技术领域
本发明涉及病毒的生产方法。
背景技术
近年，人们开始担心BSE(牛绵状脑病)以及禽流感等人畜共患 传染病的危险性。且主要使用从动物提取的原料或材料的产品(例如， 疫苗、血液制剂、细胞培养/转基因制剂、细胞组织医疗品等)中混入 感染因子的危险性高，除了无法否定含有未知的感染因子之外，还存 在对感染因子的钝化处理等有限度等问题。作为关于此类问题的对策 有如日本通过2003年度药事法的改正中重新设定叫“生物提取物”的 概念等依法强化的对策，需要开发完全不含来源于动物的物质的医药 品。
为获得不需要血清的培养条件，各培养基厂家进行销售无血清培 养基等的各种尝试，但在使用无血清培养基、及作为培养粘性细胞载 体，通过在担体表面附带适当的电荷以粘附细胞的微载体的培养方法 中，存在向微载体的粘附率低无法高效率大量培养细胞的问题。因此， 在现有的这种培养条件下，如非专利文献1所记载，使用的是被改性 猪胶原蛋白覆盖的微载体等含来源于动物的物质。
另在专利文献1中公开了一种对细胞的粘附/增生性高、即使使用 无血清培养基也可得到与含血清培养基相同以上的粘附/增生性的动物 细胞培养用颗粒。但在专利文献1中，虽公开了细胞培养在无血清条 件下的高效率培养，却未记载病毒的接种以及增生方法等病毒的生产 条件。
另，专利文献2中，公开了包括，获得类似Vero细胞的脊椎动物 细胞培养，单在(不含血清或非血清蛋白)无蛋白培养基中将细胞增 生，向该培养感染病毒后，对其进行培育在培养基中增生，生产含病 毒培养基的工序的病毒生产方法，及作为强化病毒活性物质使用来源 于原核生物的蛋白酶。在专利文献2中记载了根据该方法所得的病毒 不含来源于人或动物的各种夹杂化合物或病源性物质的蛋白。但在实 施例中，作为增强病毒活性的物质使用了动物提取胰蛋白酶。
另在专利文献3中公开了不使用天然蛋白质而使用细胞粘附性高 的细胞粘附载体的病毒感染昆虫细胞的生产方法。该生产方法的特征 是，使用细胞粘附性人工肽及/或细胞粘附辅助人工肽，粘附变温动物 提取细胞及基材，使用该细胞粘附基材进行细胞培养的病毒感染昆虫 细胞的生产方法。在专利文献3中记载了因基材不使用天然蛋白质， 所以没有含人传染性病毒等感染物质的危险，具有很高的安全性。但 并没有公开有关不含来源于动物的物质的细胞分散剂以及恒温动物提 取的粘性细胞。另一方面，在非专利文献1中的细胞继代中，作为细 胞分散剂使用了动物提取的蛋白酶(例如，猪提取的胰蛋白酶等)。
专利文献1；特开2003-189848号公报
专利文献2：特许3158157号公报(WO96/15231号册子)
专利文献3：特开2003-210166号公报
非专利文献1： Otfried Kistner et al.“Development of a Novel MammalianCell(Vero)Derived influenza Vaccine”Poster Presented at： Options for Control of influenza V，Okinawa，Japan，October 7-11，2003
发明内容
因此，本发明的目的在于，在粘性细胞的培养和利用该细胞培养 的病毒工业性生产的工序中，提供一种完全不含来源于动物的物质， 且安全有效的病毒生产方法。
经过对上述问题的深刻探讨，通过使用不含来源于动物的物质的 培养材料开发出安全有效的病毒生产方法，从而完成了本发明。
本发明的病毒生产方法的特征在于以向具有1个分子中至少有一 个细胞粘附性最小氨基酸序列(X)的聚肽(P)且不含来源于动物的 物质的载体粘接粘性细胞、在不合来源于动物的物质的培养基中培养 该粘性细胞，使用不含来源于动物的物质的细胞分散剂对培养的粘性 细胞进行继代培养后，将病毒接种到粘性细胞的培养细胞而增生为要 点。
本发明的病毒生产方法可安全有效地生产病毒。所以本发明的方 法适用于疫苗的生产。
附图说明
图1为实施例1及比较例1～3中的细胞密度随时间变化的趋势图。
图2为实施例1及比较例1～3中的通过ELISA的病毒生产量随时 间变化的趋势图。
图3为实施例1及比较例1～3中的通过HA的病毒生产量随时间 变化的趋势图。
具体实施方式
在本发明中，“不含来源于动物的物质”是指不含恒温动物尤其是 哺乳类(例如，人、牛、猪、狗、兔、猫等)、鸟类、鱼类等的来源于 动物的物质。
另外，本发明中的粘性细胞，只要是能在固体表面粘附增生，可 增生病毒的恒温动物提取的细胞即可，无特殊限制，例如有上皮细胞 (Vero细胞、MDCK细胞、CHO细胞、HEK293细胞、COS细胞等)、 肿瘤细胞(Hela细胞、VACO细胞等)、内皮细胞(HUVEC细胞、DBAE 细胞等)、白血球(HIT-T15细胞等)、纤维芽细胞(WI38细胞、BHK21 细胞、SFME细胞等)、肌肉细胞(HL1细胞、C2C12细胞等)、神经/ 内分泌腺细胞(ROC-1细胞、IMR-32细胞等)以及初代细胞(鸡 胚初代细胞、鹑胚初代细胞及兔肾初代细胞等)等。其中优选为，上 皮细胞及初代细胞，更优选为Vero细胞、MDCK细胞及初代细胞、特 优选为Vero细胞及MDCK细胞、最优选为Vero细胞。
另，本发明的接种于粘性细胞的病毒例如包括，黄病毒科 (Flaviviridae){例如，黄热病病毒(Yellow fever virus)、日本脑炎病 毒(Japanese encephalitis virus)等}、C型肝炎病毒(hepatitis Cvirus) 及登革热病毒(Dengue fever virus)等)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae) {流感病毒(Influenza virus)等}、腺病毒科(Adenoviridae){人类腺病 毒1-34型(Human adenovirus 1-34)等}、疱疹病毒科(Herpesviridae) {单纯疱疹病毒I型(Herpes simplex I)、单纯疱疹病毒II型(Herpes simplex II)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus)、水痘-带疱疹病毒 (Varicella-zoster virus)及人类巨细胞病毒(Human cytomegalovirus) 等}、小核糖核酸病毒科(Picomaviridae){口蹄疫病毒属O型 (Aphthovirus O)、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)、脊髓灰 质炎病毒(Poliovirus)及A型肝炎病毒(Hepatitis A virus)等}、副黏 液病毒科(Paramyxoviridae){麻疹病毒(Measles virus)、腮腺炎病毒 (Mumps virus)及仙台病毒(Sendai virus)等}、披膜病毒科 (Togaviridae){风疹病毒(Rubella virus)及脑炎病毒(Encephalitis virus) 等}、痘病毒科(Poxviridae){[痘苗病毒(Vaccinia virus)、天花病毒(Variola virus)、牛痘病毒(Cowpox virus)以及猴痘病毒(Monkeypox virus) 等]、逆转录病毒科(Retroviridae){人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)及人嗜T淋巴细胞病毒(Human T-lymphotropic virus)等}、以及冠状病毒科(Coronaviridae){禽传染 性支气管炎病毒(Avian infections bronchitis virus)等}等{生化学辞典(第 2版)、东京化学同人1997年9月11日发行}。其中优选为，属于黄病 毒科，正粘病毒科、腺病毒科、疱疹病毒科、小核糖核酸病毒科、副 黏液病毒科、披膜病毒科以及痘病毒科的病毒。更优选为属于黄病毒 科，正粘病毒科、副黏液病毒科以及披膜病毒科的病毒，最优选为正 粘病毒科的病毒。
本发明使用的不含来源于动物的物质的培养材料(例如，培养基、 细胞分散剂、粘接粘性细胞时所需的载体等)因不含来源于动物的物 质、所以可最低限度控制因外来性物质的污染可能性，不含未知感染 性因子，并且感染性因子混入的危险性低，因此具有无需进行钝化感 染因子处理的优点。下面对不含来源于动物的物质的培养材料进行详 细说明。
用于粘性细胞的培养或病毒生产的培养基，只要不含来源于动物 的物质的血清或蛋白质(以下称为，无血清培养基)则，并无特别的 限定，例如有市售的无血清培养基{OPTIPROTMSFM培养基(Invitrogen 制造)、VP-SFM(Invitrogen制造)以及EX-CELL525(JRH Bioscience 制造等)}、基础培养基{Eagle’s MEM培养基、Dulbecco′s Modified Eagle Media(D-MEM)培养基、Iscove培养基、RPMI1640培养基、Ham’s F10 培养基、Ham’s F12培养基、MCDB105培养基、MCDB110培养基、 MCDB13 1培养基、MCDB151培养基、MCDB153培养基、MCDB201 培养基、MCDB302培养基以及MEDIUM199等}及它们的混和培养基 等。其中从培养基的调制看，优选为市售的无血清培养基，更优选为 OPTIPROTMSFM培养基、VP-SFM及EX-CELL525，特优选为VP-SFM 及EX-CELL525，再优选为VP-SFM。该VP-SFM培养基适用于增生 病毒时利用的Vero、COS-7、MDCK、BHK-21、HEp-2等细胞类的培 养。无血清培养基中作为非动物提取添加物适量添加转基因微生物提 取的激素(胰岛素以及氢化可的松)、细胞增生因子(上皮增生因子 (EGF)、血小板提取增生因子(PDGF)以及纤维芽细胞增生)因子 (FGF)等)以及抗菌剂(卡那霉素等)等，可以稳定提高细胞的增生 性。
载体的材料只要是可粘接粘性细胞的材料即可，没有特别限定。 但从细胞毒性的观点等看，优选由以下物质为主要成分。
(1)合成高分子：乙烯树脂、聚乙烯、聚胺脂、环氧树脂、酰胺 纤维以及聚碳酸酯等。
(2)天然高分子：纤维素、纤维素衍生物(二乙酸基纤维素以及
三乙酸基纤维素等)、以及葡聚糖等。
(3)无机物：氧化铝、羟磷灰石、氧化肽、二氧化硅以及玻璃等。
其中优选为合成高分子、天然高分子以及羟磷灰石，更优选为合 成高分子、天然高分子，特优选为合成高分子、最优选为乙烯树脂以 及酰胺纤维。
乙烯树脂有以乙烯单体{丙烯酸单体、烯以及苯乙烯等}以及根 据需要以多官能单体为构成单位的聚合物{聚苯乙烯、架桥聚苯乙烯、 聚(甲基)丙烯酸甲酯、聚(甲基)丙烯酰胺、聚丙烯酰胺架桥体(丙 烯酰胺与乙二醇二丙烯酸酯的共聚物等)以及聚(甲基)丙烯腈等} 等。其中优选为以苯乙烯为必需构成单位的树脂，更优选为架桥苯乙 烯。
多官能单体包括二乙烯苯、乙二醇(甲基)丙烯酸酯、三乙烯苯 以及三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯等。
载体的形状没有特殊限制，只要是可以粘接粘性细胞的形状即可。 板(plate)、培养皿、T-烧瓶、细胞培养滚瓶(roller bottle)、微载体、 空心光纤(hollow fiber)、薄片(胶片、泡沫(海绵)以及布等)、以 及凝胶体等的任意一种都可以。其中，从培养量来看优选为培养皿、T -烧瓶、细胞培养滚瓶(roller bottle)、微载体、空心光纤(hollow fiber)， 更优选为细胞培养滚瓶(roller bottle)、微载体、空心光纤(hollow fiber)， 特优选为微载体、及空心光纤(hollow fiber)、最优选为微载体。
微载体的形式有实心型和多孔型，两者都可使用。但从向细胞提 供营养或氧的效率或细胞的回收率等观点出发，优选为实心型。另微 载体的形状可以是球状以及扁平(椭圆)等的任意一种。
实心型微载体的粒子径(μm)的优选为20～2000，更优选为40～ 1000，最优选为80～500。而多孔型微载体的粒子径(μm)的优选为 30～25000，更优选为60～12000，最优选为120～6000。若在此范围 内，可进一步提高细胞的增生量。
微载体的真比重无特别限制，但在搅拌微载体与培养基的同时进 行培养的一般方法中，颗粒优选为，在搅拌时浮游、停止搅拌则沉降 的颗粒。从该观点看，微载体的真比重(g/cm3)优选为1.00～1.10， 更优选为1.01～1.08，最优选为1.01～1.05。
可以从市场很容易地得到微载体，下列商品可供使用。
(1)聚苯乙烯制：Nalge Nunc公司制造的聚苯乙烯微载体(biosilon)、 赛贝公司制造的塑料微珠(Plastic beads)及びLux公司制造的 Cytosphere等。
(2)聚丙烯胺：Bio-Rod制造的Biocarrier等。
(3)聚氨酯制：INOAC制造的PUF等。
(4)纤维制：Biomaterial公司制造的Cellsnow等。
(5)葡聚糖制：Amersham Pharmacia制造的(Cytodex)等。
(6)玻璃制：Scott公司制造的SIRAN等。
载体含有，1个分子中至少有一个细胞粘附性最小氨基酸序列(X) 的聚肽(P)。因为含有聚肽(P)，所以不使用动物提取的材料也可以 实现高效率的病毒生产。
[细胞粘附性最小氨基酸序列]是指，具有被细胞的整合素受容体 (integrin receptor)所识别，细胞容易粘附于基材性质的最小氨基酸序 列。
从细胞的粘附观点看，聚肽(P)所含的细胞粘附性最小氨基酸序 列的个数为，在(P)1个分子中，优选为1～50，更优选为3～30，最 优选为4～20。
作为细胞粘附性最小氨基酸序列(X)，只要是可以作为粘附信号 工作的序列就可以使用。如可以使用株式会社永井出版发行的“病态 生理”Vol.9、No.7、1990年、527页记载的序列。其中，从容易粘附 的细胞种类多的观点来看，优选为Arg Gly Asp序列、Leu Asp Val序列、Leu Arg Glu序列、His Ala Val序列以及序列号(1)～ (8)所示的序列。更优选为Arg Gly Asp序列、His Ala Val序 列及序列号(7)所示的序列。最优选为Arg Gly Asp序列。
聚肽(P)除了含有细胞粘附性最小氨基酸序列(X)以外、从提 高(P)的热稳定性的观点出发，优选为具有辅助氨基酸序列(Y)。
作为辅助氨基酸序列(Y)，可使用除最小氨基酸序列(X)以外 的氨基酸序列，从提高(P)的热稳定性的观点出发，优选为具有Gly 以及/或Ala的序列。
辅助氨基酸序列(Y)包括，具有(Gly Ala)a序列、(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)b序列、(Gly Ala Gly Ala Gly Tyr)c序 列、(Gly Ala Gly Val Gly Tyr)d序列、(Gly Ala Gly Tyr Gly Val)e序列、{Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala}g序 列、(Gly Val Pro Gly Val)h序列、(Gly)i序列、(Ala)j序列、 (Gly Gly Ala)k序列、(Gly Val Gly Val Pro)m序列、(Gly Pro Pro)n序列、(Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly) o序列、(Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln)p序列以及/或(Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro)q序列的序列。其中 优选为，具有(Gly Ala)a序列、(Gly Ala Gly Ala Gly Ser) b序列、(Gly Ala Gly Ala Gly Tyr)c序列、(Gly Ala Gly Val Gly Tyr)d序列、(Gly Ala Gly Tyr Gly Val)e序列、{Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala}g序列、(Gly Val Pro Gly Val) h序列、(Gly Val Gly Val Pro)m序列以及/或(Gly Pro Pro) n序列的序列，更优选为具有(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)b序 列、(Gly Val Pro Gly Val)h序列、(Gly Val Gly Val Pro) m序列以及/或(Gly Pro Pro)n序列的序列，最优选为具有(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)b序列的序列。
其中，a为5～100的整数，b、c、d以及e为2～33的整数，f为 1～194的整数、g为{1}～{200/(6+f)}的去掉小数点位的整数、h 为2～40的整数、i以及j为10～200的整数、k为3～66的整数、m 为2～40的整数、n为3～66的整数、o为1～22的整数、p及q为1～ 13的整数。
辅助氨基酸序列(Y)优选为含甘氨酸(Gly)以及/或丙氨酸(Ala)。 含甘氨酸(Gly)以及丙氨酸(Ala)时，相对辅助氨基酸序列(Y)的 总氨基酸个数而言，其总含有率(％)优选为10～100，更优选为20～ 95。特优选为30～90，更优选为40～85。在此范围时，具有更好的耐 热性。
当甘氨酸(Gly)及丙氨酸(Ala)两者都含有时，其含有个数比 率(Gly/Ala)优选为0.03～40，更优选为0.08～13，最优选为0.2～5。 在此范围时，具有更好的耐热性。
从提高耐热性的观点出发，聚肽(P)中的辅助氨基酸序列(Y) 的含有个数，在(p)1个分子中，优选为2～51，更优选为3～35，最 优选为4～20。另外，聚肽(P)可含有两种以上的辅助氨基酸序列(Y)。
具有(Gly Ala)a序列的氨基酸序列，比如有序列号(9)～(11) 所示的氨基酸序列。
具有(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)b序列的氨基酸序列，比 如有序列号(12)～(14)所示的氨基酸序列。
具有(Gly Ala Gly Ala Glya Tyr)c序列的氨基酸序列，比 如有序列号(15)～(17)所示的氨基酸序列。
具有(Gly Ala Gly Val Gly Tyr)d序列的氨基酸序列，比 如有序列号(18)～(20)所示的氨基酸序列。
具有(Gly Ala Gly Tyr Gly Val)e序列的氨基酸序列，比 如有序列号(21)～(23)所示的氨基酸序列。
具有{Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala}g序列的氨基 酸序列，比如有序列号(24)～(26)所示的氨基酸序列。
具有(Gly Val Pro Gly Val)h序列的氨基酸序列，比如有序 列号(27)～(30)所示的氨基酸序列。
具有(Gly)i序列的氨基酸序列，比如有序列号(31)～(33) 所示的氨基酸序列。
具有(Ala)j序列的氨基酸序列，比如有序列号(34)～(36) 所示的氨基酸序列。
具有(Gly Gly Ala)k序列的氨基酸序列，比如有序列号(37)～ (39)所示的氨基酸序列。
具有(Gly Val Gly Val Pro)m序列的氨基酸序列，比如有 序列号(40)～(42)所示的氨基酸序列。
具有(Gly Pro Pro)n序列的氨基酸序列，比如有序列号(43)～ (45)所示的氨基酸序列。
具有(Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly)o序列 的氨基酸序列，比如有序列号(46)～(48)所示的氨基酸序列。
具有(Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln)p序列的氨基酸序列，比如有序列号(49)～ (51)所示的氨基酸序列。
具有(Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro)q序列的氨基酸序列，比如有序列号(52)～ (54)所示的氨基酸序列。
这些氨基酸序列中，优选为，序列号(9)、(10)、(12)、(13)、(14)、 (15)、(16)、(18)、(19)、(21)、(22)、(24)、(25)、(26)、(27)、 (28)、(30)、(31)、(32)、(34)、(35)、(37)、(38)、(40)、(41)、 (43)、(44)、(46)、(47)、(49)、(50)、(52)和(53)所示的氨基 酸序列，更优选为序列号(10)、(12)、(13)、(14)、(16)、(19)、(22)、 (26)、(27)、(28)、(29)、(30)、(32)、(35)、(38)、(41)、(44)、 (47)、(50)和(53)所示的氨基酸序列，最优选为序列号(12)、(13) 和(30)所示的氨基酸序列。
聚肽(P)可以含有分枝链，一部分也可以是架桥，也可含环状构 造。但是聚肽(P)优选为不被架桥，更优选为不架桥直链结构，最优 选为无环状构造不被架桥的直链构造。其中直线构造包括β构造(直 链肽弯曲，该部分相互平行排列，其间形成氢键的二次构造)。
从细胞粘附性及耐热性的观点出发，聚肽(P)优选为，具有最小 氨基酸序列(X)与辅助氨基酸序列(y)相交性化学结合的构造。此 时，最小氨基酸序列(X)与辅助氨基酸序列(y)的重复单位(X-Y) 的数量(个)，从细胞粘附性的观点出发，优选为1～50，更优选为2～ 40，特优选为3～30，最优选为4～20。
另，最小氨基酸序列(X)与辅助氨基酸序列(y)的重复单位(X -Y)的个数可以相同也可以不同。不同时，优选为任意一个的含有个 数比另一方的含有个数少一个{此时优选为，辅助氨基酸序列(X)的 个数少}。聚肽(P)中的最小氨基酸序列(X)与辅助氨基酸序列(Y) 的含有个数率(X/Y)，优选为0.66～1.5，更优选为0.9～1.4，最优选 为1～1.3。
另，聚肽(P)的末端部分(从最小氨基酸序列(X)或辅助氨基 酸序列(Y)到肽末端为止)可以含其它氨基酸。含其它氨基酸时，其 含量，在1个聚肽当中，优选为1～1000个，更优选为3～300，特优 选为10～100。
聚肽(P)的数均分子量(Mn)优选为1,000～1,000,000，更优选 为2,000～700,000，特优选为3,000～400,000，最优选为4,000～200,000。 其中，聚肽的数均分子量(Mn)是通过利用SDS-PAGE(SDS聚丙 烯胺胶滞体电泳)，分离测定试样(聚肽等)，将泳动距离与标准物质 比较的方法等公开的方法求得(以下相同)。
下面例示适合的聚肽(P)。
(1)最小氨基酸序列(X)为Arg Gly Asp序列(x1)时，
具有(x1)的13个与(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)9序列(13) (y1)的13个，这些个相交性化学结合而形成的构造的Mn约为11 万的聚肽(“PRONECTIN F”、PRONECTIN：注册商标(日本以及 美国)、三洋化成工业(株)制造，以下相同)；
具有(x1)的5个与(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)3序列(12) (y2)的5个，这些个相交性化学结合而形成的构造的Mn约为2万 的聚肽(“PRONECTIN F2”)；
具有(x1)的3个与(Gly Val Pro Gly Val)2 Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)3序列(30)(y3)的3个，这些个相交性 化学结合而形成的构造的Mn约为1万的聚肽(“PRONECTIN F3”)；
(2)最小氨基酸序列(X)为Ile Lys Val Ala Val序列(x2) 时，
将PRONECTIN F、PRONECTIN F2和PRONECTIN F3的Arg Gly Asp序列(x1)变换为Ile Lys Val Ala Val序列(7)(x2) 的“PRONECTIN L”、“PRONECTIN L2”和“PRONECTIN L3”等。
(3)最小氨基酸序列(X)为Tyr Ile Gly Ser Arg序列(x3) 时，
将PRONECTIN F、PRONECTIN F2和PRONECTIN F3的Arg Gly Asp序列(x1)变换为Tyr Ile Gly Ser Arg序列(x3)的 “PRONECTIN Y”、“PRONECTIN Y 2”和“PRONECTIN Y 3”等。
另，除了(1)～(3)的聚肽之外，宝酒造(株)制造的RetroNectin (recombinant human fibronectin CH-296){作为最小氨基酸序列(x) 含有Arg Gly Asp序列(X1)以及Leu Asp Val序列的Mn约为 6万的聚肽}和RGDS-Protein A{作为最小氨基酸序列(X)含有Arg Gly Asp序列(X1)的Mn约为3万的聚肽}也适合使用。{但，这 些聚肽不合辅助氨基酸序列(Y)，所以耐热性等不如上述的(1)～(3)。 该聚肽的氨基酸序列在特开平2-311498号中公开(本发明参照了 US5198423A的公开内容)。}
聚肽(P)的制造方法无特殊限制，可用现有已知的肽合成方法。 例如，可利用有机合成方法(固相合成法、液相合成法等)以及生物 化学合成法(转基因微生物(酵母、细菌、大肠菌等))等合成。有机 合成方法例如可以使用日本生化学学会编“续生化学实验讲座2，蛋白 质的化学(下)”第641～694页(昭和62年5月20日；株式会社东 京化学同人发行)所记载的方法等。生物化学的合成方法例如可以使 用特表平3-502935号公报(本发明中引用了US5243038A、 US5496712A、US55 14581A、US5606019A、US5641648A、US5723588A、 US5770697A、US5773249A、US5808012A、US5830713A、US6018030A、 US6140072A、US6184348B1、US6355776B1、US6380154B1、 US2003083464A1以及US2003176355A1的公开内容。)记载的方法等。 从容易合成高分子聚肽(P)的角度，优选为利用转基因微生物的生物 化学合成方法，更优选为使用转基因大肠菌的合成方法。
载体含有聚肽(P)时，(P)只要被含在载体的表面即可，(P)通 过化学结合(离子结合、氢结合以及/或共价结合)以及/或物理吸附(通 过范德华力的吸附)，结合在载体表面。其中，优选为化学结合，更优 选为共价结合。
可通过现有公开的方法，进行将聚肽(P)共价结合于载体的反应。 例如有，“肽合成的基础与实验，平成9年10月5日，丸善株式会社 发行”所记载的方法，具体如下(1)～(3)所述。
(1)将含1级氨基或2级氨基的聚肽与不含聚肽(P)的载体(以 下称为，未含P载体)中的具有羧基的载体相互反应时，预先将未含P 载体的羧基与碳化二亚胺化合物反应得到戊基异尿素{R’-N＝C (OCOR)-NH-R’(-OCOR为来自载体的部分)}之后，通过向该 戊基异尿素添加含1级氨基或2级氨基的聚肽，可以将未含P载体和 聚肽进行酰胺结合。
碳化二亚胺化合物有N，N’-二环己基碳化二亚胺以及1-乙基-3 -(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐等。
(2)将含1级氨基或2级氨基的聚肽与未含P载体中的具有羟基 的载体相互反应时，预先将未含P载体的羟基与羰酰二咪唑化合物反 应得到咪唑衍生物(R-Im，Im为咪唑环、R为来自载体的部分}之后， 通过向该咪唑衍生物添加含1级氨基或2级氨基的聚肽，可以将未含P 载体和聚肽进行N-C结合。
羰酰二咪唑化合物有N，N’-羰酰二咪唑等。
(3)将含羟基的聚肽与未含P载体中的具有羧基的载体相互反应 时，预先将未含P载体的羧基与碳化二亚胺化合物反应得到酰基异尿 素之后，通过向该酰基异尿素添加含羟基的聚肽，可以将未含P载体 和聚肽进行N-C结合。
向未含P载体物理吸附、离子结合以及/或氢结合聚肽的方法有， 向溶剂加入聚肽和未含P载体进行混合制作的方法等。溶剂没有特殊 限制，除了水(自来水、离子交换水、蒸馏水以及进行离子交换的蒸 馏水等)之外，还可以使用含有无机盐、有机酸盐、酸以及/或碱基的 水溶液(例如特开2003-189848)等。无机盐、有机酸盐、酸以及碱 基的含量(重量％)以水溶液的重量为基准，优选为0.001～50，更优 选为0.005～30，最优选为0.01～10。
这些溶剂中，优选为含有无机盐、酸以及/或碱基的水溶液和水， 更优选为含有无机盐、酸以及/或碱基的水溶液和进行离子交换的蒸馏 水，最优选为含有无机盐、酸以及/或碱基的水溶液。
载体含有聚肽(P)时，聚肽(P)的含量(μg/cm2)为，载体平 均表面积每1cm2中，优选为0.0001～100000，更优选为0.001～10000， 最优选为0.01～1000。在此范围时，细胞培养的效率会更高。
聚肽(P)的含量可如下求得。
(1)载体的单位重量的聚肽(P)的含量(μg/g)，例如可通过免 疫学的测定方法(记载于特开2004-049921等)测定。即，将载体和， 与聚肽(P)结合的、标记了酶的抗体(以下简称为酶标记抗体1)反 应，通过测定酶标记抗体1的酶量来测定单位重量的聚肽(P)的含量。
(2)接着，用表面形状测定显微镜{利用共焦点原理的3D形状 测定显微镜，例如使用KEYENCE(株)公司制造的VK-9500}测定用粘 接剂等固定于载片玻璃的载体(以下称为固定载体)的上部表面(例 如，20μm×20μm)，得到表面形状的三维数据。从该三维数据求得 去除全部细孔(直径1μm未满)部分(作为平坦表面补入)、具有凸 缘(垄)等的载体的部分表面积(A)。另外，从表面形状三维数据求 得去除全部细孔(直径1μm未满)以及凸缘(垄)等(作为平坦表面 补入)、扁平表面的载体的部分表面积(B)。接着对9个载体的三维数 据进行同样的测定，求得载体的部分表面积(A)以及载体的部分表面 积(B)。然后算出10个载体的具有凸缘(垄)等的载体的部分表面积 (A)的平均部分表面积(HA)以及扁平表面的载体的部分表面积(B) 的平均部分表面积(HB)。
当载体为球状时，由公式{单位重量的平均表面积(Gm2/g)＝[4 ×π×(ra/2/10000)2]/[4/3×π×(ra/2/10000)3×d]×[(HA)/ (HB)]}算出载体的单位重量的平均表面积。其中，ra为载体的粒子径， d为载体的真比重。
若是不能用上述方法计算的非球状载体(棒状、长方体、板状等) 或者多孔载体时，载体单位重量的平均表面积，可以如下算出。
使用比表面积仪(例如，QUANTASORB(Yuasa Ionics公司制造)) 测定载体的表面积(测定气体；He/Kr＝99.9/0.1体积比，检测气体； 氮气)，由公式{载体的表面积/载体的重量}算出载体单位重量的平均 表面积(cm2/g)。
(3)用单位重量的平均表面积(cm2/g)除单位重量中的聚肽(P) 的含量(μg/g)计算出载体的平均表面积每1cm2中的含量(μg/cm2)。
细胞分散剂是指在继代培养时使用的不含来源于动物的物质的细 胞分散剂，使用其目的是为了将细胞从载体剥落。细胞分散剂有螯合 剂(EDTA等)、2～30℃的无血清培养基、植物提取的蛋白质分解酶(木 瓜酶)、转基因微生物提取的蛋白质分解酶(胰蛋白酶类似酶(Invitrogen 公司制造的rProtease等))以及它们的组合物等。其中，从细胞从载体 的剥落性能出发，优选为植物提取的蛋白质分解酶、转基因微生物提 取的蛋白质分解酶以及它们的组合物等。更优选为转基因微生物提取 的蛋白质分解酶。
本发明的病毒生产方法是通过，将粘性细胞粘附于不含来源于动 物的物质的载体，在不含来源于动物的物质的培养基中培养该粘性细 胞，再用不含来源于动物的物质的细胞分散剂对已培养的粘性细胞进 行继代培养后，向粘性细胞接种病毒增生而可以大量生产病毒。
用于细胞接种的粘性细胞的培养(以下称为预培养)无特别限制， 含来源于动物的物质的材料(载体、培养基以及细胞分散剂等)或不 含来源于动物的物质的材料(载体、培养基以及细胞分散剂等)都可 使用。但优选为，在预培养中也只使用不含来源于动物的物质的材料 (载体、培养基以及细胞分散剂等)。
向载体粘附从预培养得到的粘性细胞的方法为通常的方法即可， 向培养基以及载体进行细胞接种等都适用。
粘性细胞的接种量(万个/cm2)虽然取决于粘性细胞的种类等，但 在载体的平均表面积每1cm2中，优选为0.001～1000，更优选为0.01～ 100，最优选为0.1～10。粘性细胞的个数测定方法无特殊限定，例如 可用Wezel的利用结晶紫(Crystal Violet)的细胞核计数法测定细 胞核数。另，培养基的细胞密度(万个/mL)在培养基每1mL中，优选 为0.01～10000，再优选为0.1～1000，更优选为1～100，特优选为5～ 50，最优选为10～30。
粘性细胞的培养时间(天)优选为3～30，，再优选为4～21，更 优选为5～15，特优选为6～10，最优选为7或8。虽然根据粘性细胞 的种类等而有所不同，但培养8天后，培养基的细胞密度比培养开始 时增加3～30倍左右。
培养基的更换优选为每1～5天更换1/3～全部培养基。
培养中的二氧化碳浓度(体积％)是，以培养气氛的体积为基础， 优选为2～10，更优选为4～6，最优选为5。
培养温度(℃)优选为25～42，再优选为30～40，更优选为35～ 39，最优选为37。
载体为微载体时(粒子径：20～500μm、表面积：100cm2～100m2等)，可使用的培养容器有：(1)可旋烧瓶或容器、(2)径流式反应器 等。
(1)使用可旋烧瓶或容器等时，适合使用的方法例如有，向培养 容器(容量：100mL～100L等)中，加入粘性细胞、微载体以及培养 基，边搅拌边培养的方法。
(2)使用径流式反应器等时，适合使用的方法例如有，将微载体 设置于培养容器(容量：100mL～100L等)后，对含粘性细胞的培养 基进行边循环边培养的方法。
另，载体为空心光纤(内径为10～500μm等)时，适合使用的方 法例如有，向筒(cartridge)(容量：100mL～100L等)等加入含粘性 细胞的培养基后，将培养基在空心光纤内边循环边培养的方法。
另，载体为细胞培养滚瓶(总容量：0.1～20L等)时，适合使用 的方法例如有，加入含粘性细胞的培养基后，边搅拌边培养的方法。
使用细胞分散剂的继代培养是指，通过细胞分散剂，将如上所述 通过培养而得到的粘性细胞制成细胞分散液之后，使用该细胞分散液 再次进行附着性细胞的培养。
向粘性细胞的培养细胞接种病毒的时间是，从粘性细胞的培养开 始后，优选为第3～30天，再优选为第4～21天，再优选为第5～15 天，更优选为第6～10天，最优选为第7或8天。
另，病毒接种时的培养细胞的细胞密度(万个/mL)优选为0.2～ 200000，再优选为2～20000，更优选为20～2000，特优选为100～1000， 最优选为200～500。
在病毒接种之前，优选为用无血清培养基进行培养基更换，更优 选为去除细胞培养的培养基，加入PBS(0.02M磷酸缓冲液等)以及/ 或无血清培养基搅拌1分钟～1小时后，去除加入的PBS以及/或无血 清培养基，添加无血清培养基。
该无血清培养基优选为与细胞培养时使用的相同。
该无血清培养基可含有细胞分散剂，也可以不含。流感病毒等时， 优选为无血清培养基含有细胞分散剂。当无血清培养基含有细胞分散 剂时，其含量(体积％)是以无血清培养基的体积为基础，优选为0.5～ 40，更优选为1～20，最优选为2～10。
病毒接种时的M.O.I(感染多重度)虽取决于细胞和病毒的种类， 但优选为1～0.0000001，更优选为0.～0.00001，最优选为0.05～0.0001。
病毒的培养时间(增生时间：天)优选为2～14，更优选为3～10。
病毒的培养温度(增生温度：℃)优选为30～39，更优选为32～ 38，最优选为33～37。
培养基的pH值应限定于一定的范围，其范围优选为6～9，更优 选为6.5～8.5，最优选为7～8。
可用本发明的病毒生产方法制得的疫苗虽无特殊限定，但优选为 日本脑炎疫苗、登革热疫苗、西尼罗河热病毒疫苗、流感疫苗、狂犬 病疫苗、水痘疫苗、小儿麻痹疫苗、A型肝炎疫苗、麻疹疫苗、风疹 疫苗以及流行性腮腺炎疫苗，更优选为日本脑炎疫苗、登革热疫苗、 西尼罗河热病毒疫苗、流感疫苗、小儿麻痹疫苗、麻疹疫苗、风疹疫 苗以及流行性腮腺炎疫苗，特优选为流感疫苗、风疹疫苗以及流行性 腮腺炎疫苗，最优选为流感疫苗。
根据本发明的方法，在细胞培养以及病毒生产的过程中，全部使 用不含来源于动物的物质的培养材料，所以能够大量培养安全且品质 有保证的病毒。而且具有可以最低限度控制外来性物质而被污染的可 能性，并且由于不含未知的感染性因子，所以具有无需进行感染因子 的钝化处理等优点。
本发明并不局限于上述记载内容，可以在本发明的主旨范围内进 行各种各样的变样实施。
下面，参照实施例以及附图对本发明进行详细说明，但本发明并 不局限于这些实施例。
<为获得细胞接种所用的粘性细胞的培养>
将在Dulbecco′s minimum essential medium(DMEM)培养基+5体积 ％牛胎儿血清(FBS)(Invitrogen公司制造)中预培养的Vero细胞， 用根据需要被PBS稀释的细胞分散剂(Invitrogen公司制造、rProtease (注册商标))稀释液在37℃的条件下进行分散，通过离心作业去除上 清液得到细胞接种用的Vero细胞(S)。
实施例1
<使用无血清蛋白培养基和PRONECTIN F结合尼龙微珠的日本 脑炎病毒的生产>
(1)用磷酸缓冲液(PBS)将PRONECTIN F稀释为PRONECTIN F浓度为300μg/ml的溶液。向水容性碳化二亚胺溶液{1-乙基-3 -(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺氢氯化物、多金多(株)公司 制造、300mM水溶液}100ml添加50g的12尼龙微珠(粒子径150～ 250μm、TRIAL株式会社制造)，用搅拌棒搅拌2小时后，进行5次 向其添加磷酸缓冲液(pH＝7.2)100ml，吸引去除溶液的操作(洗净) 得到碳化二亚胺结合尼龙微珠(1)。接着将该碳化二亚胺结合尼龙微 珠(1)浸泡于PRONECTIN F溶液100ml中搅拌2小时，进行3次添 加磷酸缓冲液(pH＝7.2)100ml，吸引去除溶液的操作(洗净)后， 在氨水溶液(300mM、100ml)中搅拌2小时。随后进行进行3次添加 离子交换水100ml，吸引去除溶液的操作(洗净)，接着在100℃热风 下进行60分钟干燥得到PRONECTIN F结合尼龙微珠(PRONECTIN F的 结合量：0.3μg/cm2)。
(2)将不含来源于动物的物质的无血清培养基(Invitrogen公司 制造、VP-SFM)和由不含来源于动物的物质的PRONECTIN F结合 尼龙微珠形成的试样4放入可旋烧瓶(Techne公司制造、F7689)。
接着，以细胞接种用Vero细胞(S)的细胞密度呈2×105cells/mL 接种到加有试样4的可旋烧瓶，运转容量(M)为100mL。然后将加 有细胞、培养基以及微载体的培养液在25rpm下搅拌、将细胞粘附到 微载体之后，在37℃的恒温室中使用磁力搅拌器(Techne公司制造、 MCS-104L)、搅拌回转数为25rpm～35rpm的条件下培养24天。
每8天进行细胞继代，从细胞接种的第3天开始每天更换50体积 ％的培养基。其中，用由PBS5倍稀释的不含来源于动物的物质的细胞 分散剂(Invitrogen公司，rProtease(注册商标))的稀释液，在37℃条 件下进行细胞分散，通过离心作业去除上清液之后，以需要量向预先 准备的可旋烧瓶接种，进行继代培养。
试样4随时间变化的细胞密度是通过一般的血球计数法及显微镜 观察法求得。图1所示为纵轴为细胞密度(cells/mL)、横轴为时间的 示意图。
细胞培养开始后第24天，去除可旋烧瓶内的培养液，进行2次用 PBS的洗净之后，以M.O.I＝0.01接种日本脑炎病毒，在3 7℃恒温室 中，回转数35rpm的条件下进行了培养。JEV培养的第2天向可旋烧瓶 分别添加1.5mL的7.5体积％的碳酸氢钠，pH值调节成7.2。
取样进行到JEV培养的第2～8天，细胞数是进行柠檬酸处理后测 定的核数。JEV增生的指标(1)HA(红血球凝集反应、Hemagglutination) 价是遵循通用法则进行测定、(2)ELISA(霉抗体法、Enzyme-linked immunosorbent assay)是，对抗JEV抗血清进行利用蛋白质A柱的抗 体提纯，通过Western Blotting法确认特异反应性后，进行了纯化抗体 的过氧物酶标记，构造了夹层ELISA。其中，ELISA值是参照日本脑 炎疫苗北京株Lot.197-P，付于其值，钝化提纯JEV液作为标准抗原 使用。图2所示为ELISA的病毒生产量随时间变化的趋势图，图3所 示为通过HA的病毒生产量随时间变化的趋势图。另，表1所示为 ELISA以及HA测定值的最高值。
表1
病毒接种时的细胞数 (×106cells/mL) HA ELISA (U/mL) 试样1 1.6 256 1949 试样2 3 128 1087 试样3 2.4 64 626 试样4 3 512 2367
比较例1
<使用血清培养基和葡聚糖微珠(Amersham公司制造、商品名 Cytodexl)的日本脑炎病毒的生产>
除代替实施例1中的试样4使用试样1{血清培养基(DMEM培 养基+5体积％FBS)和不含来源于动物的物质的葡聚糖微珠}之外， 与实施例1相同的条件进行了病毒的生产。
比较例2
<使用无血清培养基和葡聚糖微珠(Amersham公司制造、商品名 Cytodexl)的日本脑炎病毒的生产>
除代替实施例1中的试样4使用试样2{不含来源于动物的物质的 无血清培养基(Invitrogen公司制造、VP-SFM)和不含来源于动物的 物质的葡聚糖微珠}之外，与实施例1相同的条件进行了病毒的生产。
比较例3
<使用无血清培养基和被改性猪胶原蛋白覆盖的葡聚糖微珠 (Amersham公司制造、商品名Cytodex 3)的日本脑炎病毒的生产>
除代替实施例1中的试样4使用试样3{不含来源于动物的物质的 无血清培养基(Invitrogen公司制造、VP-SFM)和被改性猪胶原蛋白 覆盖的葡聚糖微珠}之外，与实施例1相同的条件进行了病毒的生产。
对比较例1～3进行了与实施例1相同的测定，病毒接种时的细胞 数和ELISA以及HA测定值的最高值在表1表示，细胞密度-时间的 趋势图在图2中表示，ELISA Titer-日数的趋势图在图2中表示，HA Titer-日数的趋势图在图3中表示。
如图1以及表1所示，在实施例1(试样4)中，培养开始的第8、 16以及第24天的细胞密度为最高，与比较例1(试样1)、比较例2(试 样2)、比较例3(试样3)相比，其增生稳定且效率高。
另，从图2、图3以及表1可看出，实施例1(试样4)的ELISA 以及HA的数值都比比较例1(试样1)、比较例2(试样2)和比较例 3(试样3)高，进而判断出其日本脑炎病毒的增生效率高。
实施例2
<使用无血清蛋白培养基和PRONECTIN F结合尼龙微珠的流感病 毒的生产>
将VP-SFM培养基和由PRONECTIN F结合尼龙微珠形成的试样8 放入可旋烧瓶(Techne公司制造、F7689)。
接着，以细胞接种用Vero细胞(S)的细胞密度呈2×105cells/mL 接种到加有上述试样8的可旋烧瓶，运转容量(M)为100mL。然后 将加有细胞、培养基以及微载体的培养液在35rpm下搅拌、将细胞粘 附到微载体之后，在37℃的恒温室中使用磁力搅拌器(和研药社制造、 MODEL1104M)，搅拌回转数为35rpm的条件下培养了24天。
每8天进行细胞继代，从细胞接种的第3天开始每天更换50体积 ％的培养基。在37℃条件下，对在细胞继代培养时使用的rProtease 进行细胞分散，通过离心作业去除上清液之后，以需要量向预先准备 的可旋烧瓶接种，进行继代培养。
细胞洗净操作是在细胞培养开始的第24天，将可旋烧瓶的搅拌停 止之后，去除培养液，加入50mL的PBS，在33℃恒温室搅拌20分钟。 接着在相同条件下在VP-SFM培养基中进行了细胞洗净操作。然后， 去除VP-SFM培养基，再重新向可旋烧瓶加入新的VP-SFM培养基使 其容量达到95mL。向该可旋烧瓶添加5mL的rProtease，接种流感病 毒(B/Johannesburg/5/99)以使M.O.I＝0.001。流感病毒在33℃恒温室 中，回转数35rpm的条件下，放松可旋烧瓶的盖子，进行了培养。培 养基的pH值用7.5体积％的碳酸氢钠维持在pH7.2～pH7.8(培养流感 病菌18小时后添加0.4mL的7.5体积％的碳酸氢钠，在42小时后同 样地添加了0.6mL)。流感病毒培养的67小时后进行取样，以使用鸡 红血球的HA法为流感病毒增生的指标的结果，HA变为128倍。
实施例3
<使用无血清蛋白培养基和PRONECTIN F2结合尼龙微珠的流感 病毒的生产>
除代替实施例2中的PRONECTIN F结合尼龙微珠使用 PRONECTIN F2结合尼龙微珠{PRONECTIN F2的结合量：0.3μg/cm2(代替PRONECTIN F使用PRONECTIN F2之外，制造方法与制造 PRONECTIN F结合尼龙微珠相同)}之外，与实施例2相同的条件进 行了病毒的生产。与实施例2相同的方法得到的HA为128倍。
实施例4
<使用无血清蛋白培养基和PRONECTIN F3结合尼龙微珠的流感 病毒的生产>
除代替实施例2中的PRONECTIN F结合尼龙微珠使用 PRONECTIN F3结合尼龙微珠{PRONECTIN F3的结合量：0.2μg/cm2(代替PRONECTIN F使用PRONECTIN F2之外，制造方法与制造 PRONECTIN F结合尼龙微珠相同)}之外，与实施例2相同的条件进 行了病毒的生产。与实施例2相同的方法得到的HA为128倍。
比较例4
<使用血清培养基和葡聚糖微珠(Amersham公司制造、商品名 Cytodexl)的流感病毒的生产>
除代替实施例2中的试样8使用试样5{血清培养基(DMEM培 养基+5体积％FBS)和不含来源于动物的物质的葡聚糖微珠}之外， 与实施例2相同的条件进行了病毒的生产。与实施例2相同的方法得 到的HA为32倍。
比较例5
<使用无血清培养基和葡聚糖微珠(Amersham公司制造、商品名 Cytodexl)的流感病毒的生产>
除代替实施例2中的试样8使用试样6{不含来源于动物的物质的 无血清培养基(Invitrogen公司制造、VP-SFM)与不含来源于动物的 物质的葡聚糖微珠}之外，与实施例2相同的条件进行了病毒的生产。 与实施例2相同的方法得到的HA为4倍。
比较例6
<使用无血清培养基和被改性猪胶原蛋白覆盖的葡聚糖微珠 (Amersham公司制造、商品名Cytodex 3)的流感病毒的生产>
除代替实施例2中的试样8使用试样7{不含来源于动物的物质的 无血清培养基(Invitrogen公司制造、VP-SFM)和被改性猪胶原蛋白 覆盖的葡聚糖微珠}之外，与实施例2相同的条件进行了病毒的生产。 与实施例2相同的方法得到的HA为4倍。
在实施例2、实施例3、实施例4中、相对于比较例4、比较例5 及比较例6，其HA的值非常高，流感病毒以极高的效率增生。