ： 5-cggaattctcatttttcatgaactctaacaaaggtg-3。通过正常人脐内皮静脉细胞 说 明 书 CN 101643509 B2/9 页 4 中提取总 RNA， 逆转录 cDNA， 以 cDNA 为模板， 以上述引物条件下， PCR 扩增 VEGFR-2 基因。 0011 将 VEGFR-2 的 PCR 产物和表达载体 pET28a 和 pGEX-4T-2 分别进行连接， 转化入 大肠杆菌 DH5 感受态细胞， 挑单菌落提取质粒， 用 BamHI。

11、 和 EcoRI 双酶切鉴定， 结果经酶 切与预期结果相符， 表明目的片段已正确连接入载体中， 再用测序的方法对阳性质粒进一 步鉴定， 测序结果表明插入片段序列正确， 获得了两种 VEGFR-2 的重组质粒， 分别命名为 VEGFR-2-His-pET28a 和 VEGFR-2-GST-pGEX-4T-2。 0012 将上述两种质粒分别转化大肠杆菌 BL-21 感受态细胞， 筛选阳性转化子进行原核 表达， 对表达产物进行 SDS-PAGE 检测， 获得了 11kDa 和 37kDa 的重组蛋白， 分别用 His 和 GST 亲和层析柱 ( 美国 Amersham 公司 ) 对目的蛋白进行纯化，。

12、 获取两种带有不同标签的 VEGFR-2 重组蛋白， 分别命名为 His-VEGFR-2 蛋白和 GST-VEGFR-2 蛋白。 0013 2、 制备抗 VEGFR-2 杂交瘤细胞株 ： 0014 用 His-VEGFR-2 重组蛋白作为免疫原在纯系 BALB/c 小鼠腹部皮下注射进行免疫 接种， 每次100g/ml， 共五次， 在最后一次免疫接种前三天进行腹腔内加强免疫。 融合当天 取小鼠脾脏， 用 DMEM 培养基 ( 美国 GIBCO 公司 ) 制备成单细胞悬液， 在 50 PEG(PH 8.0) 存在下， 将脾细胞和 SP2/0 小鼠骨髓瘤细胞进行融合， 用 HAT 选择性培养基 (D。

13、MEM 培养基 98ml， HT 贮存液 1ml， A 贮存液 1ml) 培养 7 天， 换用 HT 培养基 (DMEM 培养基 99ml， HT 1ml) 培养。 0015 3、 VEGFR-2 阳性单克隆抗体的筛选 0016 根据杂交瘤细胞生长情况行酶联免疫法 (ELISA) 检测筛选， 具体方法见下述。 取检测阳性孔的细胞再次克隆化， 经过 5 次克隆化， 待所有的孔内单克隆细胞检测都为 VEGFR-2 阳性后， 取数孔扩大培养并部分冻存。 0017 ELISA 方法筛选 VEGFR-2 阳性而正常人血清阴性的单克隆抗体， 具体方法如下 ： 0018 (1) 纯化的 GST-VEGFR-。

14、2 蛋白包被 ELISA 的 96 孔板， 用包被液 (0.1M 碳酸盐缓冲 液， pH9.6) 稀释至 20g/ml， 每孔加入 100l， 4过夜 ； 0019 (2)用PBST洗涤液(PBS含0.05吐温)洗涤5次后加入10小牛血清(200l/ 孔 ) 封闭， 37孵育 2h， 洗涤 5 次后备用。 0020 (3) 每个孔中加入 50l 杂交瘤细胞培养上清， 以脾切除小鼠的血清为阳性对照 (1 1000 稀释 )， 以正常小鼠的血清为阴性对照 (1 1000 稀释 )37孵育 1h。 0021 (4) 将以 1 5000 稀释的羊抗鼠 Ig-HRP 第二抗体 (Santa Cruz 公。

15、司 )100l/ 孔 加入到孔内， 37孵育 1h， PBST 洗涤 5 次 ； 0022 (5) 加入过氧化物酶底物显色液 100l/ 孔， 室温下 15 分钟后用 2M 硫酸中止 反应。用 multiskan spectrum(Thermo labsystems， USA) 酶标仪检测， 比色采用双波长 450nm/630nm， 检测结果大于正常鼠血清 OD 值 2.5 倍的为 VEGFR-2 阳性克隆， 最终选取 2 株 稳定分泌抗 VEGFR-2 抗体的杂交瘤细胞， 分别命名为 8H1 和 8H2， 它们分泌的单抗分别命名 为 A8H1 和 A8H2。 0023 4、 单克隆抗体的亚型。

16、鉴定 0024 用美国 Sigma 公司的单克隆抗体亚型鉴定试剂盒 (ISO-2KT) 进行抗体的亚型， 结 果示抗 VEGFR-2 抗体 A8H1、 A8H2 的亚型都为 Ig2a。 0025 5、 BALB/c 小鼠体内生产单抗并纯化 说 明 书 CN 101643509 B3/9 页 5 0026 六周龄小鼠腹腔接种降植烷 0.5ml/ 只， 10 天后腹腔接种用无血清 DMEM 培养基 稀释的上述 8H1、 8H2 杂交瘤细胞悬液， 同时用 SP2/0 骨髓瘤细胞做对照， 每只小鼠 5106/ 只。 10天后收集腹水， 离心取上清后二氧化硅粉末去杂质， 用Protein G亲和层析柱(。

17、美国 Amersham 公司 ) 纯化抗体， 测定浓度后分装， -70冻存。 0027 6、 ELISA 方法对 A8H1 进行功能鉴定及应用 0028 用包被液稀释商品化的重组 VEGFR-2 蛋白 ( 购自美国 R&D 公司 ) 至 2g/ml， 每孔加入 100l 包被 96 孔 ELISA 板， 4过夜 ； PBST(PBS 含 0.5 Tween20)5脱脂牛 奶 - 洗涤缓冲液封闭， 37孵育 2h ； PBST 洗涤 5 次后， 每个孔中加入 100l A8H1(2g/ml 起始浓度， 11 个浓度梯度稀释 )4过夜 ； 以 1 5000 稀释的羊抗人二抗 (Santa Cruz。

18、 公 司 )100l/ 孔加入到孔内， 37孵育 1h ； 过氧化物酶底物显色液 100l/ 孔， 室温下 15 分 钟后用 2M 硫酸中止反应， 上机检测比色采用双波长 450nm/630nm。 0029 结果示A8H1与商品化抗原VEGFR-2有较好的结合活性， A8H1具有较高的ELISA反 应滴度。 0030 7、 免疫印迹 (WB) 方法对 A8H1 进行功能鉴定及应用 0031 将 1107个高表达 VEGFR-2 的人脐内皮静脉细胞 (HUVEC) 和低或无表达 VEGFR-2 的小鼠成纤维细胞 (NIH3T3) 为阴性对照， 在 RAPI 裂解液中裂解， 取得细胞总蛋白， 将总。

19、蛋 白进行 10 SDS-PAGE 电泳并电转到硝酸纤维膜上， 将此膜与 20g/ml A8H1 和内参抗体 -actin 稀释 1 1000(Santa Cruz 公司 ) 同时孵育， 1 1000 稀释的羊抗人 IgG 二抗 (Santa Cruz 公司 ) 和 ECL 发光试剂盒 ( 美国 Pierce 公司 ) 曝光于 X 片 ( 柯达公司 )。 0032 结果示 ： HUVEC 总蛋白泳道在 230kDa 和 43kDa 处各出现一亮条带， 分别为成熟 型 VEGFR-2 和内参 -actin ； NIH3T3 细胞总蛋白泳道在 230kDa 处出现一暗带， 为成熟型 VEGFR-2。

20、， 43kDa 的内参 -actin 处有一亮条带 ； 0033 随曝光时间延长， HUVEC 总蛋白泳道在 200kDa 处又出现一亮条带， 为磷酸化 VEGFR-2， NIH3T3 细胞总蛋白泳道在 230kDa 处一暗带成亮带， 为成熟型 VEGFR-2， 200kDa 处 未见条带出现 ； 0034 由此可见， A8H1 与人源、 鼠源的天然抗原 VEGFR-2 有较好的结合活性， 在 WB 应用 中能识别两种形式的 VEGFR-2 天然抗原 ( 成熟型和磷酸化 )。 0035 8、 免疫沉淀方法 (IP) 对 A8H1 进行功能鉴定及应用 0036 将 1107个 HUVEC 和 N。

21、IH3T3 细胞 ( 阴性对照 ) 在 0.5ml RAPI 裂解液中裂解， 取 得细胞总蛋白 ； 取 4 个 EP 管编号 a、 b、 c、 d， 每管内分别加 20g A8H1、 40l 的 ProteinA/ G(sigma公司)， 再加PBS 450l 4混悬3h， 412000rpm 30弃上清PBS洗3次， a、 b、 c、 d 各管分别 100l NIH3T3 细胞总蛋白、 30l、 70l、 100l HUVEC 总蛋白 4混悬过 夜， 4 12000rpm 30 PBS 洗 3 次弃上清， 各管加入 40l 的 2SDS-PAGE 上样缓冲液， 干 湿加热器 100 2， 上。

22、样于 10 SDS-PAGE 电泳并电转到硝酸纤维膜上 ； 将此膜与 20g/ ml A8H2 抗体孵育， 1 1000 稀释的羊抗人 IgG 二抗 (Santa Cruz 公司 ) 和 ECL 发光试剂 盒 ( 美国 Pierce 公司 ) 曝光于 X 片 ( 柯达公司 )。 0037 结果示曝光 3， 各泳道在 230kDa 处均见一亮带， 为成熟的 VEGFR-2 蛋白 ； 0038 曝光 3， 各泳道在 230kDa 和 200kDa 处均见两亮带， 后者是磷酸化的 VEGFR-2 蛋 白 ； 在 HUVEC 总蛋白 (b、 c、 d 管 )3 泳道中还有 150kDa 的未成熟型的 。

23、VEGFR-2 ； NIH3T3 总蛋 说 明 书 CN 101643509 B4/9 页 6 白 a 泳道中未见此条带 ； 同时在 c， d 两泳道可见明显的重链 (75kDa) 和轻链 (30kDa)， b， a 泳道无轻重链可见。 0039 由上可见， A8H1与人源、 鼠源的天然抗原VEGFR-2有高特异性的结合活性， 在IP应 用中可识别三种形式的 VEGFR-2 天然抗原 ( 成熟型、 磷酸化， 未成熟型 )。 0040 9、 免疫荧光检测技术 (IF) 对 A8H1 进行功能鉴定及应用 0041 将HUVEC和NIH3T3细胞(阴性对照)进行爬片培养， 待细胞长约玻片80面积左 。

24、右时候， 0.1多聚甲醛固定细胞半小时后无菌预冷 4的 PBS 冲洗三遍， 加浓度为 20g/ ml 的 A8H1 抗体 4过夜， PBS 冲洗三遍后加入 IgG 罗丹明荧光二抗 (sigama 公司 )， 避光室 温孵育 1 小时， PBS 冲洗三遍， 加入 DAPI(Dojindo 公司， 日本 ) 染细胞核， 37孵育 20， PBS 冲洗三遍， 甘油封片后在倒置显微镜 (Olympus 公司， 日本 ) 下观察并拍摄照片。 0042 结果HUVEC细胞质和膜可见强荧光， 而部分NIH3T3细胞核见荧光， 可见A8H1在IF 中应用， 具高特异性结合人源、 鼠源的天然抗原 VEGFR-2。

25、。 0043 10、 流式细胞术 (FACS) 对 A8H1 进行功能鉴定及应用 0044 分别将 2106个 HUVEC 和 NIH3T3 细胞用含 0.1多聚甲醛 PBS 固定细胞半小时 后， 无菌预冷4的PBS冲洗三遍， 加A8H1梯度浓度为20g/ml、 10g/ml共孵育4过夜， PBS 冲洗三遍后加入 IgG 罗丹明荧光二抗 (sigama 公司 )， 避光室温孵育 1 小时后 PBS 冲洗 三遍， 含 0.1多聚甲醛 PBS 400l 重悬， 在 FACS(Becton Dickinson， San Jose， CA) 上进 行免疫荧光分析， 以加 SP2/0 骨髓瘤细胞注射产生。

26、腹水一抗为本底。 0045 结果为 ： 细胞与阴性腹水本底 0.41 ； HUVEC 与 A8H1(20g/ml) 结合率达 35.55， 与 A8H1(10g/ml) 结合率达 31.33 ； NIH3T3 与抗体 A8H1(20g/ml) 结合率 10.18， 与抗体 A8H1(10g/ml) 结合率 10.12。 0046 由此可见抗 VEGFR-2 抗体 A8H1 在 FACS 中应用， 可与表达 VEGFR-2 的人源、 鼠源的 细胞不同程度的特异性结合。 0047 11、 免疫组化技术 (IHC) 对 A8H1 进行功能鉴定及应用 0048 肠间质瘤、 肝癌石蜡组织连续切片， 切片。

27、上组织经高温抗原修复后， 加 A8H1(20g/ml)37孵育30， 以CD34一抗(DAKO公司)作阳性对照， 随后用ENVISION试 剂盒 (DAKO 公司 ) 试剂 37孵育 30， DAB 显色， 以自身对照为阴性对照， 显微镜下观察终 止显色， 最后用苏木素复染细胞核。 0049 结果 A8H1 与 CD34 均和血管上皮结合而显棕色， 同时肝癌细胞的细胞质内和膜上 也显棕色 ( 该肝癌细胞过表达 VEGFR-2)， 可见 A8H1 在 IHC 中应用， 可与过表达 VEGFR-2 的 组织结合。 0050 12、 质谱 (MALDI-MS) 分析 A8H1 结合蛋白质的氨基酸序列。

28、及应用 0051 利用 IP、 SDS-PAGE 和质谱分析目的蛋白质的氨基酸序列， 从而确定单克隆抗体 A8H1 抗 VEGFR-2 的准确性。20g A8H1、 40l 的 ProteinA/G(sigma 公司 )， PBS 450l 4混悬 3h， 4 12000rpm 30弃上清 PBS 洗 3 次， 107个 HUVEC 经 0.5ml RIPA 裂解的总蛋 白 100l， 4混悬过夜， 4 12000rpm30弃上清 PBS 洗 3 次， 加入 40l 的 2SDS-PAGE 上样缓冲液， 干湿加热器 100 2， 上样于 10 SDS-PAGE 电泳， 在 230kDa 处可见。

29、一亮条 带。 切取该条带送质谱分析其蛋白质的氨基酸序列， 结果示A8H1特异性识别VEGFR-2抗原。 0052 获得的单克隆抗体 A8H1 是目的抗 VEGFR-2 单抗， 具高特异性识别重组 VEGFR-2 蛋 说 明 书 CN 101643509 B5/9 页 7 白抗原， 人源、 鼠源的天然 VEGFR-2 蛋白抗原， 可用于 ELISA、 WB、 IP、 FACS、 IF、 IHC， MALDI-MS 的免疫学研究， 也可潜在用于以潜在用于血管相关 ( 包括一些高表达 VEGFR-2 的肿瘤 ) 疾 病的诊断和治疗。 0053 所述的具人鼠交叉反应抗 VEGFR-2 的单克隆抗体 A。

30、8H1 在检测 VEGFR-2 抗原中的 应用。 0054 所述的具人鼠交叉反应抗VEGFR-2的单克隆抗体A8H1在制备相关的治疗性药物、 相关的诊断试剂及科研试剂中的应用。 0055 本发明与现有技术相比具有的优点 ： 0056 从 GenBank 获取 VEGFR-2 基因的核苷酸片段序列 (accession No.NM002253) (nucleotides 975-1283)， 运用单克隆抗体制备技术制备的具人鼠交叉反应的抗 VEGFR-2 单 克 隆 抗 体 A8H1， 可 以 应 用 于 酶 联 免 疫 法 (Enzyme linkedimmunosorbent assay， 。

31、ELISA)、 免疫印迹 (Western blot， WB)、 免疫沉淀 (Immunoprecipitation， IP)、 流 式 细 胞 术 (Flow cytometry， FACS)、 免 疫 荧 光 (Immunofluorescence， IF)、 免 疫 组 化 (Immunohistochemistry， IHC) 的研究， 也可以潜在用于血管相关 ( 包括一些高表达 VEGFR-2 的肿瘤 ) 疾病的诊断和治疗， 国内外未见相同报道。 0057 该具人鼠交叉反应的抗体 A8H1 用于体外免疫学研究和诊断， 具有无毒、 多种免疫 学研究方法用途的优点， 原因在于 ： 1)A。

32、8H1 抗体本身是一种免疫球蛋白， 不会通过呼吸道、 身体表面接触而伤害健康 ； 2)A8H1 可以同时应用于 ELISA、 WB、 IP、 FACS、 IF， IHC 免疫学研 究 ； 3)A8H1 具高特异抗 VEGFR-2 功能， 可同时识别天然抗原 VEGFR-2 的三种形式 ( 成熟型、 磷酸化型， 未成熟型 ) ； 4) 经质谱 (Matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry， MALDI-MS) 和氨基酸序列分析， A8H1 特异性识别 VEGFR-2 抗原 ； 5) 可潜在用 于血管相关 ( 包括一些。

33、高表达 VEGFR-2 的肿瘤 ) 疾病的诊断和治疗。 0058 同时， 该抗体 A8H1 可潜在应用于体内研究、 诊断和治疗血管 ( 包括一些高表达 VEGFR-2 的肿瘤 ) 相关疾病， 具有广谱、 低毒或无毒、 低耐药性的优点， 其原因在于 ： 1) 肿瘤 血管内皮细胞突变少， 不易产生耐药性 ； 2) 虽然不同类型的肿瘤特异性靶蛋白不同， 但是 其血管无本质差异， 因此具有广谱性 ； 3) 直接作用于血管内皮包括肿瘤内部的新生血管， 避免了肿瘤内部高压及药物分布的问题。 0059 基于上述优点， 可以潜在应用 A8H1 为活性成分制成与血管相关疾病的诊断及治 疗的试剂或药物。 该抗体制。

34、备方法简单， 可由杂交瘤细胞株8H1直接分泌产生。 本发明不仅 为进一步研究 VEGFR-2 的生物学功能及其作用机理奠定了基础， 而且在制备血管 ( 包括一 些高表达 VEGFR-2 的肿瘤 ) 相关疾病的诊断性试剂和治疗性药物中具有潜在的应用前景。 附图说明 0060 以下将结合附图对本发明作进一步说明 ： 0061 图 1 为 重 组 His-VEGFR-2 蛋 白 和 GST-VEGFR-2 蛋 白 的 SDS-PAGE 检 测 结 果， His-VEGFR-2 蛋白和 GST-VEGFR-2 蛋白分别为 11kDa 和 37kDa。 0062 图 2 为抗 VEGFR-2 单克隆抗体。

35、 A8H1 与商品化抗原的酶联免疫吸附试验检测结果， 显示 A8H1 有较高的滴度反应。 0063 图 3-1、 3-2 为抗 VEGFR-2 单克隆抗体 A8H1 与细胞来源的天然抗原免疫印迹鉴 说 明 书 CN 101643509 B6/9 页 8 定结果， A8H1 与人源、 鼠源的天然抗原 VEGFR-2 有较好的结合活性， 能识别两种形式的 VEGFR-2。 0064 图 4-1、 4-2 为抗 VEGFR-2 单克隆抗体 A8H1 与细胞来源的天然抗原免疫沉淀鉴定 结果， A8H1 与人源、 鼠源的天然抗原 VEGFR-2 有高特异性的结合活性， 能识别三种形式的 VEGFR-2。。

36、 0065 图5-1、 5-2为免疫荧光技术鉴定抗VEGFR-2单克隆抗体A8H1与细胞表达VEGFR-2 的定位结果， HUVEC 细胞质和膜可见强荧光， 而部分 NIH3T3 细胞核见荧光。可见 A8H1 具高 特异性结合人源、 鼠源的天然抗原 VEGFR-2。 0066 图 6 为流式细胞术鉴定抗 VEGFR-2 单克隆抗体 A8H1 细胞表达的 VEGFR-2 活性的 结果， HUVEC 与 A8H1 结合率达 30以上， NIH3T3 与抗体 A8H1 结合率为 10左右。 0067 图 7-1、 7-2、 7-3、 7-4 用免疫组织化学技术分析抗 VEGFR-2 单克隆抗体 A8。

37、H1 的石 蜡切片组织定位结果， A8H1 和血管上皮结合而显棕色， 同时肝癌细胞的细胞质内和膜上也 显棕色。 0068 图 8-1、 8-2 质谱鉴定、 氨基酸序列分析结果， 示 A8H1 特异性识别 VEGFR-2 抗原。 具体实施方式 0069 实施例 1、 抗 VEGFR-2 单克隆抗体的制备及筛选 0070 应用杂交瘤技术制备抗 VEGFR-2 单克隆抗体， 具体步骤如下 ： 0071 1、 制备小鼠免疫原和检测用抗原 ： 0072 从 GenBank 获取 VEGFR-2 基因的核苷酸片段序列 (accession No.NM002253) (nucleotides975-1283。

38、)gatgtggttctgagtccgtctcatggaattgaactatctgttggagaaaagcttgt cttaaattgtacagcaagaactgaactaaatgtggggattgacttcaactgggaatacccttcttcgaagcatcagc ataagaaacttgtaaaccgagacctaaaaacccagtctgggagtgagatgaagaaatttttgagcaccttaactata gatggtgtaacccggagtgaccaaggattgtacacctgtgcagcatccagtgggctgatgaccaagaagaacagcac atttgtca。

39、gggtccatgaaaaa， 设计并合成上下游引物 ： F ： 5-cgggatccgatgtggttctgagtccgtc tcatgg-3 ； R ： 5-cggaattctcatttttcatgaactctaacaaaggtg-3。通过正常人脐内皮静脉细胞 中提取总 RNA， 逆转录 cDNA， 以 cDNA 为模板， 以上述引物条件下， PCR 扩增 VEGFR-2 基因。 0073 将 VEGFR-2 的 PCR 产物和表达载体 pET28a 和 pGEX-4T-2 分别进行连接， 转化入 大肠杆菌 DH5 感受态细胞， 挑单菌落提取质粒， 用 BamHI 和 EcoRI 双酶切鉴。

40、定， 结果经酶 切与预期结果相符， 表明目的片段已正确连接入载体中， 再用测序的方法对阳性质粒进一 步鉴定， 测序结果表明插入片段序列正确， 获得了两种 VEGFR-2 的重组质粒， 分别命名为 VEGFR-2-His-pET28a 和 VEGFR-2-GST-pGEX-4T-2。 0074 将上述两种质粒分别转化大肠杆菌 BL-21 感受态细胞， 筛选阳性转化子进行原核 表达， 对表达产物进行 SDS-PAGE 检测， 获得了 11kDa 和 37kDa 的重组蛋白， 分别用 His 和 GST 亲和层析柱 ( 美国 Amersham 公司 ) 对目的蛋白进行纯化， 获取两种带有不同标签的 。

41、VEGFR-2 重组蛋白， 分别命名为 His-VEGFR-2 蛋白和 GST-VEGFR-2 蛋白。 0075 2、 制备抗 VEGFR-2 杂交瘤细胞株 ： 0076 用 His-VEGFR-2 重组蛋白作为免疫原在纯系 BALB/c 小鼠腹部皮下注射进行免疫 接种， 每次100g/ml， 共五次， 在最后一次免疫接种前三天进行腹腔内加强免疫。 融合当天 说 明 书 CN 101643509 B7/9 页 9 取小鼠脾脏， 用 DMEM 培养基 ( 美国 GIBCO 公司 ) 制备成单细胞悬液， 在 50 PEG(PH 8.0) 存在下， 将脾细胞和 SP2/0 小鼠骨髓瘤细胞进行融合， 。

42、用 HAT 选择性培养基 (DMEM 培养基 98ml， HT 贮存液 1ml， A 贮存液 1ml) 培养 7 天， 换用 HT 培养基 (DMEM 培养基 99ml， HT 1ml) 培养。 0077 3、 VEGFR-2 阳性单克隆抗体的筛选 0078 根据杂交瘤细胞生长情况行酶联免疫法 (ELISA) 检测筛选， 具体方法见下述。 取检测阳性孔的细胞再次克隆化， 经过 5 次克隆化， 待所有的孔内单克隆细胞检测都为 VEGFR-2 阳性后， 取数孔扩大培养并部分冻存。 0079 ELISA 方法筛选 VEGFR-2 阳性而正常人血清阴性的单克隆抗体， 具体方法如下 ： 0080 (1)。

43、 纯化的 GST-VEGFR-2 蛋白包被 ELISA 的 96 孔板， 用包被液 (0.1M 碳酸盐缓冲 液， pH9.6) 稀释至 20g/ml， 每孔加入 100l， 4过夜 ； 0081 (2)用PBST洗涤液(PBS含0.05吐温)洗涤5次后加入10小牛血清(200l/ 孔 ) 封闭， 37孵育 2h， 洗涤 5 次后备用。 0082 (3) 每个孔中加入 50l 杂交瘤细胞培养上清， 以脾切除小鼠的血清为阳性对照 (1 1000 稀释 )， 以正常小鼠的血清为阴性对照 (1 1000 稀释 )37孵育 1h。 0083 (4) 将以 1 5000 稀释的羊抗鼠 Ig-HRP 第二抗。

44、体 (Santa Cruz 公司 )100l/ 孔 加入到孔内， 37孵育 1h， PBST 洗涤 5 次 ； 0084 (5) 加入过氧化物酶底物显色液 100l/ 孔， 室温下 15 分钟后用 2M 硫酸中止 反应。用 multiskan spectrum(Thermo labsystems， USA) 酶标仪检测， 比色采用双波长 450nm/630nm， 检测结果大于正常鼠血清 OD 值 2.5 倍的为 VEGFR-2 阳性克隆， 最终选取 2 株 稳定分泌抗 VEGFR-2 抗体的杂交瘤细胞， 分别命名为 8H1 和 8H2， 它们分泌的单抗分别命名 为 A8H1 和 A8H2。 0。

45、085 可产生具人鼠交叉反应的抗 VEGFR-2 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 8H1， 已于 2009 年 4 月 9 日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心， 保藏编号为 CGMCCNo.3013。 0086 4、 单克隆抗体的亚型鉴定 0087 用美国 Sigma 公司的单克隆抗体亚型鉴定试剂盒 (ISO-2KT) 进行抗体的亚型， 结 果示抗 VEGFR-2 抗体 A8H1、 A8H2 的亚型都为 Ig2a。 0088 5、 BALB/c 小鼠体内生产单抗并纯化 0089 6 周龄小鼠腹腔接种降植烷 0.5ml/ 只， 10 天后腹腔接种用无血清 1640 培养基稀 释的上述 8H1、 8。

46、H2 杂交瘤细胞悬液， 同时用 SP2/0 骨髓瘤细胞做对照， 每只小鼠 5106/ 只。 10天后收集腹水， 离心取上清后二氧化硅粉末去杂质， 用Protein G亲和层析柱(美国 Amersham 公司 ) 纯化抗体， 测定浓度后分装， -70冻存。 0090 实施例 2 抗 VEGFR-2 单克隆抗体 A8H1 的功能活性鉴定及应用 0091 1、 ELISA 方法对 A8H1 进行功能鉴定及应用 0092 用包被液稀释商品化的重组 VEGFR-2 蛋白 ( 购自美国 R&D 公司 ) 至 2g/ml， 每孔加入 100l 包被 96 孔 ELISA 板， 4过夜 ； PBST(PBS 。

47、含 0.5 Tween20)5脱脂牛 奶 - 洗涤缓冲液封闭， 37孵育 2h ； PBST 洗涤 5 次后， 每个孔中加入 100l A8H1(2g/ml 起始浓度， 11 个浓度梯度稀释 )4过夜 ； 以 1 5000 稀释的羊抗人二抗 (Santa Cruz 公 司 )100l/ 孔加入到孔内， 37孵育 1h ； 过氧化物酶底物显色液 100l/ 孔， 室温下 15 分 说 明 书 CN 101643509 B8/9 页 10 钟后用 2M 硫酸中止反应， 上机检测比色采用双波长 450nm/630nm。 0093 结果见图 2 示 ： A8H1 与商品化抗原 VEGFR-2 有较好的。

48、结合活性， A8H1 具有较高的 ELISA 反应滴度。 0094 2、 免疫印迹 (WB) 方法对 A8H1 进行功能鉴定及应用 0095 将 1107个高表达 VEGFR-2 的人脐内皮静脉细胞 (HUVEC) 和低或无表达 VEGFR-2 的小鼠成纤维细胞 (NIH3T3) 为阴性对照， 在 RAPI 裂解液中裂解， 取得细胞总蛋白， 将总 蛋白进行 10 SDS-PAGE 电泳并电转到硝酸纤维膜上， 将此膜与 20g/ml A8H1 和内参抗体 -actin 稀释 1 1000(Santa Cruz 公司 ) 同时孵育， 1 1000 稀释的羊抗人 IgG 二抗 (Santa Cruz。

49、 公司 ) 和 ECL 发光试剂盒 ( 美国 Pierce 公司 ) 曝光于 X 片 ( 柯达公司 )。 0096 结果如图3-1 ： HUVEC总蛋白泳道在230kDa和43kDa处各出现一亮条带， 分别为成 熟型VEGFR-2和内参-actin ； NIH3T3细胞总蛋白泳道在230kDa处出现一暗带， 为成熟型 VEGFR-2， 43kDa 的内参 -actin 处有一亮条带 ； 0097 随曝光时间延长如图3-2， HUVEC总蛋白泳道在200kDa处又出现一亮条带， 为磷酸 化 VEGFR-2， NIH3T3 细胞总蛋白泳道在 230kDa 处一暗带成亮带， 为成熟型 VEGFR-2， 200kDa 处未见条带出现 ； 0098 由此可见， A8H1 与人源、 鼠源的天然抗原 VEGFR-2 有较好的结合活性， 在 WB 应用 中能识别两种形式的 VEGFR-2 天然抗原 ( 成熟型和磷酸化 )。 0099 3、 免疫沉淀方法 (IP) 对 A8H1 进行功能鉴定及应用 0100 将 1107个 HUVEC 和 NIH3T3 细胞 ( 阴性对照 ) 在 0.5ml RAPI 裂解液中裂解， 取 得细胞总蛋白 ； 取 4 个 EP 管编号 a、 b、 c、 d， 每管内分别加 20g A8H1、 40l 的 ProteinA/ G。