技术领域
本发明涉及含丙型肝炎病毒全长基因组的核酸构建物、生产丙型肝炎病毒颗粒的体外方法和所生产的丙型肝炎病毒颗粒的用途。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒科家族，是一种具有单链正义RNA基因组的病毒，已知引起丙型肝炎。
HCV通过持续感染引起慢性肝炎。目前，在世界范围内观察到的慢性肝炎的重要病因是持续HCV感染。实际上，大约50％的持续感染个体发展成慢性肝炎。这些患者约有20％在10-20年间由慢性肝炎转变成肝硬化，这些患者中有一些进一步发展成晚期致死性病症，例如肝癌。
丙型肝炎目前主要通过使用干扰素-α或干扰素-β的疗法或使用干扰素-α和利巴韦林(一种嘌呤-核苷衍生物)组合的疗法治疗。但是，即使在实施这些疗法时，在所有受治疗患者中也仅有约60％观察到疗效。当观察到疗效后终止治疗时，一半以上的患者疾病复发。
一个重要目标是开发有效对抗丙型肝炎的治疗剂或预防剂。在工业化国家丙型肝炎发病率高，最终引发严重后果，目前还没有可用的病因疗法。因此，需要开发HCV-特异性化学疗法和疫苗疗法。开发抗HCV药物的目标可为抑制HCV复制或抑制HCV感染细胞。
最近，已制备了HCV亚基因组RNA复制子系统，作为HCV衍生的自主复制RNA(参见特许文献1、2和3，非特许文献1-4)。在HCV亚基因组RNA复制子系统中，制备其中HCV基因组结构基因被去除并被药物选择性标记基因取代的HCV复制子RNA，并将其导入培养细胞中，由此使复制子RNA在细胞中自主复制。使用这些系统使得有可能分析HCV的复制机制。但是，这是一个其中仅可在HCV病毒增殖和复制过程中评价病毒RNA复制的实验系统，不能分析被感染细胞中HCV病毒颗粒形成和胞外释放或感染另一细胞的过程。
此时，只能在使用动物如黑猩猩的实验系统中评价HCV病毒颗粒形成和胞外释放以及感染另一细胞的过程(非特许文献5)。但是，使用活生物(例如动物)的实验系统很复杂，非常难分析。因此，为了分析HCV病毒颗粒形成和胞外释放以及感染另一细胞的过程，为了生产具有抑制该过程的作用机制的抗HCV药物，必须建立重现该过程的高度简单化的实验系统，即在细胞培养实验系统中的HCV病毒颗粒生产系统。
此外，一旦可使用细胞培养系统稳定提供HCV病毒颗粒，就有可能使用分子生物学技术对病毒减毒或生产非感染性HCV病毒，这可用于疫苗。
特许文献1：日本特许公开(公报)第2001-17187号
特许文献2：国际专利申请PCT/JP03/15038
特许文献3：JP特许申请第2003-329082号
非特许文献1：Lohmann等，Science，(1999)285，110-113页
非特许文献2：Blight等，Science，(2000)290，1972-1974页
非特许文献3：Friebe等，J.Virol.，(2001)75(24)：12047-12057页
非特许文献4：Ikeda等，J.Virol.，(2002)76(6)：2997-3006页
非特许文献5：Kolykhalov等，Science，(1997)277，570-574页
非特许文献6：Kato等，Gastroenterology，(2003)125，1808-1817页
非特许文献7：Yanagi等，Proc.Natl.Acad.Sci.，(1997)96(16)：8738-8743页
非特许文献8：Okamoto等，J.Gen.Virol.，(1991)73，2697-26704页
非特许文献9：Aoyagi等，J.Clin.Microbiol.，(1999)37(6)：1802-1808页
发明公开
本发明的目标是提供含全长HCV基因组序列的RNA的有效复制方法和在细胞培养系统中生产含全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA的HCV病毒颗粒的方法。本发明的目标迄今为止还从未实现过。
为实现以上目标，本发明的发明人深入研究，结果开发出一种在细胞培养系统中生产HCV病毒颗粒的方法。即，本发明如下所述。
一种复制子RNA，其包含的核苷酸序列含有基因型2a丙型肝炎病毒基因组RNA的5′非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3′非翻译区，至少一种选择标记基因和/或至少一种报告基因，以及至少一种IRES序列。
在该复制子RNA中，优选核苷酸序列含在5′-3′方向为以下顺序的5′非翻译区、至少一种选择标记基因和/或至少一种报告基因，和至少一种IRES序列，以及核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3′非翻译区。
在此复制子RNA的更优选实施方案中，基因型2a丙型肝炎病毒基因组RNA是含SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的RNA。
在此复制子RNA的再更优选实施方案中，5′非翻译区含SEQ IDNO：1所示核苷酸序列，核心蛋白编码序列含SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，E1蛋白编码序列含SEQ ID NO：3所示核苷酸序列，E2蛋白编码序列含SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，NS2蛋白编码序列含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，NS3蛋白编码序列含SEQ ID NO：6所示核苷酸序列，NS4A蛋白编码序列含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列，NS4B蛋白编码序列含SEQ ID NO：8所示核苷酸序列，NS5A蛋白编码序列含SEQ ID NO：9所示核苷酸序列，NS5B蛋白编码序列含SEQ ID NO：10所示核苷酸序列，而3′非翻译区含SEQ ID NO：11所示核苷酸序列。
含以下(a)或(b)RNA的复制子RNA：
(a)含SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的RNA；或
(b)含通过缺失、置换或添加1-100个核苷酸而衍生自SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的核苷酸序列、并具有自主复制能力和病毒颗粒生产能力的RNA。
一种生产细胞的方法，其中所述细胞复制复制子RNA并生产病毒颗粒，该方法包括将上述[1]或[2]中任一项的复制子RNA导入到细胞中。
用于该方法的细胞优选为增殖性细胞。同样或否则，用于该方法的细胞优选为真核细胞。
用于该方法的真核细胞优选为人肝源细胞、人子宫颈源细胞或人胎肾源细胞。所述真核细胞更优选为Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞或293细胞。
利用上述[3]的方法可获得的细胞，其复制复制子RNA并生产病毒颗粒。
生产丙型肝炎病毒颗粒的方法，包括培养上述[4]的细胞，以使该细胞生产病毒颗粒。
利用上述[5]的方法可获得的丙型肝炎病毒颗粒。
生产丙型肝炎病毒感染细胞的方法，包括培养上述[4]的细胞，并用培养物中的病毒颗粒感染其它细胞。
通过上述[7]的方法可获得的丙型肝炎病毒感染细胞。
筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，包括在测试物质存在下培养选自以下(a)、(b)和(c)中的至少一种：
(a)上述[4]的细胞，
(b)上述[8]的丙型肝炎病毒感染细胞，和
(c)上述[6]的丙型肝炎病毒颗粒和丙型肝炎病毒允许细胞；
并检测所获培养物中的复制子RNA或病毒颗粒。
丙型肝炎疫苗，包含上述[6]的丙型肝炎病毒颗粒或其部分。
使用上述[6]的丙型肝炎病毒颗粒或其部分作为抗原生产丙型肝炎疫苗的方法。
通过使用上述[1]或[2]的复制子RNA生产用于基因治疗的嗜肝病毒载体的方法。
利用上述[12]的方法可获得的嗜肝病毒载体。
在细胞中复制和/或表达外源基因的方法，包括将编码外源基因的RNA插入到上述[1]]或[2]中任一项的复制子RNA中，并将其导入到所述细胞中。
一种细胞生产方法，其中所述细胞复制RNA并生产病毒颗粒，该方法包括将含SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的RNA导入到该细胞中。
生产丙型肝炎病毒颗粒的方法，包括将含SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的RNA导入到细胞中，并培养细胞，使该细胞生产病毒颗粒。
上述[15]或[16]的方法，其中所述细胞为增殖性细胞。
生产含外源基因的病毒载体的方法，包括将编码外源基因的RNA插入到含SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的RNA中，将其导入到细胞中，并培养细胞，使该细胞生产病毒颗粒。
抗上述[6]的丙型肝炎病毒颗粒的抗体。
在本申请要求其优先权的日本特许申请第2004-045489号的说明书和附图中的内容结合到本文中。
附图简述
图1是一幅示意图，显示了构建模板DNA的方法，该模板DNA用于制备本发明的全长HCV复制子HCV或全长HCV基因组RNA。图1的上部显示了质粒克隆pJFH1的结构，其通过将全长HCV基因组插入到T7启动子下游产生。图1的下部显示了含全长HCV基因组序列的质粒克隆pFGREP-JFH1的结构，其中含新霉素抗性基因和EMCV IRES的DNA片段插入到pJFH1的T7启动子和5′非翻译区下游。该图中显示的术语如下。T7：T7 RNA启动子，5′UTR：5′非翻译区，C：核心蛋白，E1、E2：包膜蛋白。NS2、NS3、NS4A、NS4B、4A、4B：非结构蛋白。3′UTR：3′非翻译区。AgeI、PmeI、XbaI：限制酶AgeI、PmeI和XbaI的限制性位点。GDD：对应于NS5B蛋白活性中心的氨基酸基序GDD的位点。neo：新霉素抗性基因。EMCVIRES：脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点；
图2是一幅照片，显示了RNA印迹分析的结果，其表明rJFH-1在其中已导入全长HCV基因组RNA rJFH-1的Huh7细胞中复制；
图3显示了培养基中HCV核心蛋白定量的结果。空心圆代表其中已导入rJFH1的细胞，实心圆代表其中已导入rJFH1/GND的细胞；
图4图示了HCV核心蛋白和全长HCV基因组RNA的量，以及通过蔗糖密度梯度分级分离已导入rJFH-1的Huh7细胞的培养上清液所收集的各个级分的比重。实心圆、空心圆和阴影圆分别代表HCV核心蛋白、全长HCV基因组RNA和比重。
图5是一幅照片，显示了其中已转染入全长HCV复制子RNArFGREP-JFH1的Huh7细胞的集落形成；
图6是一幅照片，显示了全长HCV复制子RNA在全长HCV复制子RNA复制型细胞克隆中的复制，其中所述克隆已通过将rFGREP-JFH1转染入Huh7细胞中建立；
图7是一幅照片，显示了使用宿主细胞的基因组DNA作为模板和新霉素抗性基因特异性引物的PCR扩增的结果，用于证实新霉素抗性基因整合入基因组DNA中。M：DNA大小标记物，P：阳性对照，N：Huh7细胞；
图8是一幅照片，显示了蛋白质印迹分析的结果，其表明核心蛋白在其中已导入全长HCV复制子RNA rFGREP-JFH1的Huh7细胞中表达；
图9是一幅照片，显示了蛋白质印迹分析的结果，其表明NS3蛋白在其中已导入全长HCV复制子RNA rFGREP-JFH1的Huh7细胞中表达；
图10是一幅照片，显示了蛋白质印迹分析的结果，其表明NS5A蛋白在其中已导入全长HCV复制子RNA rFGREP-JFH1的Huh7细胞中表达；
图11图示了HCV核心蛋白和全长HCV复制子RNA的量，以及通过蔗糖密度梯度分级分离已导入rFGREP-JFH1的Huh7细胞的培养上清液所收集的各个级分的比重。实心圆、空心圆和阴影圆分别代表HCV核心蛋白、全长HCV复制子RNA和比重；
图12是一幅照片，显示了Huh7细胞的集落形成，其中已加入全长HCV复制子RNA复制型细胞培养上清液中的病毒颗粒。
实施本发明的最佳方式
本发明如下详细阐述。
1.全长HCV复制子RNA
丙型肝炎病毒(HCV)基因组是单股正链RNA，含约9600个核苷酸。此基因组RNA含5′非翻译区(也称为5′NTR或5′UTR)、由结构区和非结构区组成的翻译区以及3′非翻译区(也称为3′NTR或3′UTR)。HCV结构蛋白在结构区中编码，多种非结构蛋白在非结构区中编码。
这样的HCV结构蛋白(core、E1蛋白和E2蛋白)和非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)如下产生：首先将翻译区翻译成单个连续的多蛋白，然后通过蛋白酶限制性切割多蛋白释放。在这些结构蛋白和非结构蛋白(即HCV的病毒蛋白)中，core是核心蛋白，E1和E2是包膜蛋白。非结构蛋白是参与病毒自身复制的蛋白，已知NS2具有金属蛋白酶活性，已知NS3具有丝氨酸蛋白酶活性(在N端侧的1/3)和解旋酶活性(在C端侧的2/3)。此外，NS4A是NS3蛋白酶活性的辅因子，已报道NS5B具有RNA依赖性RNA聚合酶活性。
本发明的发明人使用HVC基因组RNA构建了具有自主复制能力和病毒颗粒生产能力的复制子RNA。
已通过修饰HCV基因组RNA产生的具有自主复制能力的RNA在本文中叫做“复制子RNA”或“RNA复制子”。在本说明书中，源自HCV的复制子RNA还可叫做HCV-RNA复制子。含全长HCV基因组RNA的本发明复制子RNA在本文叫做“全长HCV复制子RNA”。本发明的全长HCV复制子RNA具有生产病毒颗粒的能力。
在本发明的全长HCV复制子RNA的优选实施方案中，丙型肝炎病毒优选为但不限于基因型2a丙型肝炎病毒。在本发明中，“基因型2a丙型肝炎病毒”或“基因型2a HCV”指按照Simmonds等(参见Simmonds，P.等，Hepatology，(1994)10，1321-1324页)的国际分类法鉴别为基因型2a的肝炎病毒。在本发明中，“基因型2a丙型肝炎病毒”或“基因型2a HCV”不仅包括具有天然HCV基因组RNA的病毒，而且包括具有其中天然HCV基因组序列已被人工修饰的基因组RNA的病毒。基因型2a HCV的具体实例包括JFH-1毒株(参见日本特许公开(公告)第2002-171978号)。
在本说明书中，“丙型肝炎病毒基因组RNA”指含丙型肝炎病毒单链正义RNA基因组整个区域的核苷酸序列的RNA。基因型2a丙型肝炎病毒的基因组RNA优选为但不限于含SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的RNA。
本发明全长HCV复制子的一个实施方案是包含核苷酸序列的复制子RNA，该核苷酸序列包含5′非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3′非翻译区、至少一种选择标记基因或报告基因以及至少一种IRES序列。
本发明的全长HCV复制子RNA不限于但优选包含：在5′-3′方向为以下顺序的5′非翻译区、至少一种选择标记基因或报告基因、至少一种IRES序列、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3′非翻译区。
在本申请的说明书中，“5′非翻译区”(5′NTR或5′UTR)、“核心蛋白编码序列”(核心区或C区)、“E1蛋白编码序列”(E1区)、“E2蛋白编码序列”(E2区)、“NS2蛋白编码序列”(NS2区)、“NS3蛋白编码序列”(NS3区)、“NS4A蛋白编码序列”(NS4A区)、“NS4B蛋白编码序列”(NS4B区)、“NS5A蛋白编码序列”(NS5A区)、“NS5B蛋白编码序列”(NS5B区)和“3′非翻译区”(3′NTR或3′UTR)，以及其它特定区域或位点，以包含基因型2a HCV病毒JFH-1毒株(日本特许公开(公报)第2002-171978号)基因组完整区域的全长基因组RNA(SEQ ID NO：12)为基准定义。
另外，本发明丙型肝炎病毒(HCV)基因组中的部分区域或位点可以SEQ ID NO：1-11所示序列为基准定义，SEQ ID NO：1-11是JFH-1毒株基因组RNA(SEQ ID NO：12)的部分核苷酸序列。JFH-1毒株全长基因组RNA(源自JFH-1克隆；SEQ ID NO：12)的“5′非翻译区”包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。“核心蛋白编码序列”包含SEQ IDNO：2所示核苷酸序列。“E1蛋白编码序列”包含SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。“E2蛋白编码序列”包含SEQ ID NO：4所示核苷酸序列。“NS2蛋白编码序列”包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列。“NS3蛋白编码序列”包含SEQ ID NO：6所示核苷酸序列。“NS4A蛋白编码序列”包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列。“NS4B蛋白编码序列”包含SEQ ID NO：8所示核苷酸序列。“NS5A蛋白编码序列”包含SEQ IDNO：9所示核苷酸序列。“NS5B蛋白编码序列”包含SEQ ID NO：10所示核苷酸序列。“3′非翻译区”包含SEQ ID NO：11所示核苷酸序列。
例如，HCV源RNA序列中的区域或位点可由SEQ ID NO：1-12的核苷酸序列中的核苷酸编号限定，核苷酸编号通过比对RNA序列和SEQ ID NO：1-12所示核苷酸序列来确定。在比对中，可存在空位、添加、缺失、置换等。
在本发明的更优选实施方案中，包含在全长HCV复制子RNA中的5′非翻译区、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3′非翻译区优选分别包含SEQ ID NO：1-11所示核苷酸序列。
本发明的全长HCV复制子RNA的优选实施方案为含SEQ ID NO：1-11所示核苷酸序列、至少一种标记基因和/或报告基因和至少一种IRES序列的复制子RNA。
本发明中的“选择标记基因”指赋予细胞选择能力的基因，使得只有表达该基因的细胞才可被选择。选择标记基因的一般性实例包括抗生素抗性基因。本发明中优选的选择标记基因实例包括新霉素抗性基因、胸苷激酶基因、卡那霉素抗性基因、抗硫胺素抗性基因、腺苷酰转移酶基因、Zeocin抗性基因和嘌呤霉素抗性基因。优选新霉素抗性基因和胸苷激酶基因，更优选新霉素抗性基因。但是，本发明中的选择标记基因不限于这些基因。
此外，在本发明中，“报告基因”指其编码基因产物可作为该基因表达指示剂的标记基因。报告基因的一般性实例包括催化光发射反应或显色反应的酶的结构基因。本发明中的报告基因的优选实例包括源自转座子Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因、大肠杆菌源的β-葡糖醛酸酶基因或β-半乳糖苷酶基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、得自水母的水母发光蛋白基因和分泌型胎盘碱性磷酸酶(SEAP)基因。但是，本发明中的报告基因不限于这些基因。
在全长复制子RNA中可包含以上选择标记基因和报告基因中的仅一种，或者可同时包含二者。一种或多种选择标记基因或报告基因可存在于一个全长HCV复制子RNA中。
在本发明中，“IRES序列”指内部核糖体进入位点，其允许核糖体通过结合RNA内部启动翻译。本发明中的IRES序列的优选实例包括但不限于EMCV IRES(脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点)、FMDV IRES和HCV IRES。更优选EMCV IRES和HCV IRES，EMCVIRES是最优选的序列。
本发明的全长HCV复制子RNA的再更优选实施方案是含SEQID NO：13所示核苷酸序列的RNA。此外，含在SEQ ID NO：13所示核苷酸序列中通过缺失、置换或添加1-100个核苷酸(优选1-30个，更优选1-10个，再更优选1-6个，最优选1至若干(2-5)个核苷酸)而衍生自SEQ ID NO：13所示核苷酸序列的核苷酸序列、具有自主复制能力和病毒颗粒生产能力的复制子RNA是全长HCV复制子RNA的优选实施方案，也包括在本发明范围中。
本发明的全长HCV复制子RNA还可包含编码任选外源基因的RNA，其中所述外源基因要在全长复制子RNA已导入其中的细胞中表达。编码外源基因的RNA还可连接在5′非翻译区下游，或连接在选择标记基因或报告基因的上游或下游，或连接在3′非翻译区上游。编码外源基因的RNA可插入在核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列和NS5B蛋白编码序列之间的任意位点。
当含外源基因编码RNA的全长HCV复制子RNA在已导入其的细胞中翻译时，其可表达外源基因编码的基因产物。因此，含外源基因编码RNA的全长HCV复制子RNA还可适用于在细胞中生产外源基因的基因产物。
本发明的全长HCV复制子RNA可进一步包含核酶。核酶连接在选择标记基因和/或报告基因下游，使得可通过核酶的自切割活性将选择标记基因和/或报告基因由IRES序列、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列和NS5B蛋白编码序列以及3′非翻译区上切下。
在本发明的全长HCV复制子RNA中，上述选择标记基因和/或报告基因、病毒蛋白编码序列和外源基因、核酶等被连接在一起，使得它们由全长HCV复制子RNA以正确的读框翻译。在这些序列中，全长复制子RNA编码的蛋白优选通过蛋白酶切割位点等互相连接，使得蛋白被翻译或表达为多蛋白，接着由蛋白酶切割成各个蛋白。
本发明还涉及编码本发明复制子RNA的DNA载体，优选表达载体。
在本发明中，RNA的“自主复制能力”指RNA在导入细胞中时能够自主生长。RNA的自主复制能力可通过以下方法证实，但该方法不是限制性的。用目的RNA转染Huh7细胞并培养。由所获得的培养细胞提取RNA，并使用能够特异性检测导入RNA的探针对RNA进行RNA印迹杂交。目的RNA检测证实自主复制。在本说明书实施例中有关集落形成能力实验、HCV蛋白表达验证、复制子RNA检测等的描述中阐述了证实自主复制能力的具体方法的实例。
此外，在本发明中，RNA的“病毒颗粒生产能力”指当RNA导入到细胞(例如培养细胞，如Huh7细胞)中时在细胞中产生病毒颗粒。病毒颗粒生产能力可通过例如将使用RNA特异性引物的RT-PCR法用于检测导入该RNA的细胞的培养上清液来证实。其还可通过对培养上清液进行蔗糖密度梯度法以分离病毒颗粒和通过检测HCV蛋白来证实。在本说明书实施例中有关集落形成能力实验、HCV蛋白表达验证、复制子RNA检测等的描述中阐述了具体方法的实例。
2.全长HCV复制子RNA的制备
可使用本领域技术人员已知的基因工程技术制备本发明的全长HCV复制子RNA。可使用例如但不限于JFH-1毒株作为基因型2a丙型肝炎病毒，利用以下的方法制备全长HCV复制子RNA。
首先，常规地再构建对应于JFH-1毒株基因组RNA完整区域(SEQ ID NO：12；该序列在国际DNA数据库中在检索号AB047639下)的DNA，并将其插入到RNA启动子下游，以便制备DNA克隆。本文使用的“对应于RNA的DNA”指具有通过用T(胸腺嘧啶)取代U(尿嘧啶)而来源于RNA核苷酸序列的核苷酸序列的DNA。以上RNA启动子优选包含在质粒克隆中。优选RNA启动子的实例不限于但包括T7 RNA启动子、SP6 RNA启动子和SP3 RNA启动子，特别优选T7 RNA启动子。
接着，将选择标记基因和/或报告基因以及IRES序列编码DNA插入到上述DNA克隆中。优选将选择标记基因和/或报告基因插入到5′非翻译区下游，将IRES序列插入到更下游。
随后，使用如上制备的DNA克隆作为模板，使用RNA聚合酶合成RNA。RNA合成可通过标准方法由5′非翻译区开始。当DNA克隆为质粒克隆时，可用使用限制酶由质粒克隆切下的DNA片段作为模板合成RNA。另外，优选要合成的RNA的3′端与病毒基因组RNA的3′非翻译区的末端具有相同序列，未添加或缺失其它序列。由此合成的RNA是本发明的全长HCV复制子RNA。
3.HCV颗粒的制备
可通过将如上所述制备的全长HCV复制子RNA导入细胞中，获得可复制全长HCV复制子RNA(优选持续复制(即具有复制子RNA复制能力))的重组细胞。在本说明书中，复制全长HCV复制子RNA的重组细胞被称为“全长HCV复制子RNA复制型细胞”。
全长HCV复制子RNA复制型细胞可生产病毒颗粒。生产的病毒颗粒在由HCV病毒蛋白组成的外壳中含全长HCV复制子RNA。因此，本发明的全长HCV复制子RNA复制型细胞生产的病毒颗粒是HCV颗粒。也就是说，在本发明中，可通过培养全长HCV复制子RNA复制型细胞，在细胞培养系统中制备HCV颗粒。优选地，可通过培养全长HCV复制子RNA复制型细胞，并收集在培养物(优选培养上清液)中产生的病毒颗粒，获得HCV颗粒。
或者，可利用通过将全长HCV基因组RNA导入到细胞中获得的重组细胞生产HCV颗粒。全长HCV基因组RNA在其中导入本发明的全长HCV基因组RNA(优选来源于JFH-1克隆的全长HCV基因组RNA，更优选具有SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的RNA)的细胞中高效复制。在本说明书中，复制全长HCV基因组RNA的细胞称为“全长HCV基因组RNA复制型细胞”。全长HCV基因组RNA复制型细胞可生产病毒颗粒。全长HCV基因组RNA复制型细胞生产的病毒颗粒在由HCV病毒蛋白组成的壳中包含全长HCV基因组RNA。因此，由其中导入本发明的全长HCV基因组RNA的细胞生产的病毒颗粒是HCV颗粒。不限于但优选地可通过培养其中导入来源于JFH-1克隆的全长HCV基因组RNA(例如具有SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的RNA)的细胞，在细胞培养系统中制备HCV颗粒。例如，可通过培养其中导入全长HCV基因组RNA(例如具有SEQ IDNO：12所示核苷酸序列的RNA)的细胞，并收集在培养物(优选培养上清液)中产生的病毒颗粒，获得HCV颗粒。
对于要导入上述全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA的细胞，可使用任何细胞，只要其可被传代培养。这样的细胞优选为真核细胞，更优选为人细胞，再更优选为人肝源细胞、人子宫颈源细胞或人胎肾源细胞。优选可使用增殖性细胞，包括癌细胞系、干细胞系等细胞，更优选使用Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞和293细胞等。对于这些细胞，可使用市售的细胞，这些细胞可得自细胞保藏机构，或者也可使用由任意细胞(例如癌细胞或干细胞)建立的细胞系。
可使用本领域技术人员已知的任何技术，实现将全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA导入到细胞中。这样的导入方法的实例包括电穿孔、粒子枪法、脂转染法、磷酸钙法、微注射法、DEAESepharose法等。特别优选使用电穿孔的方法。
全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA可单独导入，或者可在与其它核酸混合后导入。为改变全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA的量，同时将要导入的RNA量保持在一定水平，将需要量的要导入的全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA与由要导入RNA的细胞提取的总细胞RNA混合，以使总RNA量达到一定水平，然后混合物用于导入到细胞中。可按照使用的导入方法确定用于导入到细胞中的复制子RNA的量，其优选为1pg-100μg，更优选为10pg-10μg。
可利用在全长HCV复制子RNA中的选择标记基因或报告基因的表达，选择全长HCV复制子RNA复制型细胞。具体地说，例如，可在培养基中培养这种进行了全长HCV复制子RNA细胞导入处理的细胞，其中细胞可由于表达选择标记基因而被选择。或者，在进行全长HCV复制子RNA细胞导入处理的细胞培养后，可检测报告基因(例如荧光蛋白)的表达。
作为实例，当全长HCV复制子RNA包含新霉素抗性基因作为选择标记基因时，将用全长HCV复制子RNA进行电穿孔法的细胞接种入培养皿中。在培养12-72小时(优选16-48小时)后，以0.05mg/ml-3.0mg/ml的浓度将G418(新霉素)加入到培养皿中。优选在接种后将细胞连续培养10-40天，更优选14-28天，同时一周更换培养基两次，可通过用结晶紫染色活细胞，选择复制导入的全长HCV复制子RNA的细胞的集落。
可通过标准方法由形成的集落克隆细胞。由此获得的复制全长HCV复制子RNA的细胞克隆在本说明书中被称为“全长HCV复制子RNA复制型细胞克隆”。本发明的全长HCV复制子RNA复制型细胞包括全长HCV复制子RNA复制型细胞克隆。
对于全长HCV复制子RNA复制型细胞，可通过检测复制的全长HCV复制子RNA，确认全长HCV复制子RNA的选择标记基因或报告基因没有整合在宿主基因组DNA中，并进一步检测HCV蛋白，证实全长HCV复制子RNA在细胞或细胞克隆中的实际复制。
可按照本领域技术人员已知的任意RNA检测方法，检测已复制的全长HCV复制子RNA。例如，可通过使用全长HCV复制子RNA特异性DNA片段作为探针的RNA杂交法，检测由细胞提取的总RNA中的全长HCV复制子RNA。
而且，可通过例如但不限于对由细胞提取出的基因组DNA进行PCR，以扩增至少一部分选择标记基因或报告基因，然后确认没有扩增产物，来证实全长HCV复制子RNA中的选择标记基因或报告基因没有整合在宿主基因组DNA中。因为一般认为在证实扩增产物的细胞中选择标记基因或报告基因可能已整合入宿主基因组中，所以有可能全长HCV复制子RNA自身不复制。在此情况下，可如下所述通过检测HCV蛋白进一步证实全长HCV复制子RNA的复制。
可通过例如使抗HCV蛋白(其由导入的全长HCV复制子RNA表达)的抗体与提取的细胞蛋白反应，检测HCV蛋白。该方法可通过本领域技术人员已知的任意蛋白检测方法进行。具体地说，例如，可通过将由细胞提取出的蛋白样品印迹在硝酸纤维素膜上，使抗HCV蛋白抗体(例如抗-NS3特异性抗体或由丙型肝炎患者收集的抗血清)与硝酸纤维素膜反应，并检测抗HCV蛋白抗体，检测HCV蛋白。如果在提取的细胞蛋白中检测出HCV蛋白，则可推断该细胞复制全长HCV复制子RNA，并表达HCV蛋白。
可通过本领域技术人员已知的任意病毒检测方法，证实全长HCV复制子RNA复制型细胞或全长HCV基因组RNA复制型细胞的病毒颗粒生产能力。例如，通过蔗糖密度梯度分级分离怀疑生产病毒颗粒的细胞的培养上清液，并测定各个级分的级分密度、HCV核心蛋白浓度以及全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA的量。结果，如果核心蛋白的峰与全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA的峰一致，显示检测峰的级分的密度(例如1.18-1.20mg)小于分级分离25％NP40(聚氧乙烯(9)辛基苯基醚)处理的培养上清液所获得的等同级分的密度，则可认为细胞具有病毒颗粒生产能力。
例如可使用核心蛋白、E1蛋白或E2蛋白的抗体检测培养上清液中释放的HCV病毒颗粒。另外，可通过使用特异性引物的RT-PCR法扩增和检测培养上清液中的全长HCV复制子RNA，间接检测HCV病毒颗粒的存在。
4.用本发明的HCV颗粒感染另一细胞
本发明的HCV病毒颗粒具有感染细胞(优选HCV允许细胞)的能力。本发明还涉及生产丙型肝炎病毒感染细胞的方法，包括培养全长HCV复制子RNA复制型细胞或全长HCV基因组RNA复制型细胞，并用在由此获得的培养物(优选培养上清液)中的病毒颗粒感染另一细胞(优选HCV允许细胞)。在本发明中，HCV允许细胞指对HCV敏感的细胞，优选但不限于肝细胞或淋巴系细胞。具体地说，肝细胞包括原代肝细胞、Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞、203细胞等。淋巴系细胞包括但不限于Molt4细胞、HPB-Ma细胞、Daudi细胞等。
当用本发明的全长HCV复制子RNA复制型细胞生产的HCV颗粒感染细胞(例如HCV允许细胞)时，全长HCV复制子RNA在感染细胞中复制，病毒颗粒也在感染细胞中形成。因为用在全长HCV复制子RNA复制型细胞中产生的病毒颗粒感染的细胞表达选择标记基因和/或报告基因，所以可利用表达选择和/或检测感染细胞。通过用在本发明的全长HCV复制子RNA复制型细胞中产生的病毒颗粒感染细胞，全长HCV复制子RNA在细胞中复制，可进一步生产病毒颗粒。
更进一步，通过用在本发明的全长HCV基因组RNA复制型细胞中产生的HCV颗粒感染细胞(例如HCV允许细胞)，全长HCV基因组RNA在感染细胞中复制，病毒颗粒也在感染细胞中形成。通过用在本发明的全长HCV基因组RNA复制型细胞中产生的病毒颗粒感染细胞，全长HCV基因组RNA在细胞中复制，而且可生产病毒颗粒。
在全长HCV复制子RNA复制型细胞或全长HCV基因组RNA复制型细胞中产生的HCV病毒颗粒可感染HCV允许动物，例如黑猩猩等，并在其中诱发由HCV引起的肝炎。
5.本发明的其它实施方案
全长HCV复制子RNA在本发明的全长HCV复制子RNA复制型细胞中高效复制。另外，全长HCV基因组RNA在本发明的全长HCV基因组RNA复制型细胞中高效复制。因此，可使用本发明的全长HCV复制子RNA复制型细胞或全长HCV基因组RNA复制型细胞高效生产全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA。
在本发明中，可通过培养全长HCV复制子RNA复制型细胞，由培养物(培养细胞和/或培养基)中提取RNA，对RNA进行电泳法，并分离和纯化全长HCV复制子RNA，生产全长HCV复制子RNA。还可通过相似的方法，使用全长HCV基因组RNA复制型细胞生产全长HCV基因组RNA。通过这样的方法生产的RNA包含丙型肝炎病毒的全长基因组序列。在此情况下，可通过选择标记基因和/或报告基因和IRES序列中断丙型肝炎病毒的全长基因组序列。借助于包含所提供的丙型肝炎病毒全长基因组序列的RNA的生产方法，使得有可能更详细地分析丙型肝炎病毒基因组。
再者，本发明的全长HCV复制子RNA复制型细胞或全长HCV基因组RNA复制型细胞可适用于生产HCV蛋白。HCV蛋白可利用本领域技术人员已知的任何方法生产。例如，可通过将全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA导入到细胞中，培养重组细胞，并利用已知方法由如此获得的培养物(培养细胞和/或培养基)中收集蛋白，生产HCV蛋白。
再者，本发明的HCV病毒颗粒可具有嗜肝性。因此，可使用本发明的全长HCV复制子RNA生产嗜肝病毒载体。该病毒载体适用于基因治疗。在本发明中，通过将外源基因编码RNA整合入全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA中并将整合的RNA导入细胞中表达，外源基因可被导入到细胞中，并在细胞中复制。此外，通过制备其中全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA的E1蛋白编码序列和/或E2蛋白编码序列被其它生物物种来源病毒的外壳蛋白编码序列置换的RNA，使该RNA有可能感染不同的生物物种。还是在此情况下，外源基因整合入全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA中，这可用作在肝细胞中表达外源基因的嗜肝病毒载体。
本发明还涉及生产携带外源基因的病毒载体的方法，包括将外源基因编码RNA插入到含SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的RNA中，将其导入到细胞中，并培养细胞，以生产病毒颗粒。
本发明提供含本发明的HCV颗粒或其部分的丙型肝炎疫苗，生产含本发明的HCV颗粒或其部分的丙型肝炎疫苗的方法。
具体地说，如上制备的HCV颗粒可直接用作疫苗，或者可在利用本领域已知方法减毒或灭活后使用。例如，可通过使用柱层析、过滤、离心等纯化HCV颗粒，获得HCV疫苗母液。可由此HCV疫苗母液制备减毒活HCV疫苗或灭活HCV疫苗。可通过例如将灭活剂(如福尔马林、β-丙内酯、戊二醛等)加入到病毒悬浮液中并混合，使其与病毒反应(Appaiahgari等，Vaccine，(2004)22(27-28)，3669-3675页)，进行病毒灭活。
为生产本发明的疫苗，有可能使用其中通过使用公开已知的技术引入突变减弱或消除病原性的HCV复制子RNA。
本发明的疫苗制备成溶液或悬浮液给予。还有可能制备为适于溶解或悬浮在液体中的固体物质形式。制品可在脂质体中乳化或囊化。活性免疫原性组分如HCV颗粒经常与药物可接受的并适于活性成分的赋形剂混合。合适的赋形剂包括例如水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇及其混合物。此外，如果有需要，疫苗可包含少量的助剂(例如增湿剂或乳化剂)、pH缓冲剂和/或用于增强疫苗效力的佐剂。有效佐剂的实例包括但不限于以下物质：氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637，nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A，称为MTP-PE)和RIBI。RIBI在2％鲨烯/Tween80乳浊液中包含三种提取自细菌的组分，即单磷酰脂质A、二分枝菌酸海藻糖和细胞壁骨架(HPL+TDM+CWS)。可通过检测抗免疫原性HCV颗粒的抗体的量测定佐剂效力，其中所述抗体通过给予由HCV颗粒组成的疫苗产生。
本发明的疫苗一般胃肠外给予，例如通过注射，如皮下或肌内注射。适于其它给予途径的其它剂型包括栓剂，在某些情况下包括口服制剂。
如果有需要，可将一种或多种具有佐剂活性的上述化合物加入到HCV疫苗中。佐剂为此免疫系统的非特异性刺激因子，在宿主中增强对HCV疫苗的免疫应答。该技术领域已知佐剂的具体实例包括完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、维生素E、非离子型嵌段共聚物、胞壁酰二肽、皂苷、矿物油、植物油和Carbopol。特别适用于粘膜的佐剂包括例如大肠杆菌不耐热毒素(LT)和霍乱毒素(CT)。其它合适的佐剂包括例如氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、油乳浊液(例如Bayol(注册商标)或Marcol 52(注册商标))、皂苷或维生素E增溶物。在优选的实施方案中，本发明的疫苗包含佐剂。
例如，对于皮下、皮内、肌内和静脉内给予的注射，本发明的HCV疫苗中可包含的药物可接受的载体和稀释剂的具体实例包括稳定剂、糖类(例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、蛋白(例如白蛋白或酪蛋白)、含蛋白的物质(例如牛血清白蛋白或脱脂奶)和缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)。
用于栓剂的常规粘合剂和载体包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯。栓剂可由含0.5％-50％(优选1％-20％)活性成分的混合物配制。口服制剂可包含通常使用的赋形剂。这样的赋形剂包括例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
本发明的疫苗可以溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、延迟释放制剂或粉末剂型生产，并可包含10-95％(优选25-70％)的活性成分(病毒颗粒或其部分)。
本发明的疫苗通过适于剂型的方法并以预防和/或治疗有效量给予。剂量为0.01μg-100,000μg，这取决于要治疗的患者、患者免疫系统中的抗体形成能力和需要的保护水平。其还依赖于给予途径，例如口服、皮下、皮内、肌内、静脉内等。
该疫苗可通过单次给予程序给予，或优选通过复合给予程序给予。在复合给予程序中，在给予开始时进行1-10次单独给予，接着以维持和/或增强免疫反应所需要的间隔给予。例如，可在1-4个月后进行另一类给予，作为第二次给予。必要时，可在几个月后持续给予。给予方案至少部分地按照个体患者的需要来确定，取决于主治医师的判断。
此外，含免疫原性HCV颗粒的疫苗可与其它免疫控制剂(例如免疫球蛋白)共同给予。
HCV颗粒疫苗可通过给予健康个体，以诱发对HCV的免疫应答，用于预防性地对抗可能的新HCV感染。HCV颗粒疫苗还可通过给予感染HCV的患者并在体内诱发针对HCV的强免疫应答，用作治疗性疫苗，以清除HCV。
全长HCV复制子RNA复制型细胞或全长HCV基因组RNA复制型细胞或用在这些细胞中产生的病毒颗粒感染的丙型肝炎病毒感染细胞，可用作测试系统，用于筛选促进或抑制例如丙型肝炎病毒复制、病毒颗粒重构和病毒颗粒释放的物质(抗丙型肝炎病毒的物质)。具体地说，例如，可通过确定测试物是否促进或抑制全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA的复制或者病毒颗粒的形成或释放，在测试物存在下培养这些细胞，并检测所获培养物中的全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA或病毒颗粒，筛选促进或抑制丙型肝炎病毒生长的物质。在此情况下，可通过测定由上述细胞提取的RNA制品中的全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA的量、比率或存在情况，对培养物中的全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA进行检测。可通过检测培养上清液中HCV蛋白的量、比率或存在情况，对培养物(主要是培养上清液)中的病毒颗粒进行检测。
而且，可通过检测该培养物中的病毒颗粒，研究由HCV感染患者的血清纯化的免疫球蛋白是否可预防本发明HCV颗粒的感染。在此测试中，可使用已用本发明的HCV病毒颗粒免疫的小鼠、大鼠、兔等的血清。可使用采用部分HCV蛋白、HCV基因等进行的免疫。可以相似的方式对其它感染预防性物质进行该测试。
产生的抗本发明HCV病毒颗粒的本发明抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体。当优选多克隆抗体时，第一步用本发明的HCV颗粒免疫选定的哺乳动物(例如小鼠、兔、山羊、绵羊、马等)。由被免疫动物收集血清，并用已知方法加工。如果含针对HCV表位的多克隆抗体的血清包含针对其它抗原的抗体，则可通过免疫亲和层析纯化这些血清。生产多克隆抗血清的方法及其治疗方法是本领域已知的。可由已感染HCV的哺乳动物分离多克隆抗体。
本领域技术人员可容易地生产针对HCV表位的单克隆抗体。已知的常用方法是生产产生单克隆抗体的杂交瘤。例如，可使用在Current Protocols in Immunology(John Wiley & Sons，Inc.)中描述的方法。
可通过细胞融合或其它方法，例如用肿瘤基因DNA直接转化B淋巴细胞或用EB病毒转导，生产产生单克隆抗体的细胞系。
通过这些方法获得的单克隆抗体和多克隆抗体用于诊断、治疗和预防HCV。
使用本发明的HCV颗粒生产的抗体可与药物可接受的增溶剂、添加剂、稳定剂、缓冲剂等一起给予。可选择任何给予途径，但优选皮下、皮内和肌内给予，更优选静脉内给予。
在本发明的全长HCV复制子RNA复制型细胞或全长HCV基因组RNA复制型细胞中产生的HCV颗粒和HCV允许细胞可作为测试系统，用于筛选可刺激或抑制HCV与细胞结合的物质。具体地说，例如，可通过在测试物存在下培养本发明的全长HCV复制子RNA复制型细胞中产生的HCV颗粒和HCV允许细胞，检测所获培养物中的全长HCV复制子RNA或病毒颗粒，并确定测试物是否促进或抑制复制子RNA复制或病毒颗粒形成，筛选可促进或抑制丙型肝炎病毒生长的物质。
可按照上述技术或以下实施例对全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA进行这样的检测。上述测试系统可用于生产和评价丙型肝炎病毒感染的预防剂、治疗剂或诊断剂。
具体地说，上述本发明测试系统的应用实例包括以下几点：
(1)筛选抑制HCV生长和感染的物质
抑制HCV生长和感染的物质包括例如直接或间接影响HCV生长和感染的有机化合物、通过与HCV基因组或其互补链中的靶序列杂交而直接或间接影响HCV生长或HCV蛋白翻译的反义寡核苷酸等。
(2)评价在细胞培养物中具有抗病毒活性的各种物质
前述各种物质包括通过合理药物设计或高通量筛选获得的物质(例如纯化和分离的酶)。
(3)鉴别治疗HCV感染患者的新靶标
例如，本发明的全长HCV复制子RNA复制型细胞或全长HCV基因组RNA复制型细胞可用于鉴别可在HCV生长中起重要作用的宿主细胞蛋白。
(4)评价HCV对药物等的抗性获得能力，并鉴别与抗性相关的突变
(5)生产病毒蛋白作为抗原，用于开发、生产和评价丙型肝炎病毒感染的诊断剂和治疗剂
(6)生产病毒蛋白作为抗原，用于开发、生产和评价用于丙型肝炎病毒感染的疫苗和生产减毒HCV
(7)生产用于诊断和治疗丙型肝炎病毒感染的单克隆或多克隆抗体。
基于以下的实施例和附图将更具体地描述本发明。但本发明的技术范围不限于这些实施例。
实施例1：得自全长HCV基因组RNA的全长HCV复制子RNA的制备
(A)构建表达载体
构建质粒DNA，其中DNA(JFH-1克隆)插入到pUC19质粒中T7RNA启动子序列的下游，此DNA(JFH-1克隆)含已由暴发性肝衰竭患者中分离出的丙型肝炎病毒JFH-1毒株(基因型2a)的全长基因组cDNA。
具体地说，将通过扩增JFH-1毒株的病毒RNA所获得的RT-PCR片段克隆入pGEM-T EASY载体(Promega)中，以获得质粒pGEM1-258、pGEM44-486、pGEM317-849、pGEM617-1323、pGEM1141-2367、pGEM2285-3509、pGEM3471-4665、pGEM4547-5970、pGEM5883-7003、pGEM6950-8035、pGEM7984-8892、pGEM8680-9283、pGEM9231-9634和pGEM9594-9678(参见非特许文献6)。通过使用PCR法和限制酶，将包含在这些质粒中的病毒基因组RNA来源的cDNA连接在一起，以克隆全长病毒基因组cDNA。将T7R RNA启动子序列插入到全长病毒基因组cDNA的上游。在下文中，以此方式构建的质粒DNA称为pJFH1(图1的上部)。上述JFH-1克隆的制备已描述于特许文献1和非特许文献3。此外，JFH-1克隆的全长cDNA的核苷酸序列以检索号AB047639登记在国际DNA数据库(DDBJ/EMBL/GenBank)中。
接着，通过将EMCV-IRES(脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点)和新霉素抗性基因(neo；也称为新霉素磷酸转移酶基因)插入到pJFH1质粒DNA(图1的下部)的5′非翻译区和核心蛋白区之间，构建质粒DNA pFGREP-JFH1。该构建方法与先前的公开内容(非特许文献4)一致。此外，通过导入突变制备突变质粒克隆pJFH1/GND和pFGREP-JFH1/GND，其中所述突变将对应于RNA聚合酶(由pJFH1和pFGREP-JFH1中的NS5B区编码)活性中心的氨基酸基序GDD变为GND。因为由突变克隆pJFH1/GND和pFGREP-JFH1/GND编码的NS5B蛋白活性位点的氨基酸序列被改变，所以不能由突变克隆表达复制复制子RNA所需的活性NS5B蛋白。
此外，通过将荧光素酶基因插入到pFGREP-JFH1的第415-420的MluI位点和第2075-2082的PmeI位点之间，以用荧光素酶基因替代pFGREP-JFH1的新霉素抗性基因，制备pFGREP-JFH1/Luc，作为导入报告基因的表达载体。另外，通过将pFGREP-JFH1/Luc第10933位的G突变为A，制备突变体pFGREP-JFH1/Luc/GND，其中NS5bRNA聚合酶活性中心的GDD基序被变为GND。
通过将绿色荧光蛋白基因插入到pFGREP-JFH1的第415-420的MluI位点和第1142-1149的PmeI位点之间，制备pFGREP-JFH1/EGFP，其中pFGREP-JFH1的新霉素抗性基因被绿色荧光蛋白基因取代。另外，通过将pFGREP-JFH1/EGFP第10000位的G突变为A，制备突变体pFGREP-JFH1/EGFP/GND，其中NS5b RNA聚合酶活性中心的GDD基序被变为GND。
通过将分泌型胎盘碱性磷酸酶基因插入到pFGREP-JFH1的第415-420的MluI位点和第1982-1989的PmeI位点之间，以用分泌型胎盘碱性磷酸酶基因取代pFGREP-JFH1的新霉素抗性基因，制备pFGREP-JFH1/SEAP。另外，通过将pFGREP-JFH1/SEAP第10840位的G突变为A，制备突变体pFGREP-JFH1/SEAP/GND，其中NS5bRNA聚合酶活性中心的GDD基序被变为GND。
(B)全长HCV基因组RNA和全长HCV复制子RNA的制备
如上构建表达载体，用限制酶XbaI消化pJFH1、pJFH1/GND、pFGREP-JFH1和pFGREP-JFH1/GND，以制备模板DNA，用于合成全长HCV基因组RNA和全长HCV复制子RNA。随后，通过于30℃温育30分钟，用20U绿豆核酸酶的50μl反应溶液处理10-20μg各XbaI片段。绿豆核酸酶是这样一种酶：其催化涉及选择性消化双链DNA的单链部分的反应。通常，如果使用以上XbaI片段原样作为模板合成RNA，则合成在3′端具有4个额外碱基CUGA的复制子RNA，其为XbaI识别位点的一部分。因此，在该实施例中，通过用绿豆核酸酶处理XbaI片段，由XbaI片段去除4碱基CUGA。随后，对绿豆核酸酶处理后的含XbaI片段的溶液进行标准蛋白去除处理，以获得无4碱基CUGA的纯化XbaI片段，作为以下使用的模板DNA。
接着，使用T7 RNA聚合酶由该模板体外合成RNA。使用MEGAscript(Ambion Co.)进行RNA合成。按照生产商的说明书使20μl含0.5-1.0μg模板DNA的反应混合物反应。
在RNA合成后，将DNA酶(2U)加入到反应混合物中，于37℃反应15分钟，然后用酸-苯酚处理提取RNA，以去除模板DNA。以此方式由源自pJFH1、pJFH1/GND、pFGREP-JFH1和pFGREP-JFH1/GND的模板DNA合成的RNA分别称为rJFH1、rJFH1/GND、rFGREP-JFH1和rFGREP-JFH1/GND。这些RNA的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：12、13、14和15的rJFH-1、rFGREP-JFH1、rJFH1/GND和rFGREP-JFH1/GND。rJFH1是本发明全长HCV基因组RNA的实例，与JFH-1毒株的全长HCV基因组具有相同的序列结构。rFGREP-JFH1是本发明全长HCV复制子RNA的实例。
随后，通过分别使用如上制备的表达载体pFGREP-JFH1/Luc、pFGREP-JFH1/Luc/GND、pFGREP-JFH1/EGFP、pFGREP-JFH1/EGFP/GND、pFGREP-JFH1/SEAP和pFGREP-JFH1/SEAP/GND作为模板，生产为HCV复制子RNA的rFGR-JFH1/Luc(SEQ ID NO：21)、rFGR-JFH1/Luc/GND((SEQ ID NO：22)、rFGR-JFH1/EGFP(SEQID NO：23)、rFGR-JFH1/EGFP/GND(SEQ ID NO：24)、rFGR-JFH1/SEAP(SEQ ID NO：25)和rFGR-JFH1/SEAP/GND(SEQ ID NO：26)。
实施例2：全长HCV基因组RNA在细胞中的复制和病毒颗粒的产生
(C)全长HCV基因组RNA在细胞中的复制和病毒颗粒的产生
将如上合成的各种量的全长HCV基因组RNA(rJFH1或rJFH1/GND)与由Huh7细胞提取的总RNA混合，使RNA量达到10μg。随后，利用电穿孔法将混合的RNA导入到Huh7细胞中。将进行电穿孔处理的Huh7细胞接种入培养皿中。在温育12、24、48和72小时后，收集细胞，提取RNA，并通过RNA印迹法分析。按照Molecular Cloning，A laboratory Manual，第2版，J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)进行RNA印迹分析。具体地说，对由温育后细胞提取的RNA进行变性琼脂糖凝胶电泳，并在电泳后将RNA转移至带正电荷的尼龙膜上。使由pJFH1制备的32P标记DNA或RNA探针与前述转移至膜上的RNA杂交。漂洗膜，并使膜对胶片曝光，以检测对JFH-1克隆的全长HCV基因组RNA特异性的RNA条带。
如图2所示，当rJFH1/GND转染至细胞中时，在转染后4小时导入RNA的条带被证实为弱信号，但信号随着传代次数变得更弱，转染后24小时的条带信号几乎不可检测。相比之下，当转染rJFH1时，导入RNA条带的信号强度首先变弱，和rJFH1/GND转染后4-12小时的情况一样，但在转染后24小时证实了清晰的RNA信号。证实的信号是HCV基因组RNA特异性的。也就是说，一般认为某些导入的全长HCV基因组RNA复制并生长。对于其中为RNA复制酶的NS5B活性基序突变的rJFH1/GND，未观察到复制，这表明NS5B活性对全长HCV基因组RNA复制很重要。此外，对得自丙型肝炎病毒，例如H77毒株(非特许文献7)、J6毒株(非特许文献8)和本发明发明人由慢性肝炎患者分离的JCH1毒株(非特许文献6)的全长基因组RNA(先前已全部被分离)进行相同的实验，但证实这些毒株的全长HCV基因组RNA未复制。
(D)转染细胞培养物的培养基中HCV病毒颗粒的检测
将如上所述的电穿孔处理的Huh7细胞接种在培养皿中，培养12、24、48和72小时，然后检测培养上清液中的HCV核心蛋白。按照Ortho HCV抗原IRMA检验(非特许文献9)进行检测。如图3所示，在用rJFH1转染后48和72小时检测培养上清液中的核心蛋白。为检验此核心蛋白是否作为病毒颗粒被分泌，通过蔗糖密度梯度分级分离rJFH1转染后72小时的培养基。在离心管中，2ml 60％(重量/重量)蔗糖溶液(溶解在50mM Tris pH 7.5/0.1M NaCl/lmM EDTA中)、1ml 50％蔗糖溶液、1ml 40％蔗糖溶液、1ml 30％蔗糖溶液、1mlof 20％蔗糖溶液和1ml 10％蔗糖溶液分层，4ml样品培养上清液覆盖于其上。在Beckman转子SW41 Ti中以400,000 RPM于4℃离心16小时。在离心后，由管底部收集各0.5ml的级分。测定各个级分中的密度、HCV核心蛋白浓度和全长HCV基因组RNA的量。按照Takeuchi T，Katsume A，Tanaka T，Abe A，Inoue K，Tsukiyama-KoharaK，Kawaguchi R，Tanaka S，Kohara M，“Real-Time detection system forquantification of Hepatitis C virus genome”，Gastroenterology 116：636-642(1999)，通过检测全长HCV基因组RNA的5′非翻译区的RNA，用定量RT-PCR法进行全长HCV基因组RNA的检测。具体地说，使用合成引物R6-130-S17：5′-CGGGAGAGCCATAGTGG-3′(SEQ IDNO：16)、R6-290-R19：5′-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3′(SEQ ID NO：17)和TaqMan探针：R6-148-S21FT，5′-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3′(SEQ ID NO：18)以及EZ rTthRNA PCR试剂盒，PCR扩增由细胞提取的RNA中包含的全长HCV基因组RNA，然后通过ABI Prism 7700序列检测系统检测。
如图4所示，在级分11中核心蛋白的峰与全长HCV基因组RNA的峰一致。该级分的密度约为1.18mg/ml，其表明比重比迄今为止所报道的核心蛋白和核酸缀合物的比重低。此外，当在用0.25％NP40处理培养上清液后进行相似的分级分离时，核心蛋白和全长HCV基因组RNA的峰迁移至约1.28mg/ml的比重。也就是说，一般认为NP40处理剥落了病毒颗粒的表面膜(其含脂质，于是具有较低比重)，产生仅由核酸和核心蛋白组成的核心颗粒，因此比重增加。以上结果表明，通过将rJFH1转染至Huh7细胞中，全长HCV基因组RNA在细胞中复制，结果形成病毒颗粒，并分泌入培养上清液中。
实施例3
(E)全长HCV复制子RNA复制型细胞的制备和细胞克隆的建立
通过如实施例2所述，将实施例1中制备的rFGREP-JFH1和rFGREP-JFH1/GND转染入Huh7细胞，制备全长HCV复制子RNA复制型细胞，然后尝试建立全长HCV复制子RNA复制型细胞克隆。
首先，在分别将rFGREP-JFH1和rFGREP-JFH1/GND转染入Huh7细胞中后，将细胞接种在培养皿中。在培养16-24小时后，加入不同浓度的G418。继续培养，同时每周更换两次培养基。在培养21天后，用结晶紫染色存活细胞。计数染色的集落，计算获得的集落数/用于转染的RNA重量。对于某些培养皿又继续培养，以克隆存活细胞的集落。分别由克隆细胞中提取RNA、基因组DNA和蛋白，然后检测全长HCV复制子RNA，研究新霉素抗性基因在基因组DNA中的整合以及HCV蛋白的表达。这些结果在下文详细给出。
(F)集落形成能力
以上转染的结果表明，对于在1.0mg/ml G418浓度下用rFGREP-JFH1转染的Huh7细胞(图5的左部)，集落形成能力/1μg用于转染的复制子RNA是368 CFU(集落形成单位)/μg RNA。相反，对于用rFGREP-JFH1/GND转染的Huh7细胞(图5的右部)，未观测到集落形成。这表明，用rFGREP-JFH1复制子RNA转染的Huh7细胞的集落形成能力依赖于由rFGREP-JFH1表达的NS5B(RNA聚合酶)的活性。也就是说，一般认为在集落形成细胞中，借助于由rFGREP-JFH1表达的NS5B的作用，rFGREP-JFH1复制子RNA自主复制，引起新霉素抗性基因持续表达，因此保持了G418抗性，结果使细胞生长成为可能。
(G)在已建立细胞克隆中的全长HCV复制子RNA的检测
利用酸-苯酚提取法，由全长HCV复制子RNA复制型细胞克隆中提取总RNA，该细胞按照以上章节(E)通过将rFGREP-JFH1转染入Huh7细胞中而建立。随后，利用RNA印迹法检测此总RNA。在该方法中，使用pFGREP-JFH1特异性探针。以相似的方式由未转染的Huh7细胞提取的总RNA(在图6中显示为“Huh7”)，一个除由Huh7细胞提取的总RNA以外还含体外合成的107个拷贝的复制子RNA的样品(在图6中显示为“107”)和一个除由Huh7细胞提取的总RNA以外还含体外合成的108个拷贝的复制子RNA的样品(在图6中显示为“108”)用作对照。在图6中，1-4表示细胞克隆号。
结果，用rFGREP-JFH1特异性探针检测与rFGREP-JFH1具有相似大小的RNA(图6)。由该结果证实转染的rFGREP-JFH1复制子RNA在细胞克隆中复制和生长。还表明细胞克隆中的复制子RNA的量有差异。如图6所示，例如，克隆2中的复制子RNA的量少于其它克隆。
(H)验证新霉素抗性基因有无整合入基因组DNA中
对于按照(E)所获得的细胞克隆1-8(如图7中的FGR-JFH1/2-1至FGR-JFH1/2-8所示)，使用新霉素抗性基因特异性引物(有义引物NEO-S3：5′-AACAAGATGGATTGCACGCA-3′(SEQ ID NO：19)，反义引物NEO-R：5′-CGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3′(SEQ ID NO：20))，并使用由每个细胞克隆提取的宿主基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，以便证实各个细胞克隆抗G418的抗性并非是由于新霉素抗性基因整合入宿主细胞基因组中。结果，如图7所示，未观测到显示扩增新霉素抗性基因的阳性克隆。
(H)的结果证实，全长HCV复制子RNA在通过本发明的全长HCV复制子RNA转染建立的细胞克隆中复制。
(I)HCV蛋白的检测
通过标准方法由通过rFGREP-JFH1转染建立的细胞克隆提取蛋白，然后通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析。在此情况下检测的细胞克隆与以上章节(G)中使用的克隆相同。通过将制备的全长HCV基因组RNA瞬时转染入Huh7细胞中获得细胞提取物，将其用作阳性对照(在图8、9和10中显示为JFH-1)。通过转染HCV亚基因组RNA复制子(SGR-JFH1)获得的克隆的细胞提取物用作核心蛋白的阴性对照，并用作NS3和NS5a蛋白的阳性对照(在图8、9和10中显示为SGR-JFH1)。未转染的Huh7细胞的细胞提取物用作所有蛋白的阴性对照(在图8、9和10中显示为Huh7)。将由各个细胞克隆提取的蛋白样品印迹在PVDF膜(Immobilon-P，Millipore)上，然后使用抗核心蛋白特异性抗体和抗NS3特异性抗体(由Dr.Moradpour惠赠；Wolk B等，J.Virology，2000，74：2293-2304)检测由其中的全长HCV复制子RNA编码的核心蛋白和NS3蛋白。如图8和9所示，对于通过rFGREP-JFH1转染建立的细胞克隆1-4，检测各个蛋白中与阳性对照大小相同的蛋白。因为在未转染Huh7细胞中既没有检测到核心蛋白，也没有检测到NS3蛋白，所以证实在细胞克隆1-4中已转染的全长HCV复制子RNA自主复制，表达核心蛋白和NS3蛋白。
此外，对于每个细胞克隆，已如上所述检验NS3蛋白的表达，还使用丙型肝炎患者的血清作为抗体检验由全长HCV复制子RNA表达的NS5A蛋白(图10)。
由上述(H)和(I)的结果证实，在已通过全长HCV复制子RNA转染建立的细胞克隆中，全长HCV复制子RNA复制，病毒蛋白也表达。
(J)全长HCV复制子RNA复制型细胞中的病毒颗粒生产
按照以上章节(E)将rFGREP-JFH1转染入Huh7细胞中，建立全长HCV复制子RNA复制型细胞克隆2和3(FGR-JFH1/2-3)，然后回收其培养上清液。按照与上述(D)相似的方法检测培养上清液中的HCV病毒颗粒。结果示于图11。在图11中，阴影圆代表各个级分的比重(g/ml)。实心圆代表核心蛋白的量(fmol/L)。空心圆代表全长HCV复制子RNA的滴度(×0.1拷贝/mL)。
如图11所示，核心蛋白峰与比重约1.18-1.20mg/ml的级分中的全长HCV复制子RNA的峰一致。还在较轻级分中发现小峰。以上结果表明，全长HCV复制子RNA在用rFGREP-JFH11转染的Huh7细胞中复制，形成病毒颗粒并分泌入其培养上清液中。
实施例4
(K)采用培养上清液中的病毒颗粒的感染实验
通过将在(H)中使用的细胞克隆1-8(即FGR-JFH1/2-1、FGR-JFH1/2-2、FGR-JFH1/2-3、FGR-JFH1/2-4、FGR-JFH1/2-5、FGR-JFH1/2-6、FGR-JFH1/2-7、FGR-JFH1/2-8)的各个培养上清液加入Huh7细胞中，用在培养上清液中的病毒颗粒感染Huh7细胞。在第2天，以0.3mg/ml向感染的Huh7细胞的培养基中加入G418，再培养Huh7细胞21天。在结束培养后，固定细胞，并用结晶紫染色。对于分别用FGR-JFH1/2-3、FGR-JFH1/2-5和FGR-JFH1/2-6的培养上清液感染的细胞，观测到集落形成。另一方面，对于用作对照的亚基因组复制子细胞SGR-JFH1/4-1(描述于非特许文献6)的培养上清液感染的细胞，未观测到集落形成。图12显示了与加入的4ml或8mlFGR-JFH1/2-3或SGR-JFH1/4-1培养上清液培养21天后染色培养皿的照片。在其中接种与4ml或8ml FGR-JFH1/2-3培养上清液混合的细胞的培养皿中，分别发现3个和9个集落。但是，在其中接种与SGR-JFH1/4-1的培养上清液混合的细胞的培养皿中，未观测到集落。
随后，克隆分别使用FGR-JFH1/2-3和FGR-JFH1/2-5的培养上清液以丙型肝炎病毒感染形成的集落。由用FGR-JFH1/2-3的培养上清液感染的培养皿建立3个克隆FGR-JFH1/C2-3-11、FGR-JFH1/C2-3-12和FGR-JFH1/C2-3-13，并由用FGR-JFH1/C2-5的培养上清液感染的培养皿建立2个克隆FGR-JFH1/C2-5-11和FGR-JFH1/C2-5-12。
当用FGR-JFH1/C2-3-11、FGR-JFH1/C2-3-12、FGR-JFH1/C2-3-13、FGR-JFH1/C2-5-11和FGR-JFH1/C2-5-12各个细胞克隆的培养上清液感染Huh7细胞时，在分别用FGR-JFH1/C2-3-12和FGR-JFH1/C2-5-12的培养上清液感染的培养皿中观测到集落形成。由用FGR-JFH1/C2-3-12的培养上清液感染的细胞建立另两个克隆FGR-JFH1/C2-3-12-1和FGR-JFH1/C2-3-12-2。由用FGR-JFH1/C2-5-12的培养上清液感染的细胞建立另两个克隆FGR-JFH1/C2-5-12-1和FGR-JFH1/C2-5-12-2。
已用全长HCV复制子RNA复制型细胞的培养上清液感染的细胞建立细胞，由这些细胞克隆提取RNA、蛋白和基因组DNA。通过使用基因组DNA作为模板的PCR，检验新霉素抗性基因在这些细胞克隆的基因组DNA中的整合，结果全为阴性。而且，通过使用RNA作为模板的定量PCR可检测细胞中复制的全长HCV复制子RNA。再进一步，可检测培养上清液中的核心蛋白。这些结果表明，由本发明的全长HCV复制子RNA复制型细胞生产的含全长HCV复制子RNA的病毒颗粒可感染另一细胞。
工业实用性
按照本发明的方法，可在细胞培养系统中制备HCV病毒颗粒。使用本发明的复制子RNA，可在细胞培养系统中有效生产含全长HCV基因组RNA的RNA。而且，通过使用其中导入本发明的全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA的细胞，全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA可在细胞培养系统中复制，本发明的HCV病毒颗粒可在细胞培养系统中连续生产。其中导入本发明的全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA的细胞还可用作测试系统，用于筛选影响HCV复制过程、病毒颗粒形成过程和病毒颗粒胞外释放过程的各种物质。本发明的全长HCV复制子RNA和全长HCV基因组RNA以及病毒颗粒还用作外源基因的病毒载体。本发明的病毒颗粒或其部分可包含在疫苗中，作为抗丙型肝炎病毒的疫苗抗原。此外，其中本发明的病毒颗粒和其它细胞一起培养的系统可用作测试系统，用于筛选对病毒颗粒感染细胞有影响的各种物质。本发明的全长HCV复制子RNA或全长HCV基因组RNA用作模板，该模板能使HCV全长基因组序列简单再生。
本文提及的所有出版物、特许和特许申请都全文在此引入作为参考。
无内容序列表
SEQ ID NO：1代表来自JFH-1克隆的HCV基因组RNA的5′非翻译区序列。
SEQ ID NO：2代表来自JFH-1克隆的HCV基因组RNA的核心蛋白编码序列。
SEQ ID NO：3代表来自JFH-1克隆的HCV基因组RNA的E1蛋白编码序列。
SEQ ID NO：4代表来自JFH-1克隆的HCV基因组RNA的E2蛋白编码序列。
SEQ ID NO：5代表来自JFH-1克隆的HCV基因组RNA的NS2蛋白编码序列。
SEQ ID NO：6代表来自JFH-1克隆的HCV基因组RNA的NS3蛋白编码序列。
SEQ ID NO：7代表来自JFH-1克隆的HCV基因组RNA的NS4A蛋白编码序列。
SEQ ID NO：8代表来自JFH-1克隆的HCV基因组RNA的NS4B蛋白编码序列。
SEQ ID NO：9代表来自JFH-1克隆的HCV基因组RNA的NS5A蛋白编码序列。
SEQ ID NO：10代表来自JFH-1克隆的HCV基因组RNA的NS5B蛋白编码序列。
SEQ ID NO：11代表来自JFH-1克隆的HCV基因组RNA的3′非翻译区序列。
SEQ ID NO：12代表来自JFH-1克隆的全长HCV基因组RNA序列。
SEQ ID NO：13代表包含来自JFH-1克隆的全长HCV基因组RNA的复制子RNA序列。
SEQ ID NO：14代表来自JFH-1克隆的全长HCV基因组RNA序列，其中氨基酸基序GDD已突变为GND。
SEQ ID NO：15代表包含来自JFH-1克隆的全长HCV基因组RNA的复制子RNA序列，其中氨基酸基序GDD已突变为GND。
SEQ ID NO：16-20代表引物序列。
SEQ ID NO：21代表来源于表达载体pFGREP-JFH1/Luc的复制子RNA的序列。
SEQ ID NO：22代表来源于表达载体pFGREP-JFH1/Luc/GND的复制子RNA的序列。
SEQ ID NO：23代表来源于表达载体pFGREP-JFH1/EGFP的复制子RNA的序列。
SEQ ID NO：24代表来源于表达载体pFGREP-JFH1/EGFP/GND的复制子RNA的序列。
SEQ ID NO：25代表来源于表达载体pFGREP-JFH1/SEAP的复制子RNA的序列。
SEQ ID NO：26代表来源于表达载体pFGREP-JFH1/SEAP/GND的复制子RNA的序列。